Методическая статья

Выборка прав коренных Peptidome Слюна Использование Lollipop, как ультрафильтрация Probe: упростить и улучшить пептида обнаружения клинических масс-спектрометрии

DOI:

10.3791/4108

⸱

7 августа 2012 г.

 ,  , 
1Sanford-Burnham Medical Research Institute, 2Division of Dermatology, University of California, San Diego , 3VA San Diego Healthcare Center, 4Moores Cancer Center, University of California, San Diego

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Учитывая, слюна выборки для будущего клинического применения, как леденец на палочке, ультрафильтрации (LLUF) зонда было сфабриковано, чтобы уместиться в ротовой полости человека. Прямой анализ слюны на непереваренные NanoLC-КТЛ масс-спектрометрии продемонстрировали способность датчиков LLUF для удаления крупных белков и белков высокой численности и сделать низкими обильные пептиды более обнаружить.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на то, что протеом и пептидом слюны человека были изучены 1-2, их идентификация в основном проводилась на основе триптических перевариваний белков слюны. Идентификация собственного пептидома слюны человека без предварительного расщепления экзогенными ферментами становится необходимой, так как нативные пептиды в слюне человека обладают потенциальной ценностью для диагностики заболеваний, прогнозирования прогрессирования болезни и мониторинга эффективности терапии. Правильный отбор проб является критическим этапом для улучшения идентификации собственного пептидома слюны человека. Традиционные методы сбора слюны человека, включающие центрифугирование для удаления детрита 3-4, могут быть слишком трудоемкими для применения в клинической практике. Кроме того, удаление детрита путем центрифугирования может быть недостаточно эффективным для очистки от большинства инфекционных патогенов и удаления высокоабдундантных белков, которые часто препятствуют идентификации низкоабдундантного пептидома.

Традиционные протеомные подходы, в которых преимущественно используется двумерный гель-электрофорез (2-DE) в сочетании с внутригелевым перевариванием, позволяют идентифицировать многие белки слюны 5-6. Однако этот подход обычно недостаточно чувствителен для обнаружения пептидов/белков с низкой концентрацией. Альтернативой является протеомика на основе жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS), которая позволяет идентифицировать белки без предварительного разделения методом 2-DE. Хотя этот подход обеспечивает более высокую чувствительность, он обычно требует предварительного фракционирования образца 7 и предварительного переваривания трипсином, что затрудняет его применение в клинической практике.

Чтобы преодолеть сложности в масс-спектрометрии, связанные с пробоподготовкой, мы разработали метод с использованием капиллярных ультрафильтрационных (CUF) зондов 8-11. Данные нашей лаборатории показали, что CUF-зонды способны захватывать белки in vivo из различных микросред животных динамическим и минимально инвазивным способом 8-11. Центрифугирование не требуется, так как отрицательное давление создается простым втягиванием порции шприцем во время сбора образца. Использование CUF-зондов в сочетании с LC-MS позволило успешно идентифицировать белки после трипсинового расщепления 8-11. В данном исследовании мы усовершенствовали метод ультрафильтрационного отбора проб, создав ультрафильтрационный зонд в форме леденца (LLUF), который легко помещается в ротовую полость человека. Прямой анализ с помощью LC-MS без трипсинового расщепления показал, что слюна человека естественным образом содержит множество пептидных фрагментов, производных от различных белков. Отбор слюны с помощью LLUF-зондов позволил избежать центрифугирования, но при этом эффективно удалил многие более крупные и высококонцентрированные белки. Результаты масс-спектрометрии продемонстрировали, что многие низкоконцентрированные пептиды стали обнаруживаемыми после фильтрации более крупных белков с помощью LLUF-зондов. Обнаружение низкоконцентрированных пептидов слюны не зависело от многоэтапного разделения образцов с помощью хроматографии. Для клинического применения LLUF-зонды в сочетании с LC-MS в будущем могут быть использованы для мониторинга прогрессирования заболеваний по слюне.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Создание датчиков LLUF

  1. Полиэфирсульфона мембраны (2 см 2) были закрыты с треугольником полипропилена манипуляторы (Университет Калифорнии, Сан-Диего) склеиванием мембран с эпоксидной на границах весла. Отрицательно заряженные полиэфирсульфона мембраны с молекулярной массой отсечки (MWCO) в 30 кДа был использован.
  2. Тефлоновые трубки фторированных пропилена этилена (внутренний диаметр / наружный диаметр, 0.35/0.50 см) был прикреплен к цилиндру выхода весло полипропилена треугольник, поэтому зонд LLUF может быть подключен к 20 мл шприца.
  3. После замачивания мембран полиэфирсульфона в слюне человека в культуре блюдо (50 мм), отрицательное давление было создано снятии шприца. Шприц с отрицательным давлением вынудили ультрафильтрации процесс отбора проб из белков слюны.
  4. Зонды были стерилизованы с 70% спиртом ночь перед использованием. Чтобы убедиться в их исправности уплотнения, мы позиционировали LLUF зондов в растворахТион содержащие синий декстран (50 мг / мл) со средней молекулярной массой 2000 кДа в течение 2 часов. Отсутствие синего декстрана в собранных образцов показал, что никаких утечек разработана при изготовлении зонда и отбора проб.

2. Слюна коллекции

  1. Всего слюны были собраны из трех здоровых добровольцев (двое мужчин и одна женщина в возрасте 20 и 40), не принимающих лекарства, без явных признаков гингивита или полости 6.
  2. После полоскания полости рта водой, все образцы слюны были собраны плеваться, без химической стимуляции, в охлажденной льдом судна.
  3. Все образцы были объединены и держится на льду во время процедуры взыскания долга.
  4. Сразу же после сбора, слюны (200 мкл) был применен для отбора проб с LLUF зондов. Отбор проб проводили при 4 ° C комнате.
  5. Слюна белков (1,0 мкг / мкл) с или без взимания LLUF зонд непосредственно подвергаются нано LC-массы сpectrometry анализ без триптического пищеварения. Концентрации белка определяли с помощью Bio-Rad белка Анализ 12.

3. NanoLC-КТЛ MS Analysis

  1. ООН-переваривается слюны (5 мкл) непосредственно загружены в ловушку колонке Eksigent NanoLC системы автоматического пробоотборника, используя 100% буфера (2% acetonitrile/0.1% муравьиной кислоты). NanoLC была на линии в сочетании с масс-спектрометра Finnigan КТЛ.
  2. После загрузки образца и промывки, клапан был включен и 500 Нл / мин линейный градиент был доставлен в ловушку и разделительной колонки (10 см в длину, 100 мкм идентификатор, в доме упакован Synergi 4 мкм C18). Градиент от 0 до 50% буфера В (80% acetonitrile/0.1% муравьиной кислоты), в 45 мин.
  3. NanoLC-КТЛ MS инструменты работают в режиме данные, зависящие от Xcalibur. MS / MS спектры четырех сильнейших ионов MS выше интенсивность 1 × 10 5 были собраны с динамическим исключениевключена и энергии столкновения установлен на 35%.
  4. Каждый образец был запущен дважды NanoLC-КТЛ системы MS. Образцы из трех отдельных препаратов были использованы. Эти пептиды обнаруживаются в трех отдельных образцах были перечислены в Дополнительных таблицах 1 и 2. Представитель NanoLC-КТЛ MS спектров показано на рисунке 3.

4. Анализ данных и поисковых баз данных белков

  1. Каждый RAW файл конвертируется в файл с помощью mzXML Readw.exe.
  2. MzXML файл был введен в философский SEQUEST 2 системы и искали против человеческой базы данных, генерируемых соответствующий Национальный центр биотехнологической информации (NCBI) белка базы данных с использованием не-фермент специфику. Масса толерантности предшественником ионных был установлен на уровне 1,5 Da. Молекулярной массой 16 Да был добавлен в метионин для дифференциального поиска для учета окисления.
  3. После SEQUEST поиска, результаты были автоматически фильтруется, проверяетсяг отображается PeptideProphet и ProteinProphet [Института системной биологии (МОБ)]. PeptideProphet оценивает всеобъемлющие вероятность (Р) счет, что пептид назначение "правильного" против "неправильных" на основе ее SEQUEST баллов (Xcorr, ΔCn, Sp, RSP) и дополнительную информацию о каждой пептидной последовательности определены. ProteinProphet вычислить вероятность шкале от 0 до 1 для каждого белка на основе пептидов назначен MS / MS спектров.
  4. Чтобы свести к минимуму ложных срабатываний идентификации использовались строгие критерии фильтрации. Во-первых, минимальное количество баллов P отсечка установлена ​​на уровне 0,8, для всех обслуживаемых пептид для обеспечения очень низкого ошибки (гораздо меньше, чем 3%) и достаточно хорошей чувствительностью. Во-вторых, все пептиды с> 0,8 P счет должен иметь высокую кросс-корреляцию (Xcorr) забивает гол в то же время: 1.9, 2.2 и 3.0 +1, +2, +3 и бесплатно.

5. Удаление бактерий ротовой полости с LLUF зонды

  1. Для определения возможности зондов LLUF удалитьбактерии полости рта, слюне до и после LLUF зонд коллекции (раздел 3) было распространено на агаром для бактериальных обнаружения.
  2. Аэробные бактерии выращивались на антибиотик без Лория-Бертани (LB) агар пластин при 37 ° С в течение одного дня.
  3. Анаэробных бактерий, выращенных на антибиотик без Brucella бульон агар пластины (BD, Sparks, MD) в анаэробных условиях с использованием газо-Пак (BD Biosciences, San Jose, CA) при 37 ° C в течение одного дня.

6. Представитель Результаты

1. Изготовление датчиков LLUF и отбор проб слюны в ротовой полости подражали

Если отбор проб слюны может быть выполнена как сосать леденец, процедура позволит избежать деградации плюнул слюной в коллекцию устройств 13-14. Важно отметить, что также станет возможным для наблюдения за пациентами динамично и локально полости рта. Кроме того, если пробоподготовки использованием слюны может быть упрощена, врачи бы легко Facilitate процедуру ускорить их решение на следующей клинической работы. Масс-спектрометрия является одним из наиболее чувствительных методов обнаружения и даже последовательность белков в очень короткий период времени. Тем не менее, сложные процедуры для подготовки проб препятствовали использовании этого метода в клинике. Кроме того, известно, что выше обилие белков или белков с большим молекулярным весом в клинических образцов (например, амилазы в слюне) маска низкой белков изобилия в масс-спектрометрического анализа 15-16. Чтобы преодолеть препятствия уже упоминалось выше, мы разработали леденец, как ультрафильтрация устройство с именем LLUF зондов (рис. 1). Отрицательно заряженные полиэфирсульфона мембраны с MWCO на 30 кДа (рис. 1А,) был приклеен к полипропилена весло (рис. 1а, б). Он был расположен в передней части датчика LLUF с целью фильтрации больше белков в слюне. Для имитации человеческой среды полости рта (рис. 1А, г), Губки (рис. 1А, е), была пропитана слюной в культуре блюдо (рис. 1А, е). После полного снятия шприца (рис. 1А, г), фильтруют слюной начал двигаться вдоль связано трубки (рис. 1а, в) и была собрана.

