Компактный квантовых точек для одиночных молекул изображений

Summary

Мы описываем получения коллоидных квантовых точек с минимальным гидродинамическим размер одной молекулы флуоресцентной микроскопии. По сравнению с обычными квантовыми точками, эти наночастицы близки по размерам к глобулярных белков и оптимизированы для одной молекулы яркость, устойчивость против фотостарения, а также устойчивость к неспецифического связывания с белками и клетками.

Abstract

Визуализация одной молекулы является важным инструментом для понимания механизмов функционирования биомолекул и для визуализации пространственной и временной гетерогенности молекулярного поведения, лежащего в основе клеточной биологии ^1-4. Чтобы получить изображение отдельной молекулы, представляющей интерес, ее обычно конъюгируют с флуоресцентной меткой (красителем, белком, бусиной или квантовой точкой) и наблюдают с помощью эпифлуоресцентной микроскопии или флуоресценции полного внутреннего отражения (TIRF). В то время как красители и флуоресцентные белки были основой флуоресцентной визуализации на протяжении десятилетий, их флуоресценция нестабильна при высоких потоках фотонов, необходимых для наблюдения отдельных молекул, что дает всего несколько секунд наблюдения до полной потери сигнала. Латексные шарики и шарики, меченные красителем, обеспечивают улучшенную стабильность сигнала, но за счет значительно большего гидродинамического размера, который может пагубно изменить диффузию и поведение исследуемой молекулы.

Квантовые точки (QD) предлагают баланс между этими двумя проблемными режимами. Эти наночастицы состоят из полупроводниковых материалов и могут быть сконструированы с гидродинамически компактным размером и исключительной устойчивостью к фоторазложению^. Таким образом, в последние годы квантовые точки играют важную роль в обеспечении долгосрочного наблюдения за сложным макромолекулярным поведением на уровне одной молекулы. Тем не менее, было обнаружено, что эти частицы проявляют нарушенную диффузию в переполненных молекулярных средах, таких как клеточная цитоплазма и нейрональная синаптическая щель, где их размеры все еще слишком велики ^4,6,7.

Недавно мы разработали сердцевину и поверхностные покрытия квантовых точек для минимизации гидродинамического размера, уравновешивая при этом смещения коллоидной стабильности, фотостабильности, яркости и неспецифического связывания, которые препятствовали полезности компактных квантовых точек в прошлом ^8,9. Целью данной статьи является демонстрация синтеза, модификации и характеризации этих оптимизированных нанокристаллов, состоящих из легированного ядра Hg_xCd_1-xSe, покрытого изолирующей оболочкой Cd_yZn_1-yS, дополнительно покрытого многодентатным полимерным лигандом, модифицированным короткими цепями полиэтиленгликоля (ПЭГ) (рис. 1). По сравнению с обычными нанокристаллами CdSe, сплавы Hg_xCd_1-xSe обеспечивают более высокие квантовые выходы флуоресценции, флуоресценции на красных и ближних инфракрасных длинах волн для улучшения соотношения сигнал/шум в клетках и возбуждение на нецитотоксических видимых длинах волн. Многозубчатые полимерные покрытия связываются с поверхностью нанокристалла в замкнутой и плоской форме для минимизации гидродинамического размера, а ПЭГ нейтрализует поверхностный заряд, сводя к минимуму неспецифическое связывание с клетками и биомолекулами. Конечным результатом является ярко флуоресцентный нанокристалл с излучением от 550 до 800 нм и общим гидродинамическим размером около 12 нм. Это находится в том же диапазоне размеров, что и многие растворимые глобулярные белки в клетках, и значительно меньше, чем у обычных ПЭГилированных квантовых точек (25-35 нм).

Protocol

Следующие процедуры синтеза включает стандартные воздуха без техники и использования вакуума / инертной газовой трубе; подробной методологии можно найти в ссылках 10 и 11. Бюллетени для всех потенциально токсичных и легковоспламеняющихся веществ необходимо проконсультироваться с использованием и все легковоспламеняющихся и / или воздушно-лабильные соединения должны быть аликвоты в перегородке-запечатанных флаконов в ящике для перчаток или перчатки сумки.

1. Синтез селенида кадмия ртути (Hg _х Cd _1-х Se) Quantum Dot сердечников

1. Подготовить 0,4 М раствор селена в trioctylphosphine (TOP). Добавить селена (0,31....

Results

На рисунке 2 представлена ​​представитель спектры поглощения и флуоресценции для CdSe нанокристаллов, Hg _х Cd _{1-X SE} нанокристаллов после катионного обмена, и Hg _х Cd _1-х Se / Cd _у Zn _1-й нанокристаллы S после оболочку роста. Нанокристаллов CdSe есть основной квантовый выход флуоресценции около 15% (в том числе длинноволновой глубокие ловушки выбросов), но эта эффективность падает до менее чем 1% после обмена ртути, вероятно, из-за носите.......

