Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Высокая пропускная способность Single-камеру и несколько клеток микро-инкапсуляции

18K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4096

⸱

15 июня 2012 г.

 , 
1Department of Mechanical Engineering, Vanderbilt University

В этой статье

Краткое содержание

Объединение монодисперсных падение поколения с инерционным порядком клеток и частиц, описывается метод инкапсуляции нужное количество клеток или частиц в одной капле в кГц ставки. Мы демонстрируем эффективность в два раза превышающие неупорядоченных инкапсуляции для одно-и двух-частиц падает.

Аннотация

Методы микрофлюидного инкапсулирования ранее использовались для захвата клеток в водных монодисперсных каплях пиколитрового объема, что обеспечивало их изоляцию от объемной жидкой среды и находило применение в высокопроизводительном скрининге, цитометрии и масс-спектрометрии. Мы описываем метод, который позволяет не только инкапсулировать одиночные клетки, но и многократно захватывать определенное количество клеток (в данной работе продемонстрировано инкапсулирование одной и двух клеток) для изучения как изоляции, так и взаимодействий между клетками в группах контролируемого размера. Сочетая методы генерации капель с упорядочиванием клеток и частиц, мы демонстрируем контролируемое инкапсулирование частиц клеточного размера для эффективного непрерывного процесса. Используя водную суспензию частиц и несмешивающееся фторсодержащее масло, мы генерируем водные капли в масле с помощью сопла с фокусировкой потока. Скорость водного потока достаточно высока, чтобы создать упорядочивание частиц, которые поступают в сопло с частотой, кратной частоте генерации капель, что обеспечивает инкапсулирование контролируемого количества клеток в каждой капле. В качестве репрезентативных результатов используются полистирольные частицы размером 9.9 μm в качестве имитаторов клеток. Данное исследование показывает эффективность инкапсулирования одной частицы Pk=1 83.7% и эффективность инкапсулирования двух частиц Pk=2 79.5% по сравнению с соответствующими значениями распределения Пуассона 39.3% и 33.3% соответственно. Продемонстрировано, что поддержание постоянной концентрации клеток и частиц имеет большое значение для эффективной инкапсуляции; также рассмотрены переходы от режима капельного к струйному образованию.

Введение

Постоянные водные клеточные суспензии в среде имеют общую жидкую среду, что позволяет клеткам взаимодействовать параллельно, а также гомогенизирует эффекты отдельных клеток при измерениях в этой среде. Высокопроизводительное инкапсулирование клеток в капли пиколитрового объема ограничивает образцы, защищая капли от перекрестного загрязнения, обеспечивая возможность оценки клеточного разнообразия внутри образцов, предотвращая разбавление реагентов и экспрессируемых биомаркеров, а также усиливая сигналы от продуктов биореактора. Капли также предоставляют возможность повторного слияния капель в более крупные водные образцы или с другими каплями для изучения межклеточной сигнализации.1,2 Снижение степени разбавления означает более сильные сигналы детекции для повышения точности измерений, а также возможность сократить объемы потенциально дорогостоящих образцов и реагентов.3 Инкапсулирование клеток в капли использовалось для улучшения детекции экспрессии белков,4 антител,5,6 ферментов,7 и метаболической активности8 при высокопроизводительном скрининге, а также может быть использовано для совершенствования высокопроизводительной цитометрии.9 В дополнительных исследованиях представлены возможности применения биоэлектрораспыления капель, содержащих клетки, для масс-спектрометрии10 и направленного нанесения клеточных покрытий на поверхность.11 Однако некоторые области применения были ограничены отсутствием возможности контролировать количество клеток, инкапсулированных в каплях. Здесь мы представляем метод упорядоченного инкапсулирования12, который повышает продемонстрированную эффективность инкапсулирования одной и двух клеток и может быть экстраполирован на инкапсулирование большего количества клеток.

