Engineered мышечной ткани имеет большой потенциал в регенеративной медицине, как болезнь модели, а также в качестве альтернативного источника для мяса. Здесь мы описываем техники мышц конструкции, в данном случае от мыши миобластов клеток-предшественников, а также стимуляции электрическими импульсами.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Инженерные скелетных мышечных тканей из мышиных миобластов клеток-предшественников и применения электрической стимуляции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Разработан мышечных тканей может быть использован для различных целей, в том числе производство тканей для использования в качестве модели заболевания в пробирке, например, для изучения пролежней, для восстановительной медицины и в качестве мяса альтернативные 1. В первом сообщалось 3D конструкций мышцы были сделаны много лет назад и пионерами в этой области являются Vandenburgh и коллег 2,3. Авансы в мышцах тканевой инженерии являются не только результатом огромного выигрыша в знаниях биохимических факторов, стволовых клеток и клеток-предшественников, но и, в частности, основанные на выводы, полученные исследователями, что физические факторы играют существенную роль в контроле клеточного поведения и развитие тканей. Государство-оф-искусство инженерных мышцы строит в настоящее время состоит из ячейки населенных конструкций гидрогеля. В нашей лаборатории это обычно состоят из мышиных миобластов клеток-предшественников, выделенных из мышиных задних мышц конечностей или мышиной линии клеток миобластов C2C12, мильфиксировано смесью коллаген / Matrigel и помещают между двумя точками крепления, имитируя мышцы связки. Другие клетки могут быть рассмотрены, а также, например, альтернативных клеточных линий, таких как L6 миобластов крысы 4, новорожденных мышц, полученных клеток-предшественников, 5, клеток, полученных из взрослых тканей мышц от других видов, таких как человека 6 или даже индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (индуцированных плюрипотентных клеток) 7 . Сотовые сократимость вызывает выравнивание ячеек вдоль длинной оси конструкции 8,9 и дифференциацию клеток-предшественников мышц приблизительно через одну неделю культуре. Кроме того, применение электрической стимуляции может улучшить процесс дифференциации в некоторой степени 8. Из-за своего ограниченного размера (8 х 2 х 0,5 мм), полная ткани могут быть проанализированы с помощью конфокальной микроскопии для контроля, например, жизнеспособность, дифференциация и выравнивание ячейки. В зависимости от конкретного применения требований к инженернокрасные мышечные ткани будет меняться, например, использование для регенеративной медицины требуется масштабирование до размеров ткани и васкуляризации, а в качестве перевода мясо альтернативой другим видам необходимости.
Протокол
1. Культуры миобластов мышиной клетки-предшественники или клетки C2C12
- Изолировать клеток в соответствии с протоколом первоначально опубликовано Шефер и его коллеги 10 и более поздних адаптированы Collins и соавт. Боонен 11 и соавт. 12 и хранить их в жидком азоте. Это требует мышей, например, C57Bl / 6. Альтернативные методы, которые используются в других лабораториях, например, метода опубликована в журнале Визуализированные Эксперименты Li Y и соавт. 13. Для реактивов и оборудования вам следует обратиться к таблице на стр. 7 и 8. Из мышц от одной мыши вы, как правило получить достаточное количество клеток для криоконсервирования около 20 флаконов в жидком азоте. Далее, мы начинаем протокол таять клетки от жидком азоте.
- Поместите клетки от 1 флакона в 25 см 2 Matrigel (1 мг / мл) с покрытием колбы культуры тканей и добавить питательную среду (GM), состоящей из (335 мл DMEM передовой, 100 мл плода Бовинэлектронной сыворотки (FBS), 50 мл HS, 5 мл пенициллина / стрептомицина, 5 мл L-глутамина, 5 мл куриного эмбриона экстракт (ЦВЕ)).
Примечание: пальто в течение 2 ч при комнатной температуре и удалить Matrigel стремлением.
- Субкультура клеток примерно 1:03 каждые 3 дня.
Это означает: на 3-й день: Переход от одной клетки 25 см 2 до 75 см 2 колбы, на 6-й день: переход от одной клетки 75 см 2 колбы с двумя 150 см 2 колбы (с 30 мин preplating в колбах без покрытия). На 9-й день передачи на расстоянии 150 см 2 колбы до 1 трехместный 150 см 2 колбы, или если недоступны до трех 150 см 2 колбы (при необходимости preplate опять же в зависимости от фенотипа клеток). На 12-й день клетки готовы для посева в мышцу конструкции.