Discussion

По сравнению с обычными CdSe квантовых точек, тройной сплав ртути _х Cd _{1-X SE} нанокристаллы могут быть настроены по размеру и длине волны флуоресценции самостоятельно. Размер первой выбранной в процессе синтеза нанокристаллов CdSe ядра, а длина волны флуоресценции выбран вторичной ртути катионообменная шаг, который существенно не изменяет размер нанокристаллов ^9. Важно, чтобы очищенная Hg _х Cd _{1-X SE} нанокристаллов для инкубации при комнатной температуре в течение п.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Селен	Sigma-Aldrich	229865
Tri-н-octylphosphine	Стрем	15-6655	97% чистого, неустойчивы в воздухе
Кадмий оксид	Sigma-Aldrich	202894	Очень токсично: Соблюдайте осторожность
Tetradecylphosphonic кислоты	PCI синтеза	4671-75-4
Октадецена	Alfa Aesar	L11004	Технический сорт
Гексадециламин	Sigma-Aldrich	H7408
Дифенилфосфина	Sigma-Aldrich	252964
Mercury ацетат	Sigma-Aldrich	456012	Очень токсично: Соблюдайте осторожность
1-Octanethiol	Sigma-Aldrich	471836	Сильный запах
Олеиновая кислота	Sigma-Aldrich	W281506
Цинк ацетат	Alfa Aesar	35792
Кадмий ацетат гидрат	Sigma-Aldrich	229490	Очень токсично: Соблюдайте осторожность
Олеиламин	Fisher Scientific	AC12954	Нестабильность в воздухе
Сера	Sigma-Aldrich	344621
Trioctylphosphine оксид	Стрем	15-6661	99%
Пиридин	VWR	EM-PX2012-6	Безводный
Тиоглицерин	Sigma-Aldrich	M1753	Сильный запах
Триэтиламин	Sigma-Aldrich	471283	Безводный
Диализа	Спектр Labs	131342	20 кДа отсечка
Центробежный фильтр	Millipore	UFC801024	10 кДа отсечка
Monoamino-PEG	Rapp полимеры	12 750-2	750 Da
DMTMM, 4 - (4,6-диметокси-1 ,3,5-триазин-2-ил)-4-methylmorpholinium хлорид гидрат	Alfa Aesar	H26333
AKTAprime Plus хроматографической системы	GE Healthcare
Superose 6 10/300 GL колоночной хроматографии	GE Healthcare	17-5172-01
Агарозы, OmniPur	VWR	EM-2120
			Приложение Синтез ртути octanethiolate: Медленно добавить раствор метанола ртути ацетата (1 экв.) Для перемешивания раствора 1-octanethiol (3 экв.) И гидроксид калия (3 экв.) В метаноле при комнатной температуре. Изолировать ртути (II) octanethiolate осадок фильтрованием, промывают два раза с метанолом и один раз эфиром, а затем сушат под вакуумом. Синтез полидентатным полимеров: Растворите полиакриловой кислоты (1 г, 1773 Da) в 25 мл диметилформамида (DMF) в 150 мл трехгорлую колбу и пузырь с аргоном в течение 30 мин. Добавить безводного решение цистеамина (374 мг, 4,87 ммоль) в 10 мл DMF. При комнатной температуре при интенсивном перемешивании медленно добавляют безводный диизопропилкарбодиимид (DIC, 736 мг, 5,83 ммоль) в течение 30 мин, затем триэтиламин (170 мкл, 1,22 ммоль), и позволяют протекания реакции в течение 72 ч при температуре 60 ° C. Добавить меркаптоэтанол (501 мг, 6,41 ммоль) для гашения реакции, и перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Удалить DMF с помощью роторного испарителя и изолировать полимера с добавлением смеси 2:1 ледяной ацетон: хлороформ, с последующим центрифугированием. Растворите полимера в ~ 5 мл безводного DMF, фильтр, осадок снова диэтиловый эфир, и повторите. Сухой продукт под вакуумом и магазинов в атмосфере аргона. Определение диаметра основной CdSe: от UV-Vis спектр поглощения определить длину волны первого экситонного пика (λ, в нм), которая является самой длинной длины волны пика (например, примерно 498 нм для CdSe в рис. 2а), и использовать размера кривой Mulvaney и сотрудники 12: Определение концентрации нанокристаллов CdSe: от фона вычитается UV-Vis спектра оптически прозрачный раствор нанокристаллов CdSe, определяют поглощение при 350 нм. Серийные разведения могут быть использованы, чтобы определить, оптическое поглощение в пределах линейного диапазона закона Бера. Концентрации нанокристаллов (квантовых точек в M) может быть определено путем включения в нанокристаллов диаметром (D, в нм), оптические значения поглощения (3SA), а длина кювет пути (л, в см) в следующее уравнение из эмпирические соотношения Bawendi и сотрудники 13: