Подробное описание изоляции мыши островка описывается с помощью техники на месте панкреатического протоков катетеризации и перфузии сочетание очищенной коллагеназы и нейтральной протеазы.
Методическая статья
Мышь Островок Лангерганса изоляции с использованием комбинации Очищенный коллагеназы и нейтральной протеазы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
За последние годы подходы к изучению экспрессии генов и функций бета-клеток in vitro окончательно сместились от исследования опухолевых клеточных линий грызунов к изучению изолированных островков грызунов. Первичные островки обладают явным преимуществом, так как они более точно отражают биологию путей внутриклеточной сигнализации и секреторные ответы. Хотя метод изоляции островков с использованием препаратов ферментов для диссоциации тканей (TDE) хорошо известен во многих лабораториях1-4, различия в стабильности выхода и качества островков у конкретных линий грызунов ограничивают объем и осуществимость исследований на первичных островках. Эти вариации часто возникают из-за использования грубых, частично очищенных TDE в процедуре изоляции островков; TDE часто демонстрируют различия в активности от партии к партии и нередко требуют корректировки дозы используемого фермента. В небольшом количестве отчетов описывалось использование очищенных TDE для изоляции клеток грызунов5, 6, однако эта практика не получила широкого распространения, несмотря на рутинное использование и преимущества очищенных TDE при изоляции островков человека. В сотрудничестве с VitaCyte, LLC (Индианаполис, Иллинойс), мы разработали модифицированный протокол изоляции островков мыши на основе метода, описанного Gotoh7, 8, при котором TDE перфузируют непосредственно в панкреатический проток мышей с последующим грубым фракционированием тканей с помощью градиента Histopaque9 и выделением очищенных островков. Существенным отличием нашего протокола является использование комбинации очищенной коллагеназы (CIzyme MA) и нейтральной протеазы (CIzyme BP). Коллагеназа была охарактеризована с помощью анализа активности деградации коллагена (CDA) с использованием флуоресценции6, в котором в качестве субстрата применялись флуоресцентно меченные растворимые фибриллы кожи теленка6. Данный субстрат более точно предсказывает кинетику деградации коллагена в тканевом матриксе, поскольку он основан на нативном коллагене. Протеаза была охарактеризована с помощью чувствительного флуоресцентного кинетического анализа10. Использование этих улучшенных анализов наряду с традиционным биохимическим анализом позволяет производить TDE более стабильно, что ведет к повышению согласованности характеристик между партиями. Протокол, описанный здесь, был оптимизирован для максимального выхода и оптимальной морфологии островков с использованием мышей C57BL/6. В ходе разработки данного протокола оценивались несколько комбинаций коллагеназы и нейтральных протеаз при различных концентрациях, и итоговое соотношение коллагеназы к нейтральной протеазе 35:10 обеспечивает эффективность фермента, сопоставимую с Sigma Type XI. Поскольку сообщалось о значительной вариабельности среднего выхода островков у разных линий крыс и мышей, для улучшения выхода и качества островков, выделенных из разных видов и линий, следует внести дополнительные изменения в состав TDE.
Протокол
А. Необходимые материалы: см. Таблицу 1 (реагентов) до подготовки
- HBSS (P / S): 100 мл 10X HBSS + 900 мл H 2 0 + 1% пенициллина / стрептомицина (хранится в холодильнике или хранить на льду).
- 20% BSA складе производится в воде и на аликвоты и хранили при температуре -20 ° C.
- HBSS (BSA): 200 мл 1X HBSS (P / S) + 3 мл 20% BSA (конечная концентрация БСА составляет 0,3%)
- Островок среде: RPMI + 10% FBS + 1% глутамина + 1% пенициллина / стрептомицина
- Histopaque 1100: 240 мл 1119 Histopaque + 200 мл 1077 Histopaque
- 4-0 швов (McKesson): разрезать на 2 ¾ дюйма штук и хранится в 10 см блюдо Петри
- Инструменты: Согните щипцы из изобразительных инструментов науки до 90 °, и спиливать зубов зубчатых всех трех пар щипцов. Цель состоит в том, чтобы притупить зубы, чтобы не удалить их.
- Канюля для введения коллагеназы / протеазы смеси: 27G ½ дюйма иглы, 30 ½ дюймаиглу, PE50 трубки разрезают на 12 дюймов штук. Файл обе иглы до гладкого закругленным концом, который не имеет острых краев. Вставьте 27G иглу в один конец 12 дюймов кусок трубы PE50. Снимите 30G иглу из корпуса, разбив корпус с плоскогубцами, превратив корпус ¼ оборота каждый раз. Снимите иглу с плоскогубцами из корпуса и вставить его в другой конец трубы PE50 под микроскопом рассечение. Будьте уверены, чтобы не перегибать трубки, как вы вставить иглу в PE50 труб. 27G игла конце концов, что вы приложите шприц коллагеназы.