2. Определение коренных peptidome слюны NanoLC-КТЛ MS

Сравнение LC хроматограмм, мы обнаружили различные хроматограммы слюны до и после LLUF выборки (рис. 2), указав, что существуют различные композиции белков в слюне после отбора проб LLUF. Для определения белка композиции мы использовали NanoLC-КТЛ масс-спектрометрии, который, как известно, чтобы иметь возможность оперативно последовательность пептидов из смеси нескольких белков. Более того, для упрощения подготовки образцов для клинических целей, весь слюной без химического или ферментативного пищеварения был применен для NanoLC-КТЛ анализа MS. Неожиданно, 131 пептидов, мыповторно выявленных в непереваренной слюны (Справочная таблица 1). Эти пептиды являются фрагментами, полученные из различных пролин богатый белками, актин, альфа-амилазы, альфа-1 глобина, бета-глобина, histain 1, кератин 1, муцина 7 полимерных рецептора иммуноглобулина, satherin и S100A9. Двадцать шесть уникальных пептиды были выделены в слюне после фильтрации с зондами LLUF (Справочная таблица 2). Эти пептиды являются фрагментами в основном из различных пролин-богатыми белками. Пептиды, полученные из белков, таких как полимерные рецептора иммуноглобулина (83,24 кДа) и альфа-амилаза, было обнаружить, что свидетельствует о возможности LLUF зондов удаление крупных и обильных белков. MS / MS спектр PFIAIHAEAESKL пептид, соответствующий внутренний пептида альфа-амилазы показано на рисунке 3А. Еще более удивительно, после удаления больше белков, 18 из 26 пептидов последовательный стал обнаруживается в LLUF зонд-пробы слюны (табл.1). Эти 18 пептиды, полученные из пролин-богатых белками или гипотетические белки, которые закончились пролина (P) -. Глютамин (Q) (-Ро),-SR, SP-или-ПП С-конца Рисунок 3B показали, MS / MS Спектр пептид PQGPPQQGGHPRPP, который был обнаружен в LLUF зонд-пробы слюны. Пептид может быть получен из пролин-богатых белком HaeIII подсемейства 1 и 2 (табл. 1).

figure-protocol-1
Рисунок 1. Композиции LLUF зондов и выборки весь слюной от человека имитировать полости рта группы.: (А) полупроницаемую полиэфирсульфона с MWCO 30 кДа, (б) полипропилен весла; (с) тефлоновой трубкой фторированных пропилена этилена; (г) 20 мл шприц Группа B:. губку (е) (передразнил язык) была пропитана в культуре блюдо (F), содержащий слюне человека для созданияискусственных человеческих полости рта (г). В результате отрицательного давления, создаваемого полностью снятии шприца диски собрали жидкость двигаться по трубе подключены (стрелка) и к созданным пространства (стрелки) в шприц. Бар: 2,0 см.

figure-protocol-2
Рисунок 2. Дифференциальные LC / MS / MS хроматограмм слюны до и после отбора проб LLUF. Белки (1,0 мкг / мл) в слюне человека все были отфильтрованы или без датчика LLUF. Белки без триптического пищеварения непосредственно подвергаются NanoLC-КТЛ MS, что было сопряжено с системой Eksigent Nano LC, как описано в Материалы и методы. Базовый пик хроматограммы (с 44-мим время удерживания) слюны до (А) и после (б) LLUF выборки были проиллюстрированы.

figure-protocol-3
Рисунок 3. ДетекторовТион слюны peptidome по NanoLC-КТЛ MS последовательности. белков слюны до (А) и после (б) отбор проб с зондами LLUF были проанализированы NanoLC-КТЛ MS, как описано в экспериментальной процедуры. Слюна peptidome из натуральных слюне человека без триптического пищеварения были продемонстрированы в Дополнительных таблицах 1 и 2. Пептида (PFIAIHAEAESKL), полученных из альфа-амилазы исключительно обнаружены в слюне без взимания с зондами LLUF (A), что свидетельствует о том, что возможности зондов LLUF в удалении крупных белков. Многие пептиды с PQ-,-SR, SP-или-ПП С-концов были только в образцах после ультрафильтрации LLUF зондов. Один (PQGPPQQGGHPRPP) пептиды, полученные из различных пролин богатый белками показали (B). MS / MS спектры с характерным "у" и "б" ионов серии подтвердили личность и пептидов.

