Методическая статья

13.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4166

⸱

15 августа 2012 г.

 ,  ,  ,  , 
1Infectious Disease Research Center, CHUL (CHUQ), Quebec City, Quebec, Canada

В этой статье

Краткое содержание

Мы разработали В пробирке Малярии, ВИЧ-1, ко-инфекции моделью для изучения влияния Plasmodium тропической На ВИЧ-1 репликативного цикла в человеческой первичной моноцитарных макрофагов. Эта универсальная система может быть легко адаптирована для других первичных типов клеток восприимчивы к ВИЧ-1 инфекции.

Аннотация

Plasmodium тропической, возбудителя смертоносной формы малярии, и вирус иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) являются одними из наиболее важных проблем со здоровьем во всем мире, которая отвечает за в общей сложности 4 миллиона смертей ежегодно 1. Благодаря своим обширным перекрытия в развивающихся странах, особенно в странах Африки южнее Сахары, сопутствующие инфекции, больных малярией и ВИЧ-1 являются общими, но взаимодействие между этими двумя заболеваниями плохо. Эпидемиологические отчеты показали, что малярийной инфекции временно повышает репликации ВИЧ-1 и увеличивает ВИЧ-1, вирусная нагрузка в сотрудничестве инфицированных 2,3. Потому что это виремии остается высоким в течение нескольких недель после лечения противомалярийные препараты, это явление может оказывать влияние на прогрессирование заболевания и передачи.

Клеточные механизмы иммунологической за эти наблюдения были изучены только вряд ли. Несколько в лабораторных исследованиях investigating воздействия малярии на ВИЧ-1 показали, что воздействие растворимых малярийных антигенов может увеличиться ВИЧ-1 инфекции и реактивации в клетки иммунной системы. Однако, эти исследования использовали весь клеточных экстрактов П. тропической шизонт стадии паразитов и мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), что делает его трудно расшифровать который малярийных компонент (ы) был ответственен за наблюдаемый эффект и то, что клетки-мишени хозяин был 4,5. Недавние исследования показали, что воздействие на незрелый моноцитарных дендритные клетки малярийного пигмента hemozoin увеличить их способность переносить ВИЧ-1 в CD4 + Т-клеток, 6,7, но она уменьшилась ВИЧ-1 инфекции макрофагов 8. Чтобы пролить свет на этот сложный процесс, систематический анализ взаимодействий между паразитами малярии и ВИЧ-1 в различных соответствующих первичных человеческих клеточных популяций крайне необходимо.

Несколько методов для исследования влияния HIV-1 на фагоцитоз микроорганизмов и влияние таких патогенов на репликации ВИЧ-1 были описаны. Мы здесь представляем метод изучения влияния P. тропической-инфицированных эритроцитов на репликацию ВИЧ-1 в человеческой первичной моноцитарных макрофагов. Влияние паразита воздействия на ВИЧ-1 транскрипционных / поступательного событий контролировать с помощью одного цикла pseudotyped вирусов, в которой ген люциферазы корреспондент сменил гена Env в то время как влияние на количество вируса выпущена инфицированных макрофагов определяется путем измерения ВИЧ-1 белок капсида p24 с помощью ИФА в ячейке супернатантах.

Протокол

Примечание: Эксперименты с ВИЧ-1 и Plasmodium тропической должны быть выполнены в надлежащем уровня биобезопасности лабораторий (BSL2 для паразитов и BSL3 для ВИЧ-1 и сопутствующих инфекций) и специальные меры предосторожности должны быть приняты при использовании потенциально зараженной крови человека.

1. Мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) очистки (на 8 и 9)