- Коллагеназы (CI фермента MA) и нейтральные протеазы (CI фермента BP). Развести TDE в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Обратитесь к определенной партии сертификат анализа для расчета концентрации фермента деятельности. Переезд в общей сложности 350000 коллагена унижающие деятельности (CDA) единиц восстановленной коллагеназы и 100.000 единиц нейтральной протеазы reconstitраспределенными протеазы BP в конической трубе и разбавить до 15 мл Всего в HBSS (P / S)
В. Шаг за шагом протокола
1. Инфляция поджелудочной железы с коллагеназы / протеазы смеси
- Усыпить мышей путем смещения шейных позвонков, насыщают мыши туловища с 70% этанола, открытой брюшной полости полностью от ануса до диафрагмы с любым рассечение ножницами и щипцами.
- Наведите на платформе рассечение микроскопом.
- Потяните слепой и восходящей ободочной кишки, и установить их за пределами полости тела с левой стороны. См. рисунок 1 для резюме следующие шаги.
- Установите долей печени от диафрагмы, они должны остаться там, если полость тела открыта достаточно далеко. Найти печеночной артерии, воротной вены и желчных протоков расслоение, ведущие в печени путем захвата двенадцатиперстной кишки с изогнутым пинцетом. С другой паре изогнутые щипцы, достигают в артерии, вены, и канал буndle и вытащить 2 ¾ дюйма кусок 4-0 шва под артерии, вены, желчных протоков и связать его один раз и вытащить его туго как можно ближе к печени, как это возможно.
- Использование двух пар изогнутых щипцов, тщательно захватить двенадцатиперстной кишки и найти желчных протоков прикреплены к двенадцатиперстной кишке в сосочка. Используйте щипцы из щипцов, чтобы ткнуть через поджелудочной железы и соединительной ткани правого под пристальным желчных протоков в сосочка. Ткните щипцы быстро через орган, чтобы сделать отверстие, а затем положить обе щипцы щипцы до конца и захватить еще 2 ¾ дюйма кусок шва через 4-0 и связать его один раз и вытащите его в узком кругу, но не тянуть туго.
- Изменения к 90 ° щипцы и ножницы Superfine Vannas. С 90-щипцы °, тщательно щипать и тянуть тонкую кишку, пока желчных протоков натянута. Сделайте один горизонтальный разрез через сосочек с ножницами, нанося удар открытой ножницами в кишечник, а затем резки с одной движения. Попробуйте сделать только опе пересек сосочка без выбивании желчных протоков от сосочка.
- В то время как все еще держа в кишечнике с 90 щипцами °, вставьте канюлю в желчных протоках до половины длины желчных протоков, а затем осторожно потяните нить туго вокруг канюли.
- Заполнить 3 мл шприц с 2,0 мл коллагеназы / протеазы смеси и ввести в канюлю на медленное, постоянное темпами.
- После инфляция поджелудочной железы завершена, удалите канюлю из желчных протоков и использовать изогнутый пинцет и изогнутые ножницы весной, чтобы удалить завышенным поджелудочной железы, начиная с нисходящей ободочной кишки и отрезая соединительной ткани, как вы потяните вверх кишечника. Продолжить для удаления поджелудочной железы из кишечника, пока не достигнете желчных протоков, а затем удалить поджелудочную железу из селезенки, а затем в желудок, а затем из внутренних органов брюшной полости. Готово удаления от отрезая от швов. Добавить поджелудочной железы в 50 мл пробирку, содержащую 5 мл HBSS(P / S). Эта трубка должна быть на льду.
- Повторите описанную выше процедуру для каждого животного до четырех животных. Для получения оптимальных результатов, диссоциируют только четыре pancreata в одно время. Как правило, в то время как первые четыре находятся в 37 ° С водяной бане, мы раздувать еще четыре pancreata.
2. Поджелудочная железа Диссоциация
- Поместите 50 мл пробирки, содержащие pancreata в 37 ° С водяной бане в течение 15 мин.
- Осторожно покачайте трубу и проверить его на ткань диссоциации, убедитесь, что ткань ломается легко, то вихревой трубы 12 раз, а вы держите трубку на крышке.
- Добавить не более 30 мл HBSS (BSA) (это может быть ниже суммы, в зависимости от того, сколько требуется, чтобы сбалансировать труб для центрифугирования), и центрифуги при 290 х г в течение одной минуты.
- Супернатант тщательно и оставить небольшое количество супернатанта (2-3 мл) в нижней части таким образом, чтобы не нарушать клеточный осадок.
- С помощью 30 мл шприца АТТАКHed к 14G игла, добавить не более 10 мл HBSS (BSA) и аспирации подвески вверх и вниз 2 раза.
