Гальванотаксис пробирного анализа нейронных клеток-предшественников Кинетика миграции извне постоянного тока электрическое поле

Краткое содержание

В этом протоколе мы покажем, как для создания пользовательских камер, что позволяет применять постоянный ток электрического поля для включения покадровой визуализации мозга взрослого человека, полученных нейронных перемещение клеток-предшественников во время гальванотаксиса.

Аннотация

Открытие нервных стволовых и клеток-предшественников (в совокупности называемые нейронные клетки-предшественники) (НПС) во взрослом мозге млекопитающих привело к телу исследований, направленных на использование мультипотентных и пролиферативных свойств этих клеток для развития neuroregenerative стратегии. Важным шагом для успеха такой стратегии является мобилизация NPCs к поражению сайта после экзогенной трансплантации или для усиления ответа эндогенных предшественников, которые находятся в перивентрикулярной области ЦНС. Соответственно, она имеет важное значение для понимания механизмов, которые способствуют, направлять и повышения NPC миграции. Наша работа сосредоточена на использовании постоянного тока электрических полей (dcEFs) оказывать содействие и прямое миграции НИП - явление, известное как гальванотаксиса. Эндогенные физиологической электрического поля действовал в качестве критических сигналов для миграции клеток во время нормального развития и заживления ран. Фармакологические нарушениятранс-нервной трубки потенциал в аксолотля эмбрионов вызывает тяжелые пороки развития ^1. В контексте заживления ран, скорость ремонта ранения роговицы напрямую связана с величиной эпителиальных потенциал рану, которая возникает после травмы, как показано с помощью фармакологических повышение или нарушение этого dcEF ^2-3. Мы показали, что взрослые subependymal NPCs пройти быструю и направлены катодная миграции в пробирке при воздействии извне dcEF. В этом протоколе описываются методы нашей лаборатории для создания простых и эффективных гальванотаксиса анализа высокого разрешения, долгосрочное наблюдение направлено перемещение тела клетки (миграции) на одном-клеточном уровне. Этот анализ был бы подходящим для исследования механизмов, которые регулируют dcEF трансдукции в клеточную подвижность за счет использования трансгенных мышах или, коротко интерферирующих РНК, или специфических агонистов рецептора / антагонистов.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными обращения были одобрены Университета Торонто комитета по Уходу за животными в соответствии с руководящими принципами институциональной (протокол №. 20009387). Следующие методы должны быть выполнены с использованием стерильных инструментов и методов, в ламинарном потоке, где это применимо.

В протоколе ниже текст, фраза "EFH-SFM" относится к бессывороточной среде с эпидермальный фактор роста, основной фактор роста фибробластов и гепарин. EFH-SFM используется при исследовании гальванотаксиса недифференцированных NPCs, потому что эти митогены поддерживать NPCs в их недифференцированное ⁴ состояние. При исследовании гальванотаксиса НПС вызвать их дифференцировку в зрелые типы клеток, "FBS-SFM" относится к бессывороточной среде с 1% эмбриональной телячьей сыворотки. FBS способствует дифференциации NPCs в зрелые нейронных фенотипов ^5.

1. Выделение и культуры нейронных прекурсоров (Непоказано на видео)

