Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Этот протокол описывает метод визуализации ДНК двухцепочечной перерыв сигнальный белок активируется в ответ на повреждения ДНК, а также его локализации во время митоза.

Abstract

Двунитевых разрывов (ДР) являются наиболее вредными повреждения ДНК клетки может столкнуться. Если оставить неустраненные, DSBs гавани большой потенциал для создания мутаций и хромосомных аберраций ^1. Чтобы предотвратить эту травму от катализирующих геномной нестабильности, крайне важно для клеток для обнаружения DSBs, активировать ответ повреждение ДНК (РДР), и ремонт ДНК. Когда стимулируются, DDR работает, чтобы сохранить целостность генома, вызывая остановку клеточного цикла, чтобы обеспечить ремонт пройдет или заставить клетки к апоптозу. Преобладающий механизм ремонта DSB происходить через негомологичных конце-присоединение (NHEJ) и гомологичной рекомбинации ремонт (HRR) (отзывы в ^2). Есть много белков, чья деятельность должна быть четко организованы для DDR функционировать должным образом. Здесь мы опишем метод для 2 – и 3-мерные (D) визуализация одного из этих белков, 53BP1.

P53-связывающий белок 1 (53BP1) локализуется в областиDSBs путем связывания изменение гистонов ^3,4, образуя очаги в течение 5-15 минут ^5. Модификации гистонов и вербовки 53BP1 и других белков DDR для DSB сайтов, как полагают, содействие структурной перестройке хроматина вокруг области повреждения и способствуют репарации ДНК ^6. Помимо непосредственного участия в ремонте, дополнительные роли были описаны для 53BP1 в ГДР, например, регулирование внутри-S контрольно-пропускном пункте, G2 / M контрольно-пропускного пункта, и активация белка ниже по течению DDR ^7-9. Недавно было обнаружено, что 53BP1 не образует очаги в ответ на повреждение ДНК индуцированных во время митоза, вместо ожидания для клеток, чтобы войти G1 до локализации в окрестности DSBs ^6. DDR белки, такие как 53BP1 были найдены общаться с митотической структур (таких, как кинетохоры) во время их прохождения митоза ^10.

В этом протоколе описываются использования 2 – и 3-D изображений живых клеток, чтобы визуализироватьформирование 53BP1 очагов в ответ на ДНК-повреждающих агентов камптотецин (CPT), а также поведение 53BP1 во время митоза. Камптотецин является ингибитором топоизомеразы I, что в первую очередь вызывает DSBs во время репликации ДНК. Для этого мы использовали ранее описанных 53BP1-mCherry флуоресцентный белок слияния построить, состоящий из 53BP1 домена белка способен связывать DSBs ^11. Кроме того, мы использовали гистона H2B-GFP флуоресцентный белок слияния построить в состоянии контролировать динамику хроматина протяжении клеточного цикла, но, в частности, во время митоза ^12. Изображений живых клеток в нескольких измерениях является отличным инструментом для углубления нашего понимания функции белков DDR в эукариотических клетках.