Примечания: - За тройное 150 см 2 числа клеток составит примерно 4,5 х 10 6 клеток.
- Используйте помощьюLs из различных выделений смешивать их для получения смешанной популяции клеток во время посева.
Примечание: Если вы не хотите работать с первичными клетками, C2C12 миобластов являются хорошей альтернативой.
2. Инженерные скелетных мышечных тканей
- Подготовка кремния клея путем смешивания "эластомер" с "отвердителя" (10:1). Вырезать + / - 5 мм квадратных сегментов липучкой с одной стороны треугольного (дом-образную форму; рис. 1). Клей липучки в лунки 6-луночный культуральный планшет в пространстве примерно на 12 мм между квадратами.
Примечания: - используйте только мягкую сторону липучки и сталкиваются с этой стороной вверх.
- Убедитесь, что крышам навстречу друг другу.
- Только покрытие Velcro с силиконовым клеем, не распространяются клея во всем хорошо.
- Для дальнейшего электрической стимуляции уместно привести конструкций в вертикальном направлении и плели (вдоль длинной оси).
- Оставьте сохнуть в течение ночи в вакуумной печи, не отапливается, в первую очередь, чтобы удалить пузырьки воздуха. Стерилизовать добавлением 70% этанола в лунки и инкубировать в течение 15 мин. Промыть 3 раза с PBS и поставить под УФ в течение 15 мин. Удалите все PBS из скважин и липучки и место в инкубаторе до использования.
- Оттепель Matrigel решение в холодильнике и подготовки раствора коллагена до нужной концентрации незадолго до принятия 3D конструкций. Развести фондовом коллагена стерильным 0,02% уксусной кислоты (конечная концентрация 3,2 мг / мл).
Примечание: оставить все на льду.
- Trypsinize клетки, ресуспендирования в GM и кол. Оставьте клеток в центрифуге трубки в инкубаторе.
- Добавить необходимое количество коллагена раствора для чисел конструкций, которые вы хотите, чтобы к трубке (в соответствии с таблицей 1), добавляют 0,5 М NaOH до этого раствора коллагена до светло-розового колоГ указывает, рН 7,5. Осторожно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз и избежать образования пузырьков. Затем добавить Matrigel и смешать очень осторожно, но тщательно. Наконец, добавьте ГМ коллаген / Matrigel смеси (при соответствующем количестве см. Таблицу 1).
Примечания: - Выполняйте каждый шаг на льду! Matrigel и коллагена охотно гель при повышении температуры.
- Имейте в виду, что цвет действительно розовый! Увеличение рН также вызывает быстрое застывание.
- Конечная концентрация коллагена: 1,6 мг / мл.
- Центрифуга нужное количество клеток при 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут и удалить супернатант.
Примечание: - В зависимости от активности клеток число клеток в построить нуждается в корректировке. Как правило, количество клеток находится между 750000 и 1250000 клеток на конструкцию.
- Использование некоторых из геля смесь ресуспендируют осадок клетоки передать клеток в оставшуюся смесь и тщательно перемешать, но без введения пузырьков воздуха.
- Возьмите разогретую также пластин из инкубатора и пипеткой 0,35 -0,4 мл клетки-гель смесь в липучки в первую очередь. Затем начинают пипетировать смесь из центра между вложений сайтах и распространяются на липучке. Наконец, используйте оставшуюся часть геля, чтобы заполнить разрыв между двумя якорями липучки и пипеткой по части липучки.
- Тщательно проверьте через 5-10 мин, если гели достаточно прочной, чтобы быть переданы, то есть слегка постучите по блюд и визуального осмотра, если гель будет жесткой. Если это так, осторожно поместите посуду в инкубаторе. Как правило, они могут быть подняты через десять минут. Затем, после 1-2 часов, аккуратно накладываются друг на гель с 4 мл теплой GM.
Примечание:-Не делайте никаких энергичных движений при обработке пластин.
- Заменить GM дифференциация среды (рост среднегобез куриных эмбрионов экстракт), после 24 часов, и заменить свежей среде каждые 2-3 дня. На 7-й день вы должны были получить зрелые ориентированных волокон мышц, а может быть оценена с окрашиванием для кросс-разработки страт в расплавленном мышечных волокон.