  1. Начать со свежей человеческой крови здоровых доноров (500 мл), получавших антикоагулянты (гепарин, цитрат, кислота или цитрат декстрозы цитратом фосфата декстрозы). Используйте эндотоксин без реагентов при очистке и изоляции РВМС и на протяжении всего протокола.
  2. Лечить кровью мешок, в том числе труб, 70% этанолом, разрезать трубу и аккуратно передавать кровь в T150 колбу.
  3. Подготовить 16 труб с 15 мл Разделение лимфоцитов Средний (Ficoll) в 50 мл коническую трубку (чтобы убедиться, что Ficoll до комнатной температуры).Тщательно слой 30 мл свежей крови на вершине.
  4. Центрифуга 400 мкг в течение 30 мин при 20 ° С с обрывается.
  5. Во время центрифугирования, готовить 8 х 50 мл конические пробирки с 25 мл сбалансированного соль комнатной температуры Хэнка Решение (HBSS) в трубе.
  6. Тщательно передать облачно кольцо клетки на уровне интерфейса (содержит МКПК) в 50 мл пробирку, содержащую HBSS (бассейн 2 кольца ячейки в трубку). Заполните объемом до 50 мл HBSS.
  7. Центрифуга 150 мкг в течение 15 мин при 20 ° С с перерывами на.
  8. Во время центрифугирования облачно кольцо клетки, собирать желтые верхний слой из Ficoll шаг, бассейн плазмы пополнить 50 мл коническую трубку. Деактивировать дополнение в плазме крови при нагревании в 50 мл трубы на 56 ° C в течение 30 мин и спина 10 мин при 1800 х г. Держите супернатант (содержит разбавляют аутологичной плазмы, которые могут быть использованы в качестве добавки в среду поздно шагов).
  9. Осторожно удалите супернатант и resuspenг осадок клеток с шагом 1,7 в 25 мл HBSS и бассейн 2 окатышей на 50 мл трубку. Спиновая 300 мкг в течение 8 минут при температуре 20 ° C.
  10. Удаляют супернатант тщательно и ресуспендирования гранул в 10 мл HBSS и бассейн в одном 50 мл трубку.
  11. Возьмите аликвоту выполнить трипанового синего исключение для оценки смертности, а затем рассчитывать PBMC.
  12. Полный объем до 50 мл HBSS и спина 10 минут при 300 х гр. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в RPMI 1640 в 5х10 6 кл / мл (необходимо получить около 400-500 х 10 6 МКПК от 500 мл крови).

2. Моноциты-макрофаги производных (MDM) Дифференциация (на 8 и 9)

  1. Семенной приблизительно 1,25 х 10 8 МКПК в 15 см блюда с RPMI 1640 (25 мл / блюдо).
  2. Давайте придерживаться клетки в течение 1-2 часов при температуре 37 ° C с 5% CO 2 атмосферы.
  3. Передача, не придерживался клеток в новой колбы и промыть пластины с 15 мл эндотоксина без PBS в два раза (5мин, 300 мкг). Придерживаться клетки изолированных моноцитов.
  4. Чтобы свежевыделенных моноцитов дифференцироваться в МДМ, добавить 20 мл RPMI 1640 с добавлением 5% аутологичной плазмы (из шага 1.8). Добавить человеческий рекомбинантный макрофаг колониестимулирующий фактор (M-CSF, 25 нг / мл) и пенициллина / стрептомицина решение (PS, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина). Выдержите в течение 2 дней, изменение средних и инкубировать 2-3 дополнительных дня при температуре 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы.
  5. Удалите старый средний и промыть эндотоксин без PBS раз, добавьте PBS мягко и аспирации немедленно. Чтобы отключить полностью дифференцирована МДМ, лечить клетками с ~ 7 мл Accutase (Accutase, имеющихся в продаже смесь протеаз и коллагенолитических деятельности, которые позволяют отряд клеток из пластиковой тарелки) в течение 15-20 минут при температуре 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы, мягко рок в середине времени.
  6. Добавить 3-5 мл аутологичной плазмы (с шагом 1.8) в каждой пластины (для защиты клеток,выскабливание).
  7. Аккуратно очистить клетки убедившись, что среда охватывает клетки во все времена и передачи / бассейн в 50 мл трубку.
  8. Промыть пластины с эндотоксина без PBS восстановить столько ячеек, сколько возможно.
  9. Спином 5 мин при 200 мкг, отказаться от супернатант.
  10. Ресуспендируйте гранул в 5 мл МДМ питательной среды (RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной дополнение эмбриональной телячьей сыворотки (IFBS), PS, 25 HEPES мМ) и подсчет клеток (МДМ дают обычно 2-8% от общего числа МКПК). Примечание: аликвоту МДМ могут быть приняты на этом этапе для оценки чистоты популяции клеток с помощью проточной цитометрии, обычно 99% полученных МДМ-экспресс CD14.
  11. Семенной 1x10 5 МДМ в 600 мкл МДМ культуральной среде на лунку в 24-луночных планшетах.
  12. Выдержите в течение ночи при 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы перед инфекциями.

