В настоящем документе подробно описано, как использовать непрерывный поток гипоксии камеры для создания атмосферы с определенной концентрации O 2, Чтобы понять биологические реакции со снижением O 2. Эта система проста в установке и обслуживании, и достаточно гибкой, чтобы удовлетворить широкий спектр O 2 Концентрациях и модельных системах
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Создание определяемых газообразных сред для изучения влияния гипоксии на
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Кислород необходим для выживания всех многоклеточных животных, за одним известным исключением1. Снижение доступности O2 (гипоксия) может возникать при патологических состояниях, в процессе нормального развития или при изменении условий окружающей среды2-5. Понимание клеточных сигнальных путей, участвующих в ответе на гипоксию, может дать новое представление о стратегиях лечения различных патологий человека, от инсульта до рака. Достижение этой цели было затруднено, по крайней мере частично, техническими сложностями, связанными с контролируемым воздействием гипоксии на генетически модифицируемые модельные организмы.
Нематода Caenorhabditis elegans идеально подходит в качестве модельного организма для изучения гипоксического ответа, так как она легко культивируется и поддается генетическим манипуляциям. Более того, можно изучать клеточные ответы на конкретные концентрации O2 при гипоксии без побочных эффектов, поскольку C. elegans получает O2 (и другие газы) путем диффузии, в отличие от организмов с развитой дыхательной системой6. Факторы, участвующие в ответе на гипоксию, консервативны у C. elegans. Фактический ответ на гипоксию зависит от доступной конкретной концентрации O2. У C. elegans воздействие умеренной гипоксии вызывает транскрипционный ответ, опосредованный главным образом hif-1, высококонсервативным гипоксия-индуцируемым фактором транскрипции6-9. Эмбрионам C. elegans необходим hif-1 для выживания при 5,000-20,000 ppm O27,10. Гипоксия — это общий термин, означающий «содержание O2 ниже нормы». Нормоксию (нормальное содержание O2) также бывает трудно определить. Обычно мы считаем нормоксией комнатный воздух, в котором содержится 210,000 ppm O2. Однако было показано, что C. elegans имеет поведенческое предпочтение к концентрациям O2 от 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. У личинок и взрослых особей hif-1 предотвращает индуцированную гипоксией диапаузу при 5,000 ppm O212. Однако hif-1 не играет роли в ответе на более низкие концентрации O2 (аноксия, операционное определение <10 ppm O2)13. При аноксии C. elegans переходит в обратимое состояние анабиоза, при котором прекращается всякая микроскопически наблюдаемая активность10. Тот факт, что при различных условиях возникают разные физиологические ответы, подчеркивает важность экспериментального контроля за гипоксической концентрацией O2.
Здесь мы представляем метод конструирования и применения экологических камер, создающих надежные и воспроизводимые условия гипоксии с заданными концентрациями O2. Метод непрерывного потока обеспечивает быструю эквилибрацию камеры и повышает стабильность системы. Кроме того, прозрачность и доступность камер позволяют напрямую визуализировать животных, подвергающихся воздействию гипоксии. Далее мы демонстрируем эффективный метод быстрого сбора образцов C. elegans после воздействия гипоксии, что необходимо для наблюдения за многими быстрообратимыми изменениями, возникающими при гипоксии10,14. Данный метод создает базовую основу, которую можно легко модифицировать под индивидуальные потребности лаборатории, включая использование различных модельных систем и разнообразных газов.
Протокол
1. Строительство экологической палаты
- Выберите наименьший разумный объем камеры, необходимые для сферы вашего проекта. Палата должна быть изготовлена из газов (O 2) непроницаемый материал. Pyrex кристаллизации блюда, Anaeropack коробки или большие литые акриловые коробки (Ellard Instrumentation), могут быть использованы. Мы обнаружили, что 9 50 мм пластин может поместиться в 100 х 50 KIMEX блюдо кристаллизации. Стеклянные пластины можно использовать в качестве крышки для посуды Pyrex кристаллизации.
- Просверлите отверстие в выбранной камере и установить с пластиковой мужчина Luer для штуцером для шланга установки (Cole Parmer). Фурнит....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот метод представляет собой стратегию построения гипоксическая среда, которая позволяет для сред с точной концентрацией кислорода, который ведется в лаборатории. Эти камеры обеспечивают простой метод для раскрытия организмов к конкретным низкой концентрации O 2 и мониторинга молекулярные и физиологические результаты. Экологические камеры описана собрана в лаборатории, а не промышленно и могут быть изменены таким образом, чтобы соответствовать потребностям эксперимента.
Одно неос.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы благодарим членов Миллер лаборатории для обсуждения и критического чтения рукописи. Эта работа была поддержана новая награда исследователя из Центра Натан Шок передового опыта в области фундаментальной биологии старения в DLM и Национального института здоровья награду R00 AG030550 к DLM.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | |
| Трубы (FEP и PTFE) | Коул Parmer Tygon | YO-95821-00 (1/8 "FEP) 06605-27 (1/16 х 1/8 "PTFE)" R-3603 | |
| Компрессионные фитинги | Сиэтл Fluid Systems | 06363-58 (М. муфта 1/16 ") 06363-62 (Ф. муфта 1/16 ") 06363-60 (М. муфта 1/8 ") 06363-61 (Ф. муфта 1/8 ") | |
| Поток трубы | Ольборг | PMR3-010 073 (3 выхода) PMR1-013520 (1 выход) | |
| Контроллера массового расхода | Сьерра-инструменты | 810S-L-DR-2-О.В.1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-ДД-2-О.В.1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) | |
| Сжатый газ бак | Airgas | Сделанный на заказ | |
| Пластиковые мужчины Luer для арматуры штуцером для шланга | Коул Parmer | 45505-41 (серии 500, 1/16 ") | |
| Литой акриловый коробки | Ellard приборостроения | Сделано на заказ | |
| Трубопроводная арматура (латунь или нержавеющая сталь) | Сиэтл Fluid Systems | B-402-1 (1/4 "гайка) B-200-3 (1/8 "Союз тройник) B-400-набор (1/4 "наконечники) B-QM2-B1-200 (QM Тело КК) B-200-1-2 (1/8 х 1/8 "мужской сопп) | |
| Dow Corning Вакуумная смазка | Sigma-Aldrich | Z273554 | |
| AnaeroPack окне | Misubishi газа Chemical Company | R684004 (0,4 л) R685025 (2,5 л) R685070 (7,0 л) | |
| Pyrex газа мыть бутылки | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 мл) CLS31770250C (250 мл) CLS31770125C (125 мл) | |
| Пальмитиновая кислота | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Антимышиного IgG с пероксидазой хрена | Южно биотехнологии Associates | 1032-05 | |
| SuperSignal Запад Pico Chemiluminsecent основания | Пирс Химическая | 34077 | |
| 100 х 50 блюд кристаллизации стекла | Kimax Кимбл | 23000 |
Ссылки
- Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30(2010).
- Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Ce....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