3. Электрическая стимуляция
- Стерилизовать электроды от пластины ionoptix (см. таблицу реагентов и оборудования) перед использованием с 70% этанола и затем сушат под УФ в безопасности кабинета. Поместите пластину с электродами на культуру пластину с конструкциями и накрыть крышкой от пластины культуры и передачу инкубатора. Подключите Ionoptix C-иноходца с соответствующими кабелями.
Примечание: электроды расположены параллельно рядом с мышц конструкции (рис. 2).
- Применение протокола стимуляции, как ожидалось.
Примечание: Мы обычно используем 4 В / см,6 мс импульсы с частотой 2 Гц. Изменение культуры средних каждые 24 часа во время стимуляции.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Конечный продукт будет мышцы конструкции, как показано на рисунке 3. Размер ткани будет около 8 мм длиной, 2 мм шириной и толщиной 0,5 мм. Электрическая стимуляция при дифференциации будет менять выражение изоформ миозина тяжелой цепи, но не значительно повысить дифференциацию процесса, индуцированного дифференциации среднего 8, но электрической стимуляции могут также применяться в конце процесса для проверки функциональности мышц , потому что мышцы полностью разработана саркомеров смогут заключить конт...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Инженерные мышечной ткани имеет большой потенциал для использования в качестве модели заболевания, для скрининга лекарственных средств, в регенеративной медицине и для производства мяса. Тем не менее, требования к этим приложениям меняться. Мы решили работать с комбинацией коллагена и матригель, потому что коллаген обеспечивает выравнивание ячейки и потому, что клетки предшественники миобластов требуют присутствия базальной мембраны, полученные белки, как это определено в предыдущих исследованиях 2D 12. Кроме...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить Yabin Wu для культивирования тканей представлен на рисунке 2, снимок был сделан Барт ван Overbeeke. Работа выполнена при финансовой поддержке SenterNovem, грант ISO 42022.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии (по желанию) |
| Matrigel фактор роста уменьшена | Beckton и Дикинсон | ||
| DMEM (высокий уровень глюкозы) * | Gibco | 42430 | |
| Расширенный DMEM | Gibco | 12491 | |
| Лошадиная сыворотка | Gibco | 65050-122 | |
| Эмбриональной бычьей сывороткой | Greiner | 758075 | |
| 0,45 и 0,22 мкм шприц фильтр * | Whatmann (Schleicher и Scheull) | 10462100 | |
| L-глютамин | Gibco | 25030024 | |
| Пенициллина / стрептомицина | Gibco | 10378016 | |
| Амфотерицин | Gibco | 15290-018 | |
| Культура пластиковые | Greiner | Включает в себя культуру колб и пипеток | |
| Экстракт куриных эмбрионов | Соединенные Штаты Биологические | C3999 | |
| Пипетки Пастера * | Хильгенберг | Пипетки Пастера, с перетяжкой, с хлопком, открытые L совет: 230 мм с наконечником диаметром 0,9 - 1,1 мм | |
| Пипетки Пастера * | Хильгенберг | Пипетки Пастера, с перетяжкой, с хлопком, открытые L совет: 230 мм с наконечником диаметром 1,4 - 1,6 мм | |
| Пипетки Пастера | VWR | 612-1702 | |
| Коллагеназы типа I* | Сигма | C0130-16 | |
| 40 мкм ячейки фильтра * | BD Falcon | 352340 | |
| 19G иглу | |||
| Эластомер | Корпорация Dow Corning | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210 # |
| Отвердитель | Корпорация Dow Corning | Silastic MDX 4-4210 # | |
| Липучка | Регулярные магазине | Вы можете купить это в обычных магазинах, используйте только мягкую сторону | |
| Коллаген типа I, крысы хвост | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP культуры Pacer | Ionoptix | ||
| 6-а культура блюда для электрической стимуляции | Becкт Dickinson-Falcon | BD Falcon # 353846 | |
| C-Dish электродов культуры блюдо | Ionoptix | ||
| * Необходимые для выделения клеток (пункт 1.1) # Вместе в одном комплекте |
Ссылки
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle. Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).
- Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).
- Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).
- van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).
- Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).
- Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011(2010).
- Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering. J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).
- Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).
- Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC. , In revision (2013).
- Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
- Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