3. Производство и количественный ВИЧ-1 Вирусные акции

  1. Продукция вирусной акции, используя трансфекцию фосфата кальция в клетках HEK293T ФоллоКрыло протокола Фортин и соавт. 10.
  2. Для того чтобы получить один цикл, содержащий вирусы люциферазы кодирование гена-репортера, со-трансфекции клеток HEK293T либо 20 мкг NL4.3 Люк + Env - R + и 10 мкг pHCMV-G, или 15 мкг NL4.3 Люк + Env - R + и 15 мкг pJRFL окр. Использование 30 мкг NL4.3 Люк + Env - R + для получения контроля гликопротеин с дефицитом вирусов. Для полного вируса репликативной, использовать 30 мкг NL4.3Bal окр. Векторов pHCMV-G и pJRFL окр кодирования конверт гликопротеинов вируса везикулярного стоматита (VSV-G) и CXCR5-тропные штаммы ВИЧ-1 (отличается от NL4.3Bal ENV), соответственно. Дополнительная информация о плазмиды могут быть получены из 8. Плазмиды могут быть получены через NIH исследований СПИДа и справочные программы (NIAID, NIH).
  3. Количественная всех вирусных акций с помощью ИФА на ВИЧ-1, p24 белок капсида 11, И проверить их инфекционным потенциал перед использованием. Мы оцениваем инфекционной наших запасов вируса с помощью ТЗМ-BL индикаторных клеток 12.

4. Культура плазмодии тропической (по 13)

4.1 Общие культуры и обслуживание паразитов

  1. Поддерживать P. тропической 3D7 бесполого паразитов этап в эритроцитах человека (группа крови O +) на 4%, гематокрита в RPMI 1640 (буфере с 25 мМ HEPES и 25 мМ NaHCO 3) с добавлением 0,5% (вес / объем) Albumax II, 25 мкг / мл гентамицина и 370μM гипоксантин при 37 ° C в газовой смеси 1% кислорода / 5% углекислого газа в атмосфере азота.
  2. Паразитемии можно контролировать, сделав тонкий слой культуры и окрашивание с 15% Гимза решение.
  3. Всегда сохранять неинфицированных эритроцитов (УрБК) культуры блюдо в тех же условиях, как паразиты использовать в качестве контроля.
    Для получения конце parasit этапES (трофозоиты / начале шизонты), синхронизировать паразитов следующим образом:

4,2 паразитов синхронизации

  1. Утром, собрать паразитов культуры, спина 5 мин при 300 мкг и отказаться от супернатант.
  2. Ресуспендируйте гранулы упакованные в 5 объемах ячейки с 5% (вес / объем) D-сорбит и инкубировать 5 минут при 37 ° C.
  3. Спином 5 мин при 300 х г, отказаться от супернатанта Ресуспендируйте гранул в 30 мл культуральной среды и положить обратно в инкубатор.
  4. Около 8 часов позже, повторите шаги с 4.2.1 до 4.2.3, чтобы получить тесно синхронизирован паразитов. Поздняя стадия паразитов (трофозоиты / начале шизонты) может быть собран на следующее утро для проведения эксперимента. Перед очисткой, выполняют Гимза окрашивания, чтобы подтвердить этапов жизненного цикла.

4,3 Plasmodium тропической-инфицированных красных кровяных телец (iRBC) очистка

  1. Стерилизовать сепаратор VarioMacs (в режиме ожидания и магнит) с 70% этанола и ркружева под биологических капотом.
  2. Закрепите трехходового крана вниз колонка CS.
  3. Отрежьте конец иглы защитник пластика с Miltenyi специальный резак и закрепить иглу на дно краном.
  4. Закрепить столбец в магнит тщательно.
  5. Удалите все пузырьки воздуха в колонке медленно инъекционные 10 мл питательной среды MDM с комплектом корпусе шприца привинчен слева от крана.
  6. Промойте колонку с ~ 20 мл питательной среды MDM.
  7. Урожай РБК от культуры плиты, мыть один раз 10 мл МДМ среднего (300 мкг, 5 мин) и ресуспендирования РБК гранул в 12 мл культуральной среды MDM. Постепенно добавить к колонке, и пусть подвески потока через (только зараженные эритроциты крови, содержащей паразитов в трофозоита или шизонт этапе будут сохранены с помощью магнитного поля в связи с наличием кристаллов hemozoin).
  8. Промыть раз с 20 мл среды и остановить поток жидкости, когда она достигает белый диск на вершине колонны.
  9. Удалите столбец из магнита и элюируются iRBC в чистую стерильную пробирку с 12 мл питательной среды MDM.
  10. Мазок аликвоту восстановленные iRBC и выполнять Гимза окрашивания, чтобы подтвердить этапов жизненного цикла.
  11. Граф восстановления iRBC помощью гемоцитометра (изолированные РБК на 100% iRBC).
  12. Гранул клеток (300 мкг, 5 мин), супернатант отказаться и лечения клеток с 500 мкл свежей AB + сыворотки крови человека (opsonisation шаг 14).
  13. Инкубировать 30 мин при 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы.
  14. Мыть раз в 10 мл культуральной среды MDM (300 х г, 5 мин), и ресуспендируют iRBC в нужной концентрации. Как правило, 10% паразитемии 15 см культуры блюдо дает примерно ~ 0.5-1x10 8 жестко синхронизированы iRBC.