Protocol

А. клеточный препарат Нормальные человеческие первичных фибробластов (GM02270) были получены от Coriell сотовых Repository, Камден, Нью-Джерси, и увековечил с hTERT 6. Клетки выращивались и расширена в Cellstar 6-см блюд в средствах массовой информации (4 мл), состоящий из MEM с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки (GIBCO), non-essential/essential аминокислоты, витамины, пируват натрия, и пенициллина / стрептомицина (HyClone ). Эмбриональной почки человека 293 (HEK293) клетки были получены из Американской коллекции типовых культур и выросла и расширилась в Cellstar 6-см блюд. Клетки хранятся в средствах массовой информации (4 мл), состоящей из DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, без незаменимых аминокислот, L-глутамина и пенициллина / стрептомицина. 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Addgene плазмиды 19836) и H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene плазмиды 17735) гена слияния конструкций, также выразив пуромицин или гены G418 сопротивления, соответственно, преобразованных (fibroblaп.) или трансфицированных (HEK293) с помощью Superfect (Qiagene) в клетках и поддерживают в состоянии наркотического выбор. Техническое обслуживание флуоресценции периодически проверяться. 24-48 часа до захвата изображений, клетки трипсинизировали в одной клеточной суспензии и высевают при низкой плотности на 3,5-см FluroDish пластины со стеклянным дном. B. Установка микроскопа и Image Acquisition Этот протокол был разработан с использованием сотового Zeiss наблюдателей SD вращающийся диск конфокальной микроскопии оснащена AxioObserver Z1 стенд, двухканальный Yokagawa CSU-X1A 5000 вращающимся диском блок, 2 Фотометрия QuantEM 512SC EMCCD камер, HXP 120C на основе волокон подсветка, 4 лазеры (Lasos 100mW многоканальный Аргон [458, 488, 514 нм], 50 мВт 405 нм диод, 40 мВт 561 нм диод, и 30 мВт 635 нм диод), AOTF, Pecon XL multiS1 стадии инкубации системы, Zeiss инкубации Модули (O 2 модуля S, CO 2 модуля S, TempModule S, нагревательный элемент XL S) и До моментаtorized XY сцене с вставкой NanoScanZ пьезо-Z. Для минимизации сферических аберраций в то время как изображения живых клеток поддерживается в водной среде, C-Apochromat 63x/1.20 воды / Корр объектива Zeiss и Immersol W иммерсионной жидкости (с показателем преломления n = 1,334) были использованы. Для 2-канальный конфокальной микроскопии, RQFT 405/488/568/647 дихроичным зеркалом и BP525/50 (зеленый) и BP629/62 (красный) выбросов фильтры были использованы. Система программного обеспечения, используемого было Zeiss AxioVision (версия 4.8.2.0) с AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, физиологии, MOSAIX, Mark & ​​Find, двойная камера, внутри 4D, автофокусом и 3-D модули Deconvolution. Убедитесь, что CO 2 газ работает на CO 2 модуля инкубационного системы. Если микроскоп поддерживается антивибрационные воздух таблицы, включить подачу воздуха (или газа N 2) для воздуха таблице. Включите для микроскопа стенд, вращающийся диск устройства, камеры, инкубационный модулей, HXP осветителя, моторизованные этапе, Аргонлазера и компьютера. Через 1 мин время прогрева, поверните ключ зажигания для аргонового лазера на "On". На панели управления Zeiss лазер, включите переключатели для лазерных линий, которые будут использоваться. Переключите тумблер для контроллера Lasos Аргон лазера от "ожидания" на "лазерных Run" и отрегулировать света контроллера до оптимального уровня (т.е. чуть ниже точки, где зеленый индикатор красного цвета). Запустите программу AxioVision. Примечание: интерфейс пользователя для AxioVision могут быть настроены с окна и выпадающие меню, которые являются специфическими для конкретной микроскопа и компонентов, которые он контролирует. Таким образом, каждая система имеет потенциально уникальным интерфейсом. Таким образом, общие инструкции для программного обеспечения манипуляции приводятся в последующих шагах, а не для конкретных направлений окна программы, вкладки и / или выпадающими меню. Примерно за 1 час до изображений, в программное обеспечение, найдите управления для инкубатора иВключение отопления для верхней палате и стадии пластины. Установка температуры до 37 ° C. Включите CO 2 контроля и установить уровень в 5%. Выбор объектива для получения изображения. В этом исследовании, 63x/1.20 НС C-Apochromat воды / Корр объектив был использован. Примечание: Для этого объектива, иммерсионной среды с показателем преломления, сходных с водой (Zeiss