- Фильтр смесь клеток с помощью пластиковых ситечко в 50 мл трубки и промыть еще 10 мл HBSS (BSA).
- Центрифуга при 330 мкг в течение 2 мин.
- Слейте супернатант и инвертировать трубы для слива на абсорбирующие бумажное полотенце в течение 1 мин.
- Ресуспендируют каждой трубы в 10 мл холодного 1100 Histopaque.
- Перекрытие Histopaque с 10 мл HBSS (BSA) и центрифугируют при 900 х г в течение 18 мин.
- Удалите все 20 мл супернатанта использованием большого диаметра 25 мл пипетки и передать супернатанта через перевернутый 70 мкм фильтр.
- Промойте островков в 10 см блюдо Петри с помощью пипетки 10 мл средства массовой информации островок через фильтр, удерживая ее правой стороной вверх на блюдо.
- Культура островков в 37 ° C, 5% CO 2 культуре ткани инкубатора до готовности к экспериментам. Как правило, островки вручную и считается до экспериментаimentation.
3. Представитель Результаты
Островок дает, морфологии и качества общих параметров, используемых для судить об успехе островок изоляции. В наших руках, островок доходы от средней C57BL / 6 мышей находятся в диапазоне 150-250 островков с помощью этого протокола (см. таблицу 2), и сопоставимы с данными, полученными оптимизированы Sigma типа XI коллагеназы. Тем не менее, выход может меняться в зависимости от используемого штамма мыши и возраст мыши. Большинство животных мы используем в 8-16 неделе возрастной диапазон Этот протокол был протестирован на нескольких линиях мышей, в том числе C57BL / 6 (180-250 островков / мышь), CD1 (200-300 островков / мышь), 129 / B6 (200-300 островков / мышь), BLKS-db/db (120-200 островков / мышь), NOD (10 недельных, 100-150 островков / мышь) и NOD-SCID (100-150 островков / мышь ). Типичная морфология островок показано на рисунке 2, в которой островки имеют круглую в продолговатой формы с относительно одинакового размера (хотя размер юнифуormity может варьироваться от штамма к штамму). Рисунок 3 показывает наш анализ типичных глюкозо-стимулированной секреции инсулина из C57BL / 6 мышей островки выделяли с использованием очищенной TDES против Sigma типа XI коллагеназы. Как правило, высокое качество подготовки островка приводит к стимуляции инсулином при 25 мМ глюкозы, которая 6-20 раз больше, чем наблюдалось в 2,5 мМ глюкозы. Другие приложения могут быть также использованы для проверки качества изолированные островки, и они включают использование perifusion методы, Ca 2 + томография (с Fura2) и обратной транскрипции ПЦР, в частности 11.
Рисунок 1. Резюме катетеризации желчных протоков.
Рисунок 2. Типичный вид C57BL / 6 островков в 24 часов следующих изоляции. Изображения были приобретены впреобразуется микроскопом при 40-кратном увеличении.
Рисунок 3. Глюкоза-стимулированной секреции инсулина C57BL / 6 островков. Через 24 часов следующих изоляции, 100 островков инкубировали в 12-луночных блюдо в течение 1 часа при 37 ° C в Кребса-Рингера HEPES-буферного раствора, содержащего 2,5 мМ глюкозы. Островки затем были переведены в Кребса-Рингера HEPES на 2,5 мМ глюкозы для дополнительного часа, после чего супернатант собирали для инсулина измерения с использованием двух-сайте immunospecific иммуноферментного анализа (ИФА) (Кристалл Chem). То же островки были впоследствии переданы Кребса-Рингера HEPES-буферном растворе, содержащем 25 мМ глюкозы и инсулина в среду измеряли с помощью ИФА через 1 ч инкубации.
Обсуждение
В этом протоколе, мы описали нашу процедура катетеризации, коллагеназы перфузии и диссоциации мышиной поджелудочной железы, с целью выделения островков Лангерганса. Технически, наш метод, овладев, должны обеспечивать изоляцию поджелудочной железы в течение 4 мин эвтаназии животных, и на 1 час должно привести к изоляции островков от одного животного. Быстрота методика позволяет выделить из островков до 12 мышей в типичном участке, в результате чего изоляции до 3000 островков.
В отличие от других протоколов, которые используют сырую препаратов коллагеназы, наш протокол имеет использование очищенных протеаз, CI фермента коллагеназы MA и CI фермента протеазы BP. Изменения в последовательности TDE препараты, которые являются коммерчески доступными требует, чтобы каждая партия индивидуально протестирована и оптимизирована до общего использования. Это много-к-много изменчивость привело нас к рассмотрению использования пуриFied TDES от VitaCyte. Эти высокоочищенного TDES характеризуется несколькими методами, включая применение чувствительных флуоресценции меченых анализы подложки. Анализа флуоресценции CDA более чувствительны к различным молекулярным формам коллагеназы, которые имеют различные кинетики в унижающему достоинство родного коллагена. Историческая пептида анализы субстрата дают неполную оценку коллагеназы. Характеризуя коллагеназы несколькими методами обеспечивает большую активность фермента между партиями.
Исходя из нашего внутреннего тестирования с использованием различных препаратов коллагеназы в продаже, мы обнаружили, что очищенный фермент комбинации дал воспроизводимые многие-к-много результатов. Основными преимуществами использования высокой степени очистки и тщательно характеризуется TDES в этом приложении раз оптимальный состав ферментов определен, многие-к-много производительности согласованность гарантирована. Эта согласованность исключает трудоемкий процесс много квалификация обычно требуетсядля продуктов сырая или обогащенные коллагеназы. Очищенный TDES также включить дополнительные изменения состава для улучшения урожайности и качества островки оправился от различных штаммов мыши. Отчетный оптимальных составов ферментов для выделения островков из разных линий мышей можно более эффективно общались. Это, в свою очередь, приводит к более продуктивного использования ресурсов и повышение гибкости в экспериментальном дизайне.
Есть много важных шагов, которые могут повлиять на исход островок изоляции с помощью нашего протокола. Во-первых, это необходимость обеспечения эффективного инфляции поджелудочной железы во время перфузии ферментного препарата. Важно, чтобы начать инфляции с нежной силой на шприце, а также увеличить силу, как поджелудочная железа раздувается. Это полезно для перемещения кишечника и поджелудочной железы поднять во время инфляции, так что коллагеназы perfuses весь орган. Другим важным шагом является силой, с которой трясет труб AfteГ инкубации при 37 ° C (шаг 2,2). Мы обнаружили, что встряхивая поджелудочной железы трудно против крышку трубки вызывает фрагментацию островки, но без какой-либо механической диссоциации на этот шаг, островок урожаи могут резко упасть. Важно также, что на этапе диссоциации со шприцем (шаг 2,5), среднего уровня сила применяется во время перемещения вверх и вниз с поршнем, что обеспечивает адекватное диссоциации ткани, прежде чем этап фильтрации (2,6), где очень мало ткань должна быть сохранена на сетчатый фильтр чая. И, наконец, последний шаг, чтобы внимательно следить является стремление всего 20 мл Histopaque фракционированного островков. Хотя островков, как правило, на стыке Histopaque и HBSS, мы обнаружили, что мы теряем островков, когда мы пытаемся удалить только интерфейс, вместо этого, мы теперь полностью удалить 20 мл использованием большого диаметра 25 мл пипетки. Мы добавили фильтрацию через перевернутый 70 мкм фильтром (шаг 2,11), чтобы устранить необходимость вentrifuge островки несколько раз, чтобы смыть Histopaque.
Раскрытие информации
NDS, SAT, и RGM нечего раскрывать. Автор AGB работает на VitaCyte. Автор RCM имеет доли участия в VitaCyte.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана грантами NIH R01 DK060581, R01 DK083583 (как в RGM).
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Catalogue # | |||||||||
| 10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
| RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
| BSA | Sigma Aldrich | любой | |||||||||
| Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
| Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
| 4-0 Шовный 100 м рулон | McKesson | 451521 | |||||||||
| 14 г тупым концом иглы | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
| Sciss Vannas Superfine | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
| Изогнутые ножницы весны | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
| Изогнутый пинцет (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
| Изогнутый пинцет (для 90 °) | Средства изобразительных наук | 11052-10 | |||||||||
| 27G 1/2 дюйма иглы | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
| 30G 1/2 дюйма иглы | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
| ПЭ трубы | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
| Коллагеназа MA | Vitacyte, ООО | 001-2030 | |||||||||
| СиP протеазы | Vitacyte, ООО | 003-1000 | |||||||||
| 3 мл шприц | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
| 30 мл шприца | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
| 70 мкм фильтр | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
| 10 см 2 Петри | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
| Пластиковые ситечко | Любая кухня питания | ||||||||||
| Таблица 1. Реактивы и оборудование | |||||||||||
| |||||||||||
Таблица 2. Средняя урожайность островок (± SD) с использованием разных серий TDE * * Данные представляют собой средние урожаи островок, по крайней мере 10 мышей. Лот цифры в скобках |
Ссылки
- Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Liang, Q. -L., Dai, L. -J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J. Vis. Exp. (7), e255(2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096(2011).
- Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. Experience of islet isolation without neutral protease supplementation. Islets. 2, 278-282 (2010).
- Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation. Cell Transplant. , Forthcoming (2012).
- McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation. Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).
- Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets. Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).
- Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting. Transplantation. 51, 566-570 (1991).
- McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran. Islets. 3, 144-149 (2011).
- Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment. Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).
- Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure. Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).
Перепечатки и разрешения