figure-protocol-4
<сильный> Рисунок 4. Удаление бактерий ротовой полости во время использования LLUF зондов. Зонд LLUF был построен, как описано в материалах и методах. Зонд был помещен в слюне человека в подражали среды полости рта (рис. 1). Шприц в конце LLUF зонд был снят для создания отрицательного давления, которые привели процесс ультрафильтрации для слюны выборки. Во время отбора проб, весь слюной пересек выборочно через мембрану полиэфирсульфона и накопленных внутри шприца. Всего слюны до отбора проб с зондом LLUF служили в качестве контроля. Слюна (10 мкл) до и после отбора проб LLUF зонд был распространен на агаром для обнаружения бактериальной группы. Слюна с (+ LLUF) и без (+ LLUF) LLUF пробоотборника было распространено бок о бок на антибиотик без LB агар пластин при 37 ° С в течение одного дня группа B:. слюны и без отбора проб LLUF зонд был распространен на антибиотик без Brucella пластины агара бульономв анаэробных условиях с использованием газо-Пак (BD Biosciences, San Jose, CA) при 37 ° C в течение одного дня. Бактерии не растут на агаром распространяться с LLUF зонд-пробы слюны, что свидетельствует о возможности LLCF зондов в ликвидации аэробных и анаэробных бактерий ротовой полости. Бар: 1,0 см.

Пептид последовательности / Измеренные массы пептида Присоединение номер Имя
1 AGNPQGPSPQGGNKPQ
GPPPPPGKPQ
2485,3 		ги | 41349484 Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 2 предшественника
ги | 41349482 Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 1 предшественника
ги | 60301553 Proline богатые белком BstNI подсемейства 2
2 GGHQQGPPPPPPGKPQ
1576,9 		ги | 4826944 Proline богатые белком HaeIII подсемейства 2
ги | 9945310 Proline богатые белком HaeIII подсемейства 1
3 GPPPAGGNPQQPQAPPA
GKPQGPPPPPQGGRPP
3126,2 		ги | 37537692 Proline богатые белком BstNI подсемейства 4 предшественник
4 GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ
2028,3 		ги | 113423660 Предсказал: гипотетический белок
5 GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP
2077,8 		ги | 113423262 Предсказал: гипотетический изоформы белка 5
ги | 41349482 Proline богатые белком BstН.И. подсемейства 1 изоформы 1 предшественника
ги | 60301553 Proline богатые белком BstNI подсемейства 2
ги | 113423663 Предсказал: гипотетический белок
ги | 41349484 Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 2 предшественника
ги | 41349486 Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 3 предшественник
6 GPPPPPPGKPQGPPPQ
GGRPQGPPQGQSPQ
2918,5 		ги | 9945310 Proline богатые белком HaeIII подсемейства 1
7 GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ
2131,3 		ги | 113423660 Предсказал: гипотетический белок
8 GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ
2030 		ги | 113423663 Предсказал: гипотетический белок
ги | 41349482 Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 1 предшественника
ги | 113423262 Предсказал: гипотетический изоформы белка 5
ги | 60301553 Proline богатые белком BstNI подсемейства 2
9 GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ
1866,6 		ги | 4826944 Proline богатые белком HaeIII подсемейства 2
10 GPPQQGGHPPPPQGRPQ
1713,8 		ги | 9945310 Proline богатые белком HaeIII подсемейства 1
ги | 4826944 Proline богатые белком HaeIII подсемейства 2
11 GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ
2083,1 		ги | 9945310 Proline богатые белком HaeIII подсемейства 1
ги | 4826944 Proline богатые белком HaeIII подсемейства 2
12 GRPQGPPQQGGHQQGP
PPPPPGKPQ
2512,6 		ги | 4826944 Proline богатые белком HaeIII подсемейства 2
ги | 9945310 Proline богатые белком HaeIII подсемейства 1
13 NKPQGPPPPGKPQGPP
PQGGSKSRSSR
2720,2 		ги | 113423262 Предсказал: гипотетический изоформы белка 5
ги | 113423663 Предсказал: гигипотетических белков
14 PQGPPQQGGHPRPP
1450,1 		ги | 9945310 Proline богатые белком HaeIII подсемейства 1
ги | 4826944 Proline богатые белком HaeIII подсемейства 2
15 QGRPQGPPQQGGHPRPP
1791,1 		ги | 4826944 Proline богатые белком HaeIII подсемейства 2
ги | 9945310 Proline богатые белком HaeIII подсемейства 1
16 SPPGKPQGPPPQ
1186,9 		ги | 113423262 Предсказал: гипотетический изоформы белка 5
ги | 41349482 Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 1 предшественника
ги | 60301553 Proline богатые белком BstNI подсемейства 2
ги | 113423663 Предсказал: гипотетический белок
ги | 41349484 Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 2 предшественника
ги | 41349486 Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 3 предшественник
17 SPPGKPQGPPPQGGNQ
PQGPPPPPGKPQ
2720,3 		ги | 113423663 Предсказал: гипотетический белок
ги | 41349482 Proline богатые белком BstNI подсемейства 1 изоформы 1 предшественника
ги | 113423262 Предсказал: гипотетический изоформы белка 5
ги | 60301553 Proline богатые белком BstNI подсемейства 2
18 SPPGKPQGPPQQEGNKPQ
1870,9 		ги | 37537692 Proline богатые белком BstNI подсемейства 4 предшественник