Immersol W иммерсионной жидкости) не требуется. Если несколько отдельных позиций для отбора проб в течение длительного периода времени, обязательно применять достаточное количество иммерсионной среды, чтобы оно осуществляется из одного положения в другое. Поместите блюдо на сцену и принести объектива вверх в контакт с дном. Используя либо микроскопом управления или программного обеспечения, руководит излучаемого света в окуляр и выберите соответствующий широкопольных набор фильтров для флуоресцентного сигнала интерес (для этого исследования, "Red" набор фильтров для 53BP1 и "GFP" набор фильтров для H2B ). </ Li> Вид через глазные линзы, фокусировать изображение, и найти подходящего поля клеток. При использовании любого программного обеспечения или микроскоп управления, руководит излучаемого света от окуляров в порт с конфокальной вращающийся блок диска. В программе, включите соответствующий лазер (для этого исследования, 561 нм с лазером для 53BP1 и 488 нм линии аргонового лазера для H2B). Для каждого канала настроить интенсивность лазерного путем корректировки акустооптического перестраиваемого фильтра (AOTF) управления соответствующего уровня. Выберите подходящий дихроичным зеркалом (RQFT 405/488/568/647) и выбросов фильтрами (BP 629/62 для 53BP1 и BP 525/50 для H2B). Откройте затвор в прядильный единичном круге. Выберите "Онлайн" для отображения текущего поля зрения. В программе открытия "Камера" управления, выберите камеры, которые будут использоваться (если двойная система камеры) и установить время экспозиции около 100 мс. Отрегулируйте% и EM получить как включенные в другие группировки. Essary Примечание: 53BP1-mCherry конструкция выглядит несколько тускло. Мы нашли его полезным для повышения коэффициента усиления EM. В программе открытия контроля за конфокальной вращающегося диска и блока регулировки скорости прядения диска, введя время экспозиции камеры, которая была установлена ​​для захвата подходящего изображения (например, ~ 100 мс). Нажмите кнопку "Установить", чтобы зафиксировать изменения. Откройте "многомерный приобретения". Выберите вкладку канала и загрузки / выбора соответствующих каналов. Для этого исследования, мы используем каналы, определенные для DsRed (561 нм лазерного возбуждения и BP 629/62 Фильтр для выбросов) и GFP (488 нм лазера для возбуждения и BP525/50 фильтром для излучения). Для обеспечения регистрации изображений, общий дихроичным зеркалом (RQFT 405/488/568/647) был использован для обоих каналов. Установка программного обеспечения для «Автофокус». Примечание: Перейдите в раздел Инструменты → Настройки редактора для настройки параметров MDA. Убедитесь, что адекватная мощность лазерного установлен ("Достаточные мощности лазера" относятся параметр, который позволит вамДля возбуждения соответствующего флуорофор при минимизации фото-отбеливание). В окне MDA, выберите Z-Stack вкладки. Выберите "Z-стек текущее положение фокуса". Установить диапазон ~ 10 мкм Z-Stack и выберите "оптимальным" для числа шагов для обеспечения Найквиста через Z. Примечание: точные размеры Z-Stack будет зависеть от высоты ваших клеток. Отрегулируйте соответственно. 23. Нажмите кнопку "Пуск" и проанализировать полученную Z-Stack изображений для обеспечения параметров являются подходящими для того, что вы расследования (например, в данном исследовании, было важно, чтобы изображение всего ядра). Выберите "T" (время) вкладки. Для нашего эксперимента с камптотецин, мы устанавливаем интервал между изображениями моменты времени до 5 мин, а общая продолжительность сессии 1 час для контроля (необработанные клетки) видео. Примечание: чтобы свести к минимуму фото-отбеливание клеток, эксперимент должна быть настроена таким образом, что AOTF заготовок лазерные между точками изображения времени. Фаили многоточечная изображений из нескольких клеток в блюдо, в окне MDA, выберите позицию табуляции. Убедитесь, «Применить» настройка перед / после момента времени "в положение" проверяется. Выберите "Mark_Find". Использование "Live" точки зрения, перемещать антенну вокруг и выбрать соответствующие поля зрения. Нажмите кнопку "Пуск" в многомерном приобретения меню, чтобы начать экспериментировать и записывать видео контроля (необработанных клеток). После контроля видео, добавлять соответствующее лечение (в данном случае, 10 мкМ камптотецин). Мы записали экспериментальный (препарат обработанных клеток) видео в 5-10 минутные интервалы в течение 2-4 часов. Примечание: Важным вопросом для