Для получения монодисперсных капель в микрофлюидике используется метод «фокусировки потока», который позволяет создавать капли одного флюида (водной смеси с клетками) определенного размера внутри другого (непрерывной масляной фазы) с помощью сопла, в котором сходятся потоки.13 При заданной геометрии сопла частота генерации капель f и размер капель могут быть изменены путем регулирования скоростей потоков масла и водной фазы Qoil и Qaq. При увеличении скоростей потока может произойти переход от генерации капель к нестабильному струйному режиму вытекания водного флюида из сопла.14

Когда водный раствор содержит взвешенные частицы, на сопле частицы инкапсулируются и изолируются друг от друга. При генерации капель с использованием случайно распределенной водной суспензии клеток средняя доля капель Dk, содержащих k клеток, определяется статистикой Пуассона, где Dk = λk exp(-λ)/(k!) и λ — среднее количество клеток на одну каплю. Доля клеток, оказывающихся в «правильно» инкапсулированных каплях, рассчитывается по формуле Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk'). Тонкое различие между этими двумя показателями заключается в том, что Dk относится к использованию водной фазы и объему сортировки капель, которую необходимо провести после инкапсуляции, а Pk относится к степени использования образца клеток. Например, можно использовать разбавленную суспензию клеток (низкое λ) для инкапсуляции капель, в которых большинство капель с клетками содержат только одну клетку. В этом случае показатель эффективности Pk будет высоким, но большинство капель окажутся пустыми (низкое Dk), что потребует механизма сортировки для удаления пустых капель, что также снизит пропускную способность.15

Сочетание генерации капель с инерционным упорядочиванием позволяет инкапсулировать капли с более предсказуемым количеством клеток на каплю и более высокой пропускной способностью, чем при случайной инкапсуляции. Инерционная фокусировка была впервые обнаружена Сегре и Зильбербергом16 и представляет собой тенденцию частиц конечного размера мигрировать в боковые равновесные положения в потоке в канале. Инерционное упорядочивание относится к тенденции частиц и клеток пассивно организовываться в равноудаленные, шахматные цепочки с постоянной скоростью. Как фокусировка, так и упорядочивание требуют достаточно высоких скоростей потока (высокое число Рейнольдса) и размеров частиц (высокое число Рейнольдса для частиц).17,18 Здесь число Рейнольдса Re =uDh/ν и число Рейнольдса для частиц Rep =Re(a/Dh)2, где u — характерная скорость потока, Dh [=2wh/(w+h)] — гидравлический диаметр, ν — кинематическая вязкость, a — диаметр частицы, w — ширина канала, а h — высота канала. Эмпирически установлено, что длина, необходимая для формирования полностью упорядоченных цепочек, уменьшается при увеличении Re и Rep. Следует отметить, что требования к высоким Re и Rep (для данного исследования порядка 5 и 0,5 соответственно) могут противоречить необходимости поддерживать низкую скорость водного потока во избежание струйного режима в сопле генерации капель. Кроме того, высокие скорости потока приводят к более высоким напряжениям сдвига, воздействующим на клетки, что не рассматривается в данном протоколе. Предыдущее исследование упорядоченного инкапсулирования показало, что более 90% одиночно инкапсулированных клеток HL60 при условиях потока, аналогичных условиям в этом исследовании, сохранили целостность клеточной мембраны.12 Однако при экстраполяции на другие типы клеток и параметры потока необходимо будет тщательно учитывать влияние величины и временных масштабов напряжений сдвига. Пересечение ограничений по скорости водного потока для упорядочивания клеток, генерации капель и жизнеспособности клеток обеспечивает идеальный рабочий режим для контролируемой инкапсуляции одиночных и множественных клеток.