1. Анестезировать CD1 мыши (6-8 недель) с isofluorane и жертвы с помощью смещения шейных позвонков.
2. Окунуть голову в 70% этанола и обезглавить животное с острыми ножницами рассечение.
3. Удерживая голову с хирургическими щипцами, снимите кожу на спинной поверхности, чтобы разоблачить черепа.
4. С помощью скальпеля и нет. 11 лезвие, забить черепа в лобной пазухи по медиолатеральная оси, а также вдоль сагиттального шва в rostrocaudal направлении.
5. Пил теменной кости от головы нет. 7 изогнутый пинцет, стараясь не проколоть ткани головного мозга.
6. Вставьте тонкий шпатель под мозг, начиная с под мозжечком и продвижения к обонятельной луковицы. Удерживая черепа в месте с пинцетом, осторожно потяните мозг из черепа и сразу же поместить его в ледяной искусственной цереброспинальной жидкости (см. рецепты ниже).
7. Под микроскопом рассечение, используя стерильныерассечение ножницами и щипцами разрезать мозг пополам вдоль средней линии. Поворот каждого полушария, так что медиальная (разреза) поверхность обращена вверх.
8. Выберите полушарии, а с медиальной поверхности, обращенной вверх, найдите Валик мозолистого тела (задней области мозолистого тела).
9. Сделать разрез от поверхности коры на валик мозолистого тела вдоль оси дорсовентральных.
10. Пил надрезанные коры к обонятельной луковице, чтобы разоблачить медиальная и боковые стенки бокового желудочка.
11. Поверните полушарии, так что спинной поверхности обращена вверх, и использовать изогнутые microscissors вырезать и собирать подвергается медиальная и боковые стенки, которые содержат перивентрикулярной регионе, где проживают NPCs ^6.
12. Повторите шаги 1.8-1.11 для другого полушария.
13. Внесите изолированной ткани в 7 мл раствора трипсина (см. рецепт ниже), в 15 мл трубки, и поместить трубку на качалке при 37 ° Cинкубаторе в течение 25 мин.
14. Центрифуги трубы на 1500 оборотах в минуту в течение 5 минут, аспирации супернатант и ресуспендируют ткани в 2 мл раствора ингибитора трипсина (см. рецепт ниже).
15. Аккуратно растереть ткань с небольшой скважины пипетки Пастера в 30-50 раз тщательно, чтобы избежать воздушных пузырей.
16. Центрифуги трубы на 1500 оборотах в минуту в течение 5 минут, аспирации супернатант и ресуспендируют в 1-2 мл SFM (см. рецепт ниже) путем растирания гранул 3-5 раз.
17. Центрифуги трубы на 1500 оборотах в минуту в течение 3 минут, аспирации супернатант и ресуспендируют в 1 мл SFM + EFH.
18. Граф жить плотность клеток с гемоцитометра и пластины клеток в культуре T25 колбу с плотностью 10 клеток на мкл в SFM + EFH.
19. Разрешить культуры расти в течение 7 дней спокойно, получая свободно плавающих первичных нейросферы состоит из NPC.

2. Гальванотаксис палаты подготовка

1. Поместите 3 квадратных стекла нет. 1 скользит крышкой (22 х 22 х 0,17 мм) яН.А. бутылку 6N соляной кислоты в течение ночи.
2. На следующий день, используйте алмазный наконечник стеклянной Для обрезки 6 прямоугольных полос (22 х 5 х 0,17 мм) стекла от площади нет. 1 скользит крышкой.
3. Передача кислотно-промытый квадратных и прямоугольных скользит скользит в ламинарном боксе. Вымойте прямоугольные и квадратные полоски сначала с 70% этанола, то с тканевой культурой класса автоклавного водой, и дайте высохнуть на Ким Wipe (для большей стерильности, стекло может быть разрешено сухой воздух).
4. Применение вакуумной смазкой по периметру одной поверхности квадратных предметные стекла, и запечатать их до основания 60 мм, пластиковые чашки Петри.
5. Применение вакуумной смазки вдоль длинной оси, одна из поверхностей прямоугольной полоски стекла, и запечатать их к противоположным краям площади предметные стекла (например, что они параллельны друг другу), чтобы создать центральный желоб.
6. УФ-стерилизации камеры, по крайней мере 15 минут в ламинарном боксе.
7. Внесите 250-300 мкл поли-L-Лисипе на центральную впадину камер и инкубировать при комнатной температуре в течение 2 часов.
8. Примерно за 15 мин до окончания инкубационного периода, приготовления раствора Matrigel (см. рецепт ниже).
9. Аспирируйте поли-L-лизин, мыть центрального желоба с 1 мл автоклавного воды и пипеткой 250-300 мкл Matrigel раствора на центральной впадины.
10. Инкубируйте камерах при температуре 37 ° С в течение 1 часа.
11. Аспирируйте Matrigel решения и осторожно мыть центрального желоба с 1-2 мл УЛ.
12. Внесите 100 мкл EFH-SFM или FBS-SFM на центральной впадины и передать гальванотаксиса камер на этапе подсчета микроскопом.
13. Пипеткой 3-4 мл нейросфер содержащей культуру в 60 мм чашки Петри и передать чашку Петри на этапе подсчета микроскопом.
14. При просмотре цель 5x, использовать P10 пипетки для передачи 5-8 целом нейросферы (до четырех одновременно) на центральную впадину каждой гальванотаксисаКамера без оторвать их, и тщательно распространение нейросферы вокруг центральной корыта, не нарушая Matrigel подложки.
15. Добавить дополнительные 150-200 мкл EFH-SFM или FBS-SFM на центральной впадины.
16. Передача гальванотаксиса камер в 37 ° C, 5% CO _2, 100% увлажненном инкубаторе в течение 17-20 часов (если анализ недифференцированные НПС), чтобы нейросферы присоединиться к Matrigel подложки и распадаются на отдельные клетки, как показано на рисунке 1 . Если в результате анализа дифференцированных NPC, инкубационный период должен быть продлен до 69-72 часов, чтобы позволить дифференцировки клеток.

3. Живая клетка Time-Lapse изображений

1. Разрешить живые системы визуализации ячейки для уравновешивания при 37 ° C, 5% CO ₂ в течение как минимум 30 минут до начала записи со сжатием времени.
2. Вырежьте два 12 см кусками диаметром 1 мм серебряной проволоки, катушки их с одного конца, и поместить их в Clorox бвыщелачивания в течение 20 мин с образованием Ag / AgCl электродов.
3. Передача гальванотаксиса камер на этапе подсчета микроскопа и выбрать, какие камеры будут использоваться для живых клеток визуализации миграции анализ на основе следующих критериев: а) нейросферы должна быть почти полностью распадается на отдельные клетки и б) клетки должны обладать круглый морфологии с небольшим до никакие процессы простирается от клеточных тел.
4. Передача выбранной камеры гальванотаксиса в ламинаре, наряду с отдельными нет кв. 1 стакан скольжения крышки и вакуумной смазкой.
5. Промойте крышку скольжение сначала с 70% этанола, то с автоклавного водой, и нанесите полосу вакуумной смазки на двух параллельных краев покровного стекла.
6. Аспирируйте культуру средств массовой информации из центрального желоба в камере, а затем быстро установить крышку скольжения (Смазка-лицевой стороной вниз) на камере так, что остальные смазки полосы на две параллельные прямоугольные полоски стекла, фактически создавая крышув камеру.
7. Внесите 100 мкл свежей EFH-SFM или FBS-SFM в центральный желоб с помощью капиллярного действия.
8. Использование вакуумной смазкой для создания границ для бассейнов культуры, средств массовой информации на каждом конце центральной корыта, как показано на рисунке 2.
9. Вырежьте два 15 см куски труб из ПВХ, а также использовать 10 мл шприц с иглой 18 калибра тщательно вводят раствор агарозы в трубку, гарантируя, что ни пузырьки образуют в трубах, и позволяют закрепить гелем в течение 5 мин.
10. Передача гальванотаксиса камеру к живой системы визуализации ячейки, наряду с агарозном геле труб, Ag / AgCl электродов, и пара пустых 60 мм чашки Петри, которые будут использоваться в качестве питательной среды водоемов и будет содержать Ag / AgCl электродов. Позвольте камере гальванотаксиса на отдых в 37 ° C, 5% CO ₂ окружающей среды в течение 20-30 мин.
11. За это время подготовить крышки 2 пустые чашки Петри и крышку чашки Петри гальванотаксиса камеры путем сверления отверстийв них с Dremel или подобный инструмент, как показано на рисунке 3.
12. Внесите 1-1,5 мл EFH-SFM или FBS-SFM на обе стороны от центральной корыто, и 7-8 мл SFM в каждую пустую чашку Петри. Положите одну чашку Петри с каждой стороны от центрального желоба камеры гальванотаксиса и место одним Ag / AgCl электрод в каждом блюде. Преодоление разрыва между камерой гальванотаксиса и чашки Петри установить непрерывность электрической цепи с агарозном геле мосты, как показано на рисунке 4.
13. Подключите Ag / AgCl электродов к внешнему источнику питания, с амперметр последовательно для измерения электрического тока и включите питание. С помощью вольтметра измерить напряженность электрического поля непосредственно через центральный желоб, а также настроить выход блока питания до желаемой напряженности электрического поля достигается (анализы, выполненные в этой лаборатории используют силу dcEF от 250 мВ / мм Электрический ток от 1 до 1,5 мА).
14. InitiaТе покадровой модуль на живые системы визуализации ячейки и позволяют эксперимента для запуска нужного количества времени. После завершения анализа, зафиксировать клетки в 4% параформальдегид для стандартного анализа иммуноокрашивания.

Результаты

Кинематический анализ показывает, что в присутствии 250 мВ / мм dcEF, недифференцированные НПС проявляют высокую направлена ​​и быстрая гальванотаксиса к катоду (рис. 5А, фильм 1). В отсутствие dcEF, случайные движения клеток наблюдается (рис. 5Б, фильм 2). При этом напряженность поля,> 98% недифференцированных NPCs мигрировать на весь 6-8 часа, за которые они загружаются, и так как мертвые клетки не мигрируют, это говорит о том, что они остаются жизнеспособными в течение этого перио...

Обсуждение

Этот протокол был адаптирован из устоявшихся методов предыдущих исследованиях ^7-9. Galvanotactic камеры могут быть построены с использованием различных методов, в том числе строительство отдельного стекла хорошо для удержания клетки посева, или с помощью CO ₂ лазерной абляции для микротехнологий центрального желоба ^10,11. Некоторые методы могут быть более трудоемкой и дорогостоящей, чем другие. Мы описали простой и экономически эффективный тест для построения камеры NPC гальванотаксиса и...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название пункта	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
			Нейронные изоляции клеток-предшественников
2М NaCl	Сигма	S5886	11,688 г растворяют в 100 мл дН 2 O
1M KCl	Сигма	P5405	7,456 г растворяют в 100 мл дН 2 O
1M MgCl 2	Сигма	M2393	20,33 г растворяют в 100 мл дН 2 O
155 мм NaHCO 3	Сигма	S5761	1,302 г растворяют в 100 мл дН 2 O
Глюкоза 0,5 м	Сигма	G6152	9,01 г растворяют в 100мл дН 2 O
108 мм CaCl 2	Сигма	C7902	1,59 г растворяют в 100 мл дН 2 O
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15070
Бычьего трипсина поджелудочной железы	Сигма	T1005
Овцы яички гиалуронидаза	Сигма	H6254
Кинуреновой кислоты	Сигма	K3375
Овомукоида ингибитора трипсина	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% глюкозы	Сигма	G6152
7,5% NaHCO 3	Сигма	S5761
1M HEPES	Сигма	H3375	23,83 г растворяют в 100 мл дН 2 O
L-глютамин	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Развести в 1 мл смеси гормонов и аликвоту в 20 мкл единиц.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Развести в 0,5 мл смеси гормонов и аликвоту в 20 мкл единиц.
Гепарин	Сигма	H3149
Apo-трансферрин	R & D Systems	3188-AT	0,1 г растворяют в 4 мл дН 2 0
Путресцин	Сигма	P7505	Растворить 9,61 мг в Apo-трансферрин такLution
Инсулин	Сигма	I5500	Растворите 25 мг в 0,5 мл 0,1 N HCl и добавляют к 3,5 мл дН 2 0
Селен	Сигма	S9133
Прогестерон	Сигма	P6149
Стандартные инструменты Dissection	Средства изобразительных наук
Препарирование микроскопом	Zeiss	Stemi 2000
			Гальванотаксис палаты подготовка
Площадь слайды стеклом	VWR	16004
6N соляной кислоты	VWR	BDH3204-1
Высокая смазки вакуумного	Dow Corning
60 мм чашки Петри	Fisher Scientific	0875713A
Поли-L-лизин	Сигма	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Оттепель и аликвоты в 150 мкл единиц
FBS	Invitrogen	10082139	Только использовать, если вызывая NPC дифференциации, в противном случае использовать SFM + средствах массовой информации EFH культуры, как указано выше
Подсчет микроскопом	Олимп	CKX41
			Живая клетка Time-Lapse изображений
Серебряный провод	Alfa Aesar	11434
UltraPure Агароза	Invitrogen	15510-027
Тепло Inactivated FBS	Сигма	16140071
ПВХ труб	Fisher Scientific	80000006	3/32 "ID х 5/32" OD
Отбеливатель	Clorox
10 мл шприца	BD	309604
18 иглы	BD	305195
Dremel сверло	Dremel	Модель 750
Инвертированный микроскоп оснащен увлажненной, инкубационных камеры	Zeiss	Axiovert-200M
			Рецепты Пункт Объем 2М NaCl 6,2 мл 1M KCl 0,5 мл 1M MgCl 2 0,32 мл 155 NaHCO 3 16,9 мл Глюкоза 1M 1 мл 108 мм CaCl 2 0,09256 мл Пенициллин-стрептомицин 1 мл Автоклавного воды 74 мл Искусственные спинномозговой жидкости Пункт Объема или массы Искусственные спинномозговой жидкости 30 мл Бычьего трипсина поджелудочной железы 40 мг Овцы яички гиалуронидаза 22,8 мг Кинуреновой кислоты 5 мг <сильная> раствор трипсина Пункт Объема или массы SFM 15 мл Овомукоида ингибитора трипсина 10 мг Ингибитор трипсина решение Пункт Объем Автоклавного воды 37 мл 10X DMEM/F12 10 мл 30% глюкозы 2 мл 7,5% NaHCO 3 1,5 мл 1M HEPES 0,5 мл Трансферрин, Путресцин решения 4 мл 25 мг раствора инсулина 4 мл Селен 100-му, Л Прогестерон 100 мкл Гормон Mix (100 мл общем, хранить при -20 ° C) Пункт Объем Автоклавного воды 37,5 мл 10X DMEM/F12 (3:1) 5 мл 30% глюкозы 1 мл 7,5% NaHCO 3 0,75 мл 1M HEPES 0,25 мл Гормон смеси 5 мл L-глютамин 0,5 мл Пенициллин-стрептомицин 0,5 мл Сыворотка Free Media EFH-SFM: добавьте 10 мкл EGF, 10 мкл FGF, и 3,66 мкл гепарина FBS-SFM: добавить 0,5 мл FBS Пункт Объем Matrigel 150 мкл SFM 3,6 мл Matrigel Решение Matrigel аликвоты должны быть помещены в коробки льда и позволила таять медленно, в течение 4-5 часов с образованием вязкой жидкости перед смешиванием с УЛ. Это позволит обеспечить формирование ровным слоем Matrigel подложки. Если не оттаяла медленно, в результате подложка будет содержать сгустки Matrigel, возможно, препятствующие миграции клеток. Пункт Объема или массы UltraPure Агароза 300 мг в 10 мл DDH 2 0 SFM Инактивированной нагреванием FBS 8 мл 2 мл MatrigelРешение Смешайте 8 мл SFM с 2 мл инактивированной нагреванием FBS в 15 мл трубки сокола. Mix агарозы с 10 мл DDH 2 0 в колбу, и тепло в микроволновой печи в течение 30 секунд в 10-сек интервалах, обеспечивая, чтобы удалить раствор из микроволновой печи после каждого 10-секундный интервал и тщательно перемешайте. После заключительного 10-секундный период микроволновой печи, перемешать раствор агарозы с SFM / FBS решения и хранят в 57 ° С водяной бане.