рассмотрения является скорость, с которой данный эффект возникает после лечения. Как видно на видео, 53BP1 очагов начинают от ~ 5 мин после добавления КПП. Несмотря на относительно легкий процесс, добавив наркотиков на блюдо вручную и заново калибровки микроскопа требует времени. Рассмотрение должно быть уделено этим при проектировании экспериментов. Для контроля мitosis, мы устанавливаем интервал 7,5 мин и записаны в течение 4-5 ч (конкретные параметры зависят от клеточной линии используются, и длина его клеточного цикла). Корректировки, возможно, придется быть сделано для предотвращения фото-отбеливание во время длинных записей. С. обработки и анализа изображений Этот протокол был разработан с использованием программного обеспечения Volocity (PerkinElmer). Программное обеспечение используется для получения этих данных (AxioVision) также имеет возможность обрабатывать и анализировать изображения. Пользователям рекомендуется использовать программное обеспечение для них, а также проконсультироваться соответствующей литературы по их применению. Откройте Volocity программного обеспечения. Создание и назвать новую библиотеку, и импортировать видео файлы. Для просмотра файлов, мы обычно находим его наиболее полезно использовать "Расширенный фокус" настройки. Это накладывает Z-Stack ломтиками, а для этого протокола, позволяет визуализировать 53BP1 очагов в различных областях ядра. Отрегулируйте видео по мере необходимости. Voрости оснащен набором инструментов для улучшения качества получаемых изображений. Обеспечивая настройки на микроскопе было необходимо, много времени может быть сохранен в редактировании позже. Часто это полезно deconvolve изображения, а также настроить яркость / контрастность. Ваши конкретные потребности редактирования будет меняться в зависимости от эксперимента. Добавить относительной отметки времени и шкалы. Для просмотра клетки в 3-D, перейти к "3-D Opacity" настройки. Это позволяет вращение 3-D оказанных клеток в пространстве, обеспечивая тем самым различные точки зрения структуры интересов внутри клеток. Примечание: Это полезно для визуализации клеток в разных плоскостях, чтобы определить, где структура интерес путешествия. Например, в "расширенный фокус" Настройка трудно различить, что 53BP1 же, в самом деле, отмежеваться от ДНК во время митоза. Впрочем, это легко просматривается в 3-D. Фильмы и неподвижные изображения можно экспортировать в файлы различных типов на основе пользовательских предпочтений. </l I> D. Представитель Результаты Пример 53BP1 очагов формирования в ответ на КПП показано на рисунке 1. Клетки подвергаются CPT формы очагов в течение 5-10 мин, и поддерживать эти очаги в течение всей записи. Как показано на рисунке 2, 53BP1 отделяется от хроматина в начале митоза, образуя тонкую дымку вокруг конденсации хромосом. Как телофазе происходит и митоза подходит к концу, 53BP1 раз агрегатов на отдельные очаги. В то время как НЕК293 не подвергались CPT, тем не менее они образуются обильные, спонтанные 53BP1 очагов ремонт порожденных эндогенные повреждения ДНК. Это наблюдение позволило нам сделать вывод, что 53BP1 не образует очаги на ранних стадиях митоза, в соответствии с предыдущими отчет, показывающий, подобный эффект после воздействия на клетки ионизирующих излучений и радиомиметических наркотиков 5. рисунке 1 "SRC =" / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg "/> Рисунок 1. Камптотецин (10 мкМ) вызывает DSBs и 53BP1 формирование очагов в велосипедных фибробластов в течение 30 мин добавления наркотиков в среду. Рисунок 2. 53BP1 не образует очаги во время митоза, пока telophase/G1 в НЕК293.

Discussion

Поддержание целостность генома имеет решающее значение для выживания клеток. Неспособность сохранить геном приводит к преждевременному старению, канцерогенеза, или смерть ^8. Существует повышенный интерес взыскательных как DDR функций, вытекающих из его значение как фундаментал?…

Materials

CellStar culture dishes	Greiner Bio-one
FluroDish glass bottom dishes	World Precision Instruments, Inc.
MEM media	GIBCO
Non-essential amino acids	GIBCO
Amino acids	GIBCO
Vitamins	GIBCO
Sodium Pyruvate	Invitrogen
Penicillin/Streptomycin	HyClone
Fetal Bovine Serum	GIBCO
N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro;<br/> plasmid 19836	Addgene
pCLNR-H2BG; plasmid 17735	Addgene
SuperFect	Qiagen
Zeiss Cell Observer SD Imaging system	Zeiss
AxioVision (release 4.8.2)	Zeiss
Zeiss Immersol W Oil	Zeiss
Volocity software (version 6.0)	PerkinElmer