Поскольку лишь в немногих исследованиях рассматривается расстояние между цепочками частиц,19,20 определение этого расстояния проще всего провести эмпирическим путем; оно будет зависеть от геометрии канала, скорости потока, размера частиц и их концентрации. Тем не менее, равный боковой интервал между цепочками означает, что клетки поступают через предсказуемые, постоянные промежутки времени. Если генерация капель происходит с той же скоростью, с которой упорядоченные клетки поступают к соплу, клетки инкапсулируются в каплю контролируемым образом. Данный метод использовался для инкапсуляции одиночных клеток с пропускной способностью порядка 15 kHz,12 что является значительным улучшением по сравнению с предыдущими исследованиями, в которых сообщалось о скоростях инкапсуляции порядка 60-160 Hz.4,15 В работе по контролируемой инкапсуляции более 80% капель содержали одну и только одну клетку, что представляет собой значительное повышение эффективности по сравнению со статистикой Пуассона (случайным распределением), которая предсказывает в среднем менее 40% эффективности.12

В предыдущей работе по контролируемому инкапсулированию12 среднее число частиц на каплю λ подбирали таким образом, чтобы обеспечить инкапсулирование одной клетки. Мы предполагаем, что путем регулирования скоростей потока можно эффективно инкапсулировать любое количество клеток в одной капле, когда λ равно или близко к желаемому количеству клеток на каплю. В то время как инкапсулирование одиночных клеток ценно для определения индивидуального отклика клеток на стимулы, инкапсулирование нескольких клеток дает информацию о взаимодействии контролируемого количества и типов клеток. Здесь мы представляем протокол, репрезентативные результаты с использованием полистирольных микросфер и обсуждение метода контролируемого инкапсулирования нескольких клеток с помощью пассивного канала инерционного упорядочивания и сопла для генерации капель.

Протокол

Протоколы в этом разделе описываются материалов и оборудования, используемого в частности получить экспериментальные результаты. Обратите внимание, что альтернативные поставщики для химикатов и оборудования могут быть использованы.

1. Изготовление устройств и мягкие литографии

Стандартный мягкой литографии, 21 числа, которые были показаны в предыдущих статьях, Юпитер, 22 были использованы для создания полидиметилсилоксана (PDMS) микроканальных сетей связаны с стеклянные подложки. Помимо мастер копия формы изготовление ГУ-8 фотолитографии, процессы могут совершаться вне чистого помещения или чистой капот, однако, пыли и твердых частиц все равно должны быть сведены к минимуму, чтобы достичь согласованных результатов.

  1. Разработка микро-канал шаблон, как показано на рисунке 1 в AutoCAD (AutoDesk Inc.) Применять стороннему производителю (Fineline изображений Inc) для печати с высоким разрешением (50000 точек на дюйм), транс-прозрачность маски на пленке майлара или кварца, где каналы прозрачны на темном фоне.
  2. Создать кремния и SU-8 фоторезиста мастера для литья реплики. Короче говоря, спина SU-8 2050 года (MicroChem) отрицательный фоторезиста с рекомендованными производителем мин на спин-для нанесения покрытий для создания 52 мкм слоем на чистую 7,5 см или 10 см кремниевой пластины. После мягкой печь, края шарика удаление, воздействие УФ лучей через контактную маску, после контакта печь, развития и наводнения экспозиции, измерения фактической толщины SU-8 слой с помощью профилометра Dektak (Veeco). Лента мастер формы на дно 4 "и 5" чашке Петри, чтобы подготовить для литья PDMS реплики.
  3. Mix PDMS эластомера базу эластомера отвердителя (Dow Corning) в соотношении 10:1 / в базу для отвердителя. Залить хорошо перемешанных PDMS предшественник на мастер кремния для создания 2-3 мм окончательного слоя. Смесь из 20 г эластомера база с 2 отвердитель г достаточно для покрытия 4 "диаметр поверхности.
  4. Поместите masteГ плесени и PDMS в эксикаторе вакуум (Jencons) де-газ неотвержденного PDMS. С помощью регулятора давления (Cole Parmer), медленно уменьшать давление датчика камеры от 0 "Hg до -27" Hg в течение 20 минут, чтобы избежать излишнего пенообразования. Оставьте устройство в вакуумной камере при -27 "Hg в течение 30 минут или пока пузырьки воздуха исчезают.
  5. Отпустите вакуума и двигаться формы мастера и PDMS на 65 ° C духовке (Thermo Scientific) в течение как минимум четырех часов. Устройство можно оставить в духовке на ночь для улучшения лечения.
  6. Выньте его из духовки и дать остыть. Аккуратно вырежьте PDMS по круговой пластины с помощью ножа и кожура точности из PDMS. Вырежьте устройство контура, как показано на рисунке 1, с помощью скальпеля.
  7. Удар жидкостный портов (по три на устройство) в трех регионах круглые показано на рисунке 1 с помощью биопсии удар. Для этого устройства, использовать 0,75 мм наружный диаметр пуансона (Харрис).
  8. Придерживайтесь скотчем к узорной стороны PDMS и очистить, чтобы удалитьпыли. В экономии средств, но альтернативой обычным аппаратам плазме кислорода, 21,22 плазмы лечения узорные стороны PDMS и чистый 3 "х 1" стекло стекло микроскопа помощью ручных лаборатории короны Протравливатель (Electro-Technic Products Inc .) 23. Обратите внимание, что это устройство должно использоваться в вытяжном шкафу или хорошо проветриваемом помещении в результате воздействия озона разряда, и все часы и сотовые телефоны должны быть не менее десяти метров. Отрегулируйте коронного разряда для достижения стабильного коронного с минимальным искрение. Медленно махать электрода около 1/4 "над каждой поверхностью около 20 секунд, а затем немедленно привести обработанных поверхностей в контакт, чтобы сформировать сильную постоянную связь до PDMS поверхности вернуться в свои родные государства.
  9. Поместите устройство на металлической пластине, место в прохладном печи, установить духовку до 120 ° С, и выпекать ночь для завершения соединения и возврата PDMS в исходное состояние гидрофобного 24. Во время этой высокой температуры выпечки, тОн стеклянную поверхность канала также будет оказана за счет гидрофобных осаждение тонкого слоя гидрофобной на стекле. Кроме того, гидрофобные покрытия, такие как Aquapel (PPG Industries) может быть введен в жидкостного портов, используя 1 мл шприц и иглу шприца 12. Осторожно, но твердо вводить Aquapel последующей очистки воздуха в жидкостных порты, не нарушая PDMS к стеклу связь . Настойчиво повторяю продувки на всех входных и выходных портов в то время как стереть излишки Aquapel для того, чтобы избежать любых отложений, которые могут засорить каналы при высыхании.