Таблица 1. Пептиды были обнаружены только в LLUF-проб.

Справочная таблица 1. Щелкните здесь для просмотра дополнительной таблице 1 .

Справочная таблица 2. Щелкните здесь для просмотра дополнительной таблице 2 .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы обнаружили, что многие пептидные фрагменты существуют в человеческой слюне непереваренной. Эти пептидные фрагменты, являются производными от различных форм пролин-богатых белков, актина, альфа-амилазы, альфа-1 глобина, бета-глобина, histain 1, кератин 1, муцина 7 полимерных рецептора иммуноглобулина, satherin, S100A9. Там может быть много факторов, влияющих на производство пептиды с неопределенным сайты расщепления. Например, некоторые пептидные фрагменты могут быть естественным образом присутствуют в человеческой сл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения грантов (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 и R21-I58002-01). Мы благодарим С. Нимейер за критическое чтение рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии
Полиэфирсульфон мембран Pall Corporation 30 кДа MWCO
Тефлоновые трубки фторированных пропилена этилена Upchurch Научные
Синий декстрана Сигма
Nano LC системы Eksigent
C18 колонка ловушка Agilent 5065-9913
КТЛ линейной ионной ловушки масс-спектрометра Thermo Fisher
Волшебник 2 Sage-N исследовRCH
Ацетонитрил, 0,1% муравьиной кислоты JT Baker 9832-03 LC / MS класс
Вода 0,1% муравьиной кислоты JT Baker 9834-03 LC / MS класс

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
  2. Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
  3. Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
  4. Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
  5. Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
  6. Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
  7. Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
  8. Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
  9. Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
  10. Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
  11. Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
  12. Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
  13. Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
  14. Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
  15. Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
  16. Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
  17. Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
  18. Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
  19. Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
  20. Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
  21. Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
  22. Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
  23. Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
  24. Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
  25. Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
  26. Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
  27. Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
  28. Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
  29. Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
  30. Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
  31. Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
  32. Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
  33. Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
  34. Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
  35. Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
  36. Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
  37. Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
  38. Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Lollipop

Похожие статьи