5. Воздействие МДМ Plasmodium тропической

  1. Чтобы разоблачить МДМ УрБК или iRBC, клетки должны быть ресуспендируют в культуральной среде, МДМ, чтобы получить соотношение УрБК / iRBC: МДМ 75:1. В ранееподготовленный 24-луночных содержащей МДМ, добавить соответствующие подвески РБК объем в каждую лунку. Выполните все эксперименты в трех экземплярах.
  2. Инкубируйте совместно культур в течение 4 часов при температуре 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы.
  3. Промойте клетки с 600 мкл эндотоксина без PBS 3 раза, добавить PBS мягко и аспирации немедленно.
  4. Лизировать оставшиеся РБК, промыть лунки, добавляя 200 мл ледяной стерильной водой в течение 20 сек и аспирации.
  5. Добавить 600 мкл культуральной среды MDM и инкубировать 24 часа при 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы.

6. Инфекция с МДМ Полностью репликативной ВИЧ-1

  1. Для того, чтобы оценить влияние П. тропической по репликации ВИЧ-1 в МДМ, добавим, согласно схеме, изложенной в рис. 1А, 10 нг p24 (в 300 мкл МДМ-СМИ) NL4.3Bal вирусов окр в соответствующие лунки, добавить только МДМ-среды в управление скважин .
  2. Инкубировать 2 часа при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы.
  3. Промойте клетки эндотоксин без PBS 3 раза, добавить PBS мягко и аспирации немедленно. Добавить 600 мкл свежей среды MDM на лунку.
  4. Инкубировать при температуре 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы.
  5. В дни 3, 6, 9 и 12 после начала вирусной инфекции, урожай 200 мкл каждого супернатанта, добавив 200 мкл свежей среды MDM в дальнейшем. Хранить собранных супернатантах при температуре -20 ° С для количественного определения основных ВИЧ-1 капсида p24 белка ИФА после Фортин и соавт. 10.

7. Заражение МДМ с одиночной люциферазы вирусов Кодирование цикла

  1. Для того чтобы определить влияние паразита на ВИЧ-1 экспрессии генов в МДМ, добавим, согласно схеме, изложенной на рисунке 1В, 10 нг p24 (в 300 мкл среды MDM) либо NL4.3 Люк + Env - R + ( VSV-G), NL4.3 Люк + Env - R + (JRFL ENV) или NL4.3 Люк +Env - R + вирусы в соответствующие лунки.
  2. Инкубировать 2 часа при 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы.
  3. Промойте клетки с 600 мкл эндотоксина без PBS 3 раза, добавить PBS мягко и аспирации немедленно. Добавить 600 мкл свежей среды MDM на лунку.
  4. Инкубировать при температуре 37 ° С в 5% CO 2 атмосферы.
  5. Удалите среду 72 часа после инфицирования и добавить 200 мкл лизирующего буфера 1X (поставляется вместе с комплектом люциферазы анализ). Пусть лизировать клетки при комнатной температуре с нежным тряски. Хранить при температуре -20 ° C.
  6. Таяние пластины и передать 40 мкл лизата на 96 лунок люминометра пластины, добавить 100 мкл субстрат люциферазы (поставляется вместе с комплектом люциферазы анализ) и измерить люциферазы (Firefly люциферазы) деятельность в люминометра в соответствии с инструкциями производителя.