2. Подготовка образцов

  1. Подготовить культуре клеток в соответствии с установленным порядком для выбранного типа клеток. Для конкретного устройства, используемые в этом исследовании, 8-15 мкм, частицы или клетки должны адекватно заказать для инкапсуляции. Меньше или больше типов клеток может потребоваться изменение размеров фокусирующего канала для достижения адекватного р Re. Для меняметод приводит демонстрации показано в этой статье, 9,9 мкм полистирольных микросфер (G1000, Thermo Scientific) используются как мобильные суррогатов.
  2. Подготовка водных частиц или суспензии клеток через нежный смешивания. При использовании клетки или частицы полистирола, контроля концентрации существенно (см. Рисунок 4), чтобы достичь идеального приказал инкапсуляции. Используя предыдущие данные 12 как руководство, рассчитать нужную ячейку или концентрация частиц на основе упорядоченных расстояние поезд и микро-канал размер: одна клетка или частица в ожидаемых продольной поезд расстояние фокусировки раз канал площадь поперечного сечения. Если акция концентрации (1% в / в) недостаточно, повышают концентрацию (в данном случае до 1,5% в / в), осторожно центрифугирования фондовом образца, удаления надосадочной жидкости и повторное приостановление частиц вихря смешивания, перемешивания или мягким При использовании клеток. Подготовка достаточного объема для учета требуемый набор объем и время выполнения связанных с этвл настройки.
  3. Обе клетки и частицы полистирола имеют удельный вес больше единицы. Хотя это и не показано в этом протоколе, для долгосрочных экспериментов длительностью порядка нескольких минут до нескольких часов, плавучесть соответствует решение, добавив растворенного вещества, такие как CaCl 2 для частиц или OptiPrep (Sigma-Aldrich) для клеток.
  4. Подготовьте 10 мл образец непрерывной фазе масло фторуглерода путем смешивания масла фторуглеродных FC-40 (3М) и PFPE-PEG блок-сополимер поверхностно 25 (2,5% вес / вес) (Raindance технологий) в 15 мл центрифужные пробирки. Кроме того, светлых нефтепродуктов (PTI химических процессов) могут быть использованы с ABIL-EM 90 поверхностно-активных веществ (2,5% вес / вес) (Evonik Goldschmidt Corporation).

3. Экспериментальная установка

  1. Включите перевернутое оптического микроскопа (Axio наблюдателей, Zeiss) и высокая скорость камеры (Phantom V310, Vision Research). Фокус и проверки каналов сабо и мусор либо вручную, перемещая устройство илис помощью моторизованного микроскопа. Некоторые мелкие обломки могут быть вытеснены, когда жидкость проходит через. Для крупных обломков или очевидной сабо, выберите другой канал на устройство, как мусор в фокусирующего канала может привести к снижению качества заказов значительно. Обратите внимание, что сабо часто может быть удален в потоке, нажав твердо на поверхности PDMS над пострадавшим регионом с тупым пинцетом.
  2. Нарезать три длины трубы ПВХ (0,01 "ID/0.03" OD, Tygon) на водном входе, масло входе и выходе эмульсии. Чтобы минимизировать мертвый объем, достаточно вырезать трубы, чтобы добраться от шприцевые насосы на предметный столик микроскопа. Отрежьте трубы заканчивается в 45 ° для облегчения вставки в жидкостных портов.
  3. Используйте пинцет, чтобы соответствовать нажмите концов труб в жидкостного порта кулаками на шаге 1 и нажмите подходят два 30 калибровочных тупым наконечником из нержавеющей стали шприц иглы (SmallParts) в свободные концы соответствующих водных и нефтяных входе трубы (без клея необходимо) . Место выхода трубы в т отходовeservoir. Эта трубка в дальнейшем будут перемещены в коллекцию водохранилища.
  4. Перемещение устройства и придает трубке микроскопа, выравнивание, и сосредоточить внимание на устройство форсунку с помощью доступных объективных (20x был использован для эксперимента). Установите для K hler освещения и других параметров микроскоп как это требуется для оптимальной записи.
  5. Наполните шприц 1 мл (BD) с хорошо смешанной водной фазы и 3 мл шприц (BD) с решением масляной фазы подготовлен в шаге 2. Обратите внимание, что любые шприцы любого объема может быть использован и должны быть тщательно отобраны в зависимости от требуемого времени работы и минимизация любых пульсации. Наклоните один шприц вертикально и вылить двигаться пузырьков воздуха в шприце розетки. Медленно нажмите поршень достаточно нажать воздуха в шприц наконечником. Держа шприц вертикально, подключите шприцев иглы шприца соответствующие уже подключен к устройству в шаге 3.3. Нажмите поршень, чтобы заставить воздух через иглу шприца до мертвого объема жидкости рushed через трубку почти на устройстве. Надежно закрепите шприц шприцевой насос (Nexus 3000, Chemyx) и заниматься блока поршень. Повторите для подключения второй шприц и смонтировать на второй насос шприца.
  6. Мощность каждого насоса шприца и программы с использованием протоколов насос производителя. Установка начальных скоростей потока Q = 50 нефть мкл / мин и Q ад = 5 мкл / мин для масляной фазы и водную фазу, соответственно. Запуск насосов.
  7. Подождите, пока каждый жидкости в устройство и заполнять каналы, выталкивая оставшиеся мертвый воздух. Это может занять несколько минут. Если есть большое количество воздуха во впускной трубопровод, временно увеличиваться с каждым расходом, пока воздух не выбрасывается. Не увеличивайте скорость потока настолько велика, что происходят большие давления в канале, что может привести к PDMS-стекло связь провал.
  8. Используя начальные скорости потока, наблюдать образование капель на сопло (результаты, показанные здесь: 20x magnificatioп, частота кадров 21 005 кадров в секунду, экспозиция 3 мкс). Уменьшить поле зрения камеры только сопла максимизировать частоту кадров и уменьшить требования к памяти, если это возможно. Захват видео образец и убедитесь, что частота дискретизации достаточно, чтобы избежать наложения.
  9. Чтобы избежать струйное (см. Рисунок 2), начните с низкой водной расхода. Медленно увеличивайте водный расход заметить, упорядочение частиц в конечном водный канал решение по мере увеличения скорости потока.
  10. Если концентрация частиц слишком мала, чтобы обеспечить поезда с относительно небольшим числом "недостающих" частиц и образец не соответствует плавучести, физически наклонить шприц насос к шприц выходе обеспечить постепенное оседание частиц на выходе шприца. Этот метод показан в видео-протокол. Периодически вращающаяся шприц вдоль своей оси может также уменьшить нежелательные поселения.
  11. После адекватного упорядочение происходит, регулировать скорость потока масла для настройки частоты генерации иРазмер капель. Средний объем падения может быть рассчитана с использованием водного расхода разделены по частоте падения поколения, измеряется захвата видео. Итеративно настроить как расход для достижения желаемого инкапсуляции ставок и падения объемов.
  12. После стабильного приказал инкапсуляции подтверждается, перенести выход трубы из отходов резервуара в резервуар коллекции или кормить его в другом устройстве для последующего тестирования.
  13. Определить время сбора основанных на нужное количество капель и расчетные частоты генерации.
  14. Запись доля капель, содержащих 0, 1, 2, ..., N частиц количественно эффективность использования либо падение результатов поколение видео или с помощью пипетки образца собранной эмульсии для проверки.