8. Представитель Результаты

Используя наш ко-инфекции модели, мы покажем, что exposurе П. тропической МДМ снижает их восприимчивость к ВИЧ-1 инфекции. Действительно, значительное снижение (р <0,05, 2 дисперсионного анализа, 12-й день) в выпуске вирусных частиц, измеряемая ВИЧ-1, p24 белок капсида в супернатанте, наблюдается в МДМ предварительно с паразитами (рис. 2A). Это наблюдение подтверждается в клетках, инфицированных вирусами кодирования люциферазы-ген-репортер. МДМ-инфекции с такими вирусами укрывательство или экзогенных VSV-G или ВИЧ-1 гликопротеинов приводит к достоверно (р <0,05, Стьюдента-тест) меньше люциферазы в клетках подвергаются P. тропической (рис. 2В). Стоит отметить, что VSV-G-pseudotyped вирусов дали гораздо больше активности люциферазы, чем их коллеги JRFLenv, это связано с большей эффективностью инфекции VSV-G pseudotyped частиц 15. Учитывая, что паразит экспозиции МДМ последствия обоих типов вирусов, это говорит о том, что он влияет на каком-то шаге вирусной бывший генВыражение (рис. 2В). Важно также отметить, что жизнеспособность клеток не зависит от МДМ-экспозиция iRBC (данные не представлены), что указывает на торможение наблюдается является специфическим и не за счет клетки смертности.

figure-protocol-1
Рисунок 1. А) плиты схему МДМ-инфекции вирус полностью репликативной Мок. Неинфицированных клеток. УрБК: клетки подвергаются неинфицированных эритроцитов. iRBC: клетки подвергаются Plasmodium тропической-инфицированных красных кровяных телец. Баль: клетки, инфицированные NL4.3Bal окр Бал / УрБК. Клетки подвергаются УрБК и инфицированных NL4.3Bal окр Бал / iRBC.. Клетки подвергаются iRBC и инфицированных с NL4.3Bal окр б) плиты схему МДМ-инфекции один цикл люциферазы кодировки вирусов Мок. неинфицированных клеток. УрБК: клетки подвергаются неинфицированных эритроцитов. iRBC: клетки подвергаются Plasmodium тропической-яnfected красных кровяных телец. Δenv: клетки, инфицированные NL4.3 Люк + Env - R + JRFL. Клетки, инфицированные NL4.3 Люк + Env - R + (JRFL ENV). VSV-G: клетки, инфицированные NL4.3 Люк + Env - R + (VSV-G) Δenv / УрБК.. клетки подвергаются УрБК и инфицированных NL4.3 Люк + Env-R + Δenv / iRBC: клетки подвергаются iRBC и инфицированных NL4.3 Люк + Env - R + JRFL / УрБК: клетки подвергаются УрБК и инфицированных NL4.3 Люк + Env - R + (JRFL ENV).. JRFL / iRBC: клетки подвергаются iRBC и инфицированных NL4.3 Люк + Env - R + (JRFL ENV). vsv-g/uRBC: клетки подвергаются УрБК и инфицированных NL4.3 Люк + Env - R + (VSV-G) vsv-g/iRBC. клетки подвергаются iRBC и инфицированных NL4.3 Люк + Env - R + (VSV-г).

figure-protocol-2
Рисунок 2. .) Влияние Plasmodium тропической на ВИЧ-1 вирусной продукции в МДМ МДМ подвергались УрБК или iRBC в соотношении 75:1 (УрБК / iRBC: MDM) в течение 4 часов и широко мыть. Клетки были заражены 10ng из NL4.3Bal окр p24 в течение 2 часов. Вирусный производство контролировалось с помощью ИФА на ВИЧ-1, p24 в бесклеточной надосадочной в различные моменты времени после первоначального вирусной инфекции. Представитель эксперимент показал B) Влияние Plasmodium тропической на ВИЧ-1 вирусной транскрипции в МДМ МДМ были инфицированы УрБК или iRBC в соотношении 75:1 (УрБК / iRBC.. MDM). Затем клетки, инфицированные 10ng р24 одного цикла вируса (или NL4.3 Люк + Env - R +, NL4.3 Люк + Env - R + (JRFL ENV) или NL4.3 Люк + Env - R + (VSV- г)). Люциферазы выражении оценивалась в клеточных лизатов 72 часа после заражения вирусом. Представитель эксперимента.