4. Представитель Результаты

Результаты представлены достижения которых и контролируемые одночастичных и контролируемом двойном частиц инкапсуляции (рис. 3). СокращаяFC-40 расход масла в два раза, одночастичные инкапсуляции превращается в две частицы инкапсуляции. С другой стороны, мы могли бы увеличить водный расход для доставки частиц в сопло быстрее, но мы также увеличило бы риск струйная водного потока. Гистограммы на рисунке 3 представляет дробное число частиц в капле для двух случаев, а также сравнение статистики Пуассона. Случайные капли с нуля частиц в основном за счет "пропавших без вести" частиц в упорядоченном поездов, а тех случаях, когда есть больше капсулированных частиц, чем желаемый результат от местных высоких концентраций частиц и частиц, которые иногда мигрируют к одному из двух вертикальных внимание позиции. Обратите внимание, что плавучесть для, как описано в разделе 2 не были использованы. Вместо этого, шприцевой насос был физически наклонить, чтобы оседание частиц на выходе шприца, что приводит к высокой концентрации частиц в перспективе.

экспериментальной перспективе иллюстрирующий необходимость надлежащего частиц и клеточных концентрациях показано на рисунке 4. Без полного порядка, локализованные группы порядка частиц и инкапсулируются, но многие капли без частиц. Гистограмма показывает снизилась эффективность инкапсуляции для желаемого двух частиц инкапсуляции.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Инкапсуляции устройства. а) Общая устройство входов, на выходе, и долго заказ канала. Устройство высотой 52 мкм, а ширина канала заказа составляет 27 мкм. б) На водной и нефтяной входы имеют большие фильтры мусора с пробелами порядка заказе ширина канала для увеличенный вид масла на входе. в) увеличенное изображение сопла показывает, равный ширине канала 27 мкм для водных и масляных каналов, а затем сопла сокращение от 22 мкм и внезапного расширения для более широкого канала 61 мкм.Обратите внимание, что размеры устройства, показанного здесь были проверены с помощью профилометра после микротехнологий и несколько отличаются от номинальных размеров по маске. Истинный образ заказа канал и сопло можно ознакомиться в Интернете, как Справочная Рисунок 1 . Файлов AutoCAD маски также были включены онлайн в качестве дополнения к этой рукописи.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Гистерезис капель в струйной переход с использованием более широкого устройства (80 мкм в ширину х 22 мкм высокий). а) При постоянном FC-40 расход (Q масла = 45 мкл / мин), устойчивое образование падение происходит на частоте 10 кГц, используя водный расход Q AQ = 8 мкл / мин. Как водный расход постепенно увеличена до 10 м ищ л / мин, струйное водного потока жидкости срабатывает. б) при скорости потока возвращается на 8 мкл / мин струйное продолжается. Обратите внимание, что устойчивое образование падение может быть восстановлен кратко приостановки водного насоса (1 секунда паузы обычно).