Обсуждение

Мы продемонстрировали здесь два различных подхода к анализу влияния малярии на ВИЧ-1 цикла вируса, то есть на основе анализа или экспрессии вирусных генов или потомство производства вирусов и репликации в моноцитарных макрофагов. Аналогичные подходы были использованы для других ВИЧ-1-паразит со-инфекции 16. Однако, эти новые данные являются шагом вперед в исследовании малярии ВИЧ-1, со-инфекции. . Действительно, Diou и др. 8 изучали влияние hemozoin, а не живых паразитов, по репликации ВИЧ-1, в согласии с нашими результатами, они отметили, что hemozoin сама, достаточном для ингибирования вирусной производство МДМ, а не MDMs.

Использование описанного экспериментального макета, мы обнаружили, что P. тропической оказывает четкое негативное воздействие на ВИЧ-1 репликативного цикла в макрофагах: значительное снижение вирусной производства наблюдается в макрофагах предварительно подвергается паразиты (FigurE 2A) и конкретного воздействия паразита на вирусную транскрипцию показано на рисунке 2Б. Тем не менее, мы не можем оставить какие-либо дополнительные эффекты паразита на проникновении вируса в клетку или синтеза (decapsidation), либо на пост-интеграционных механизмов, таких, как синтез белка или вирусной частицей и сборка почкования. Кроме того, не исключено, что различное влияние на репликации ВИЧ-1 может быть получено, если паразиты были добавлены или одновременно или после инфекции МДМ-вирусом.

Наши в пробирке ко-инфекции модель представляет собой мощный инструмент для выполнения детальных исследований ВИЧ-1 / P. тропической взаимодействия в клетке-хозяине. Например, комбинация этой экспериментальной схемы с другими методами, таких как количественный ПЦР в реальном времени, которая может определять и количественно конкретные шаги в вирусной retrotranscription и вирусных интеграции генома в геном клетки-хозяина, вполне осуществимы и должны дать дальнейшие ИНСИghts в механизмы, участвующие в совместной инфекции. Кроме того, конкретные тесты для оценки ранних стадиях цикла вируса (вирусная синтеза, decapsidation начального количественного) могут быть применены к этой основной протокол для дальнейшего анализа влияния на репликацию вируса. Эти изменения показывают, насколько гибкой этот протокол в отношении ВИЧ-1 и количественного охвата: в самом деле, даже стандартные ВИЧ-1 обратная транскриптаза анализов количественного использованием меченных тритием нуклеотидов вполне может заменить ИФА на ВИЧ-1, p24. В дополнение к МДМ, мы ожидаем, что наша система была адаптирована к другим типам клеток отношение к ВИЧ-1, малярии взаимодействия, такие как моноциты и дендритные клетки. Тот факт, что МДМ являются приверженцем клеток способствует их манипуляции, что позволяет легко вымывания iRBC, которые не были приняты, или которые находятся в контакте с МДМ, не устраняя любую макрофагов. Такое преимущество не будет применяться к дендритные клетки и моноциты, которые культивируются в виде суспензии, усложняя себеторных из УрБК и свободный iRBC с такими клетками, и мы в настоящее время решения этого вопроса. Наша система также может быть полезна для изучения более сложных взаимодействий, таких как последствия Plasmodium, подвергшихся воздействию моноцитарных клеток на ВИЧ-1 цикла вируса в другие клетки иммунной системы, такие как CD4-положительные Т-клетки совместно культуры экспериментов. Наконец, наш протокол может быть подходящим для экспериментов смотря на влияние П. тропической iRBCs на ВИЧ-1, реактивация в МКПК для ВИЧ-1-инфицированных лиц.

Этика заявление

МКПК человека были получены из крови здоровых доноров, в соответствии с руководящими принципами Комитета по биоэтике больничного центра де l'Université Laval исследовательский центр. Письменное согласие было получено от всех доноров крови.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа выполнена при финансовой поддержке Канадского института исследований в области здравоохранения через Catalyst Co-инфекции и сопутствующих заболеваний гранта. Эритроцитов человека были предоставлены больничного центра де l'Université Laval банк крови.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер по каталогу Комментарии
RPMI 1640 Multicell 350-000-CL
PBS-эндотоксина бесплатно Сигма D8662
FBS Зубр 080-150 Тепло-инактивируется при 56 ° C в течение 30 минут
Accutase eBiosciences 00-4555-56
Albumax II Гибко 11021-037 Растворенный в RPMI 1640, фильтр-стерилизованное
Лимфоцитов среднего отделение Multicell 305-010-CL
Белые пластины люминометра Promega Z3291
CS Маки разделение columms Miltenyi Biotech 130-041-305
VarioMacs сепаратор Miltenyi Biotech 130-090-282
Пенициллина / стрептомицина решение Зубр 450-201-EL
D-сорбита Sigma-Aldrich S1876
Сотовые скребком (25 см) Sarstedt 83,1830
24-луночных культуре клеток BD Сокол 353047
150 х 20 мм культуры блюдо Sarstedt 83.1803.003
M-CSF Genscript Z02001
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Сыворотка крови человека AB + Долина биомедицинских HP1022
HBSS Зубр 311-505-CL
Гентамицин Sigma-Aldrich G1397
Гипоксантин Sigma-Aldrich H9636
NaHCO 3 Sigma-Aldrich S5761
Анализ системы люциферазы Promega E1500
Эритроциты человека Полученный очищенный от Чул банк крови.

Ссылки

  1. WHO. World Malaria Report. , (2005).
  2. Kublin, J. G., Patnaik, P., Jere, C. S. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365, 233-240 (2005).
  3. Cuadros, D. F., Branscum, A. J., Crowley, P. H. HIV-malaria co-infection: effects of malaria on the prevalence of HIV in East sub-Saharan Africa. Int. J. Epidemiol. 40, 931-939 (2011).
  4. Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. J. Infect. Dis. 177, 437-445 (1998).
  5. Froebel, K., Howard, W., Schafer, J. R. Activation by malaria antigens renders mononuclear cells susceptible to HIV infection and re-activates replication of endogenous HIV in cells from HIV-infected adults. Parasite Immunol. 26, 213-217 (2004).
  6. Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. Dendritic cells derived from hemozoin-loaded monocytes display a partial maturation phenotype that promotes HIV-1 trans-infection of CD4+ T cells and virus replication. J. Immunol. 184, 2899-2907 (2010).
  7. Diou, J., Tardif, M. R., Barat, C., Tremblay, M. J. Malaria hemozoin modulates susceptibility of immature monocyte-derived dendritic cells to HIV-1 infection by inducing a mature-like phenotype. Cell Microbiol. 12, 615-625 (2010).
  8. Diou, J., Gauthier, S., Tardif, M. R. Ingestion of the malaria pigment hemozoin renders human macrophages less permissive to HIV-1 infection. Virology. 395, 56-66 (2009).
  9. Davies, J. Q., Gordon, S. Isolation and culture of human macrophages. Methods Mol. Biol. 290, 105-116 (2005).
  10. Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity. J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).
  11. Bounou, S., Leclerc, J. E., Tremblay, M. J. Presence of host ICAM-1 in laboratory and clinical strains of human immunodeficiency virus type 1 increases virus infectivity and CD4(+)-T-cell depletion in human lymphoid tissue, a major site of replication in vivo. J. Virol. 76, 1004-1014 (2002).
  12. Wei, X., Decker, J. M., Liu, H. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).
  13. Trager, W., Jensen, J. B. Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193, 673-675 (1976).
  14. Turrini, F., Ginsburg, H., Bussolino, F., Pescarmona, G. P., Serra, M. V., Arese, P. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected human red blood cells by human monocytes: involvement of immune and nonimmune determinants and dependence on parasite developmental stage. Blood. 80, 801-808 (1992).
  15. Akkina, R. K., Walton, R. M., Chen, M. L., Li, Q. X., Planelles, V., Chen, I. S. High-efficiency gene transfer into CD34+ cells with a human immunodeficiency virus type 1-based retroviral vector pseudotyped with vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein G. J. Virol. 70, 2581-2585 (1996).
  16. Zhao, C., Papadopoulou, B., Tremblay, M. J. Leishmania infantum enhances human immunodeficiency virus type-1 replication in primary human macrophages through a complex cytokine network. Clinical Immunol. 113, 81-88 (2004).

Перепечатки и разрешения

Теги

Макрофагиполученные из моноцитованализ репликации ВИЧ-1определение p24 методом ИФАлюциферазная репортерная системавоздействие инфицированных эритроцитовметод изоляции VEACсбор вирусного супернатантаколичественное определение люциферазы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.