figure-protocol-3
Рисунок 3. Одно-и двухместные частиц инкапсуляции.) Drop образование с одной клетки на каплю (Q масла = 60 мкл / мин, Q = 9 водный мкл / мин) со скоростью падения поколения 6,1 кГц, средний размер капли 24,4 PL, и одноклеточные эффективность захвата D к = 79,5% и P к = 83,7% (λ = 0,95) для образца размером N D = 517 капель и п р = 491 частиц. б) падение образование с двумя ячейками на каплю достигается просто за счет уменьшения FC-40 расход Q нефти до 30 μЛ / мин. Больше (39,8 рь) капли образуются в размере 3,8 кГц с двух клеток эффективности улавливания D к = 71,5% и P к = 79,5% (λ = 1,80) для образца размером N D = 383 капель и н р = 689 частиц. CD) Два гистограммы сравнить падение инкапсуляция частиц эффективность D к упорядоченной одно-и двух-частицы с инкапсуляцией статистике Пуассона (случайная инкапсуляции). Обратите внимание, что в обоих случаях, частицы расстояние в направлении потока составляет около 17-18 мкм полностью упорядоченный, чередуя частиц. Справочная видеозаписи как одно-и двухместных частиц инкапсуляции доступны в Интернете. Щелкните здесь для просмотра фильмов Справочная 3а . Щелкните здесь для просмотра фильмов Справочная 3b .

figure-protocol-4
Рисунок 4. Концентрация сильно влияет на эффективность инкапсуляции.) Поскольку концентрация уменьшается, полный порядок не происходит, и, следовательно, "дыры" в поездах выйти, оставив несколько капель с меньшим, чем ожидалось частиц. Б) гистограмма показывает снижению эффективности ( D к = 55,9%, P к = 70,9%) в течение двух частиц инкапсуляции в связи с меньшим значением λ = 1,57, где есть почти столько же одночастичные падает, поскольку есть двойной частиц падает. Это произошло в результате нефть Q = 30 мкл / мин, Q = 9 водный мкл / мин, на тех же условиях, что и для потока рис. 3б. Представитель дополнительного видео в Интернете. Щелкните здесь для просмотра Справочная 4 фильма .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Несмотря на относительно высокую степень упорядоченности, не все капли будет содержать нужное количество частиц или клеток. Инкапсуляции эффективность может рассчитываться как число клеток или частиц, которые становятся заключены в каплях с желаемой занятости разделить их общего числа. Эти исходные данные могут быть получены либо из высоко автоматизированный алгоритм скорости видео или изображений образца собранной эмульсии. Это можно сравнить с долей частиц P к заключена в капле, содержащего к части...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

JE является изобретателем в ожидании патент, основанный на технологиях, используемых в этой рукописи.

Благодарности

Мы благодарим Raindance технологии для выборки PFPE-PEG поверхностно-активных веществ, используемых в данном исследовании, и мы благодарим BioMEMS ресурсный центр (Mehmet Toner, директор) для формы кремниевой пластины используются для создания реплик PDMS канала.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии
AutoCAD AutoDesk
Transparency Mask Fineline изображений Инк
SU-8 фоторезиста MicroChem 2050
Dektak профилометра Veeco
Чашку Петри BD Сокол 351058
PDMS Силиконовый эластомер Kit Корпорация Dow Corning Sylgard 184, материал номер (240) 4019862
Вакуум-эксикатор Jencons 250-030
Вакуум-насос Alcatel Вакуумная техника 2010 C2
Вакуумный регулятор Коул-Parmer EW-00910-10
Печь Thermo Scientific Линдберг синий M, OV800F
Биопсия Punch, 0,75 мм Харрис Uni процессоров 15072
Лаборатория Corona Тритер Электро-Technic продактс инк BD-20AC, SKU 12051A
Стеклах Gold Seal 3010
Aquapel PPG Industries Альтернативная стратегия
Полистирольных микросфер, 9,9 мкм Thermo G1000
OptiPrep Sigma-Aldrich D1556 Не продемонстрировал
Луер-Лок Шприцы BD 1 мл: 309 628
3 мл: 309 585
FC-40 Фторуглеродные нефти 3M Инк Sigma Aldrich, F9755
PFPE-PEG фторированные Raindance технологии
Светлых нефтепродуктов Химических процессов PTI 08042-47-5 Альтернативная стратегия
Поверхностно-минерального масла Evonik Goldschmidt корпорации ABIL EM 90 Альтернативная стратегия
Tygon ПВХ труб SmallParts TGY-010
30 калибровочных Луер-Лок иглу шприца, 1/2 " SmallParts NE-301PL-C
Инвертационный микроскоп Carl Zeiss изображений Axio Observer.Z1
Камера высокого скорости Vision Research Phantom V310
Шприцевые насосы (2) Chemyx Инк Nexus 3000
Силиконовое масло Dow Corning 200 жидкости, 10 сСт Опционально для хранения эмульсии

Ссылки

  1. Zagnoni, M., Lain, G. L. e, Cooper, J. M. Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).
  2. Niu, X. Z., Gielen, F., Edel, J. B., deMello, A. J. A microdroplet dilutor for high-throughput screening. Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).
  3. Vincent, M. E., Liu, W., Haney, E. B., Ismagilov, R. F. Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals. Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).
  4. Huebner, A. Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics. Chemical communications. , 1218-1220 (2007).
  5. Love, J. C., Ronan, J. L., Grotenbreg, G. M., van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies. Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).
  6. Bradshaw, E. M. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).
  7. Liu, W. S., Kim, H. J., Lucchetta, E. M., Du, W. B., Ismagilov, R. F. Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement. Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).
  8. Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).
  9. Koster, S. Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells. Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).
  10. Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).
  11. Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues. Biomedical materials. 5, 21001(2010).
  12. Edd, J. F. Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops. Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).
  13. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82, 364(2003).
  14. Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., Weitz, D. Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams. Physical Review Letters. 99, (2007).
  15. Chabert, M., Viovy, J. L. Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).
  16. Segrí, G., Silberberg, A. Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions. Nature. 189, 209-210 (1961).
  17. Carlo, D. D. i Inertial microfluidics. Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).
  18. Carlo, D. D. i, Edd, J., Humphry, K., Stone, H., Toner, M. Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows. Physical Review Letters. 102, (2009).
  19. Humphry, K. J., Kulkarni, P. M., Weitz, D. A., Morris, J. F., Stone, H. A. Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows. Physics of Fluids. 22, 081703(2010).
  20. Lee, W., Amini, H., Stone, H. A., Carlo, D. D. i Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413(2010).
  21. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane. Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).
  22. Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J. Vis. Exp. (8), e319(2007).
  23. Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).
  24. Hatch, A. C. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab on a chip. , 3838-3845 (2011).
  25. Holtze, C. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).
  26. Garstecki, P., Stone, H., Whitesides, G. Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions. Physical Review Letters. 94, (2005).
  27. Garstecki, P., Fuerstman, M. J., Stone, H. A., Whitesides, G. M. Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up. Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).
  28. Nie, Z. Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids. Microfluidics and Nanofluidics. , (2008).
  29. Holt, D. J., Payne, R. J., Chow, W. Y., Abell, C. Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis. Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).
  30. Holt, D. J., Payne, R. J., Abell, C. Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams. Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).
  31. Hatch, A. C., Fisher, J. S., Pentoney, S. L., Yang, D. L., Lee, A. P. Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays. Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).
  32. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Микрофлюидная инкапсуляциясопло с фокусировкой потокаинерционное упорядочиваниеинкапсуляция одной клеткиинкапсуляция двух клетоксуррогаты частицскорость генерации капельскорость водного потокаскорость потока маслаконтролируемая инкапсуляция
Высокая пропускная способность Single-камеру и несколько клеток микро-инкапсуляции
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.