В этом докладе мы покажем, окрашивание и анализ шагов фенотипирование анализ выполняется на свежую цельную кровь, перечислить основные врожденной и адаптивной популяции лейкоцитов. Мы подчеркиваем соображения для выполнения этих процедур в рамках многоцентрового клинического исследования.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Перечень основных периферической крови популяции лейкоцитов для многоцентровых клинических испытаний с использованием полного анализа крови Фенотипирование
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Криоконсервация лейкоцитов периферической крови широко используется для сохранения клеток для оценки иммунного ответа в клинических исследованиях и предлагает множество преимуществ с точки зрения простоты и стандартизации иммунологических анализов, однако при этом наблюдаются негативные эффекты данного процесса на некоторые подмножества клеток, такие как гранулоциты, B-клетки и дендритные клетки 1-3. Анализ свежих лейкоцитов дает более точное представление о состоянии клеток in vivo, но его часто трудно реализовать в рамках крупных клинических исследований. Анализы свежих клеток зависят от обязательств и временных рамок добровольцев, а если процедуры трудозатратны, их применение может стать непрактичным из-за требуемого рабочего времени лабораторного персонала. Кроме того, когда исследования проводятся в нескольких центрах, лаборатории, обладающие ресурсами и подготовкой, необходимыми для проведения анализов, могут находиться недостаточно близко к клиническим центрам. Чтобы решить эти проблемы, мы разработали панель окрашивания 11 цветами с помощью антител, которую можно использовать с пробирками Trucount (Becton Dickinson; San Jose, CA) для фенотипирования и подсчета основных популяций лейкоцитов в периферической крови, что дает более надежную информацию о конкретных типах клеток, чем такие анализы, как общий анализ крови (CBC), или анализы с коммерчески доступными панелями для пробирок Trucount, которые окрашивают лишь несколько типов клеток. Процедура окрашивания проста, требует всего 100 μl свежей цельной крови и занимает примерно 45 минут, что делает её доступной для выполнения в стандартных лабораториях по обработке крови. Она адаптирована на основе технического паспорта пробирок BD Trucount (версия 8/2010). Коктейль антител для окрашивания может быть заранее приготовлен в большом объеме в центральной аналитической лаборатории и отправлен в лаборатории по обработке на местах. Окрашенные пробирки могут быть зафиксированы и заморожены для отправки в центральную аналитическую лабораторию для многоцветного анализа методом проточной цитометрии. Данные, полученные с помощью этой панели окрашивания, могут быть использованы для отслеживания изменений концентрации лейкоцитов с течением времени в зависимости от вмешательства и могут быть легко доработаны для оценки состояний активации интересующих типов клеток. В данном отчете мы демонстрируем процедуру, используемую техниками лабораторий по обработке крови для окрашивания свежей цельной крови, и этапы анализа этих окрашенных образцов в центральной аналитической лаборатории, поддерживающей многоцентровое клиническое исследование. В видео подробно описывается процедура, выполняемая в контексте забора крови при клиническом исследовании в Сети по испытаниям вакцин против ВИЧ (HIV Vaccine Trials Network, HVTN).
Протокол
Примечание: Для защиты флуорофора-антителами от света, выполнить все этапы биологической безопасности шкаф с свет.
1. Антитела Окрашивание Подготовка панелей
- Панель антител окрашивания можно найти в таблице 1. Концентрации антител должно быть определено путем титрования цельной крови и с тем же оборудованием проточной цитометрии и процедуры, которые будут использоваться для приобретения окрашенных образцов фенотипирования.
- После соответствующих титров окрашивания определяется, объединить все антитела в одной смеси на замок крышкой трубки. Добавить поток промывочного буфера (PBS Дульбекко с 2% инактивированной нагреванием эмбриональной бычьей сывороткой), чтобы довести общий объем до 100 мкл. Масштаб смеси для числа образцов, окрашенных. Эту смесь можно хранить при температуре 4 ° С в течение восьми недель.
2. Окрашивание
- Если кровь, собранная будет использоваться для других целей в объявленииУсловие для этого анализа, установить аликвоты в стороне в то время как более срочные процедуры выполняются на оставшуюся кровь. Аликвоту можно хранить при комнатной температуре в течение 4 часов после венепункции без значительных потерь клетки.
- Убедитесь, что есть нетронутыми борта осадок на дне Trucount трубы и трубки этикетки для идентификации пробы окрашивают. В HVTN клинических испытаний, лаборатория Data Management System (пограничная наука и технологии исследовательского фонда; Амхерст, штат Нью-Йорк) используется для обозначения и отслеживать окрашенных образцов.
- Запишите номер партии и срок годности всех реагентов. Запись Trucount трубки шарик число номеров, предоставляемых производителем на сумку труб; убедитесь, что номер партии на пакете соответствует номеру партии на трубе.
- Использование обратного пипеткой точно пипеткой 100 мкл цельной крови в Trucount трубку, чуть выше металлов фиксатор. Избегайте размытие крови вниз стороне трубки.
- Использование регулярных (вперед) пипеткой техники, пипетки 100 мкл смешанного панели меченых антител (см. Таблицу 1) в Trucount трубку. Закройте пробирку крышкой и вихревых на низкой скорости в течение примерно 15 секунд, чтобы смешаться. Осмотрите трубки для того, чтобы шарик осадок полностью растворится.
- Инкубируйте Trucount трубку в течение 15 минут при комнатной температуре (15-30 ° C) в темноте.
- При необходимости, разбавить аликвоты 10 × FACS Лизирующий решение 1X использованием DIH 2 O. Добавить 900 мкл 1 × FACS Лизирующий решение трубку.
- Закройте пробирку крышкой и тщательно вихря на низкой скорости в течение примерно 15 секунд, чтобы смешаться. Надавите на крышку вниз твердо в положение фиксации на трубе и печать с фильма лаборатории.
- Хранить трубки при -65 ° C до -95 ° C, пока образец готов для отправки в центральной лаборатории анализа или для анализа в доме. Образцы стабильны на данном этапе, по крайней мере, четыре недели. Если грузить или анализом непосредственно, этот шаг может быть опущен.
3. Судоходство
Примечание: Следующие инструкции используют изолированные системы доставки от Saf-T-Пак, Inc, специально предназначенные для доставки категории B освобождаются биологических веществ в соответствии с международными воздуха и транспорта (ИАТА) положений. Если в результате анализа образцов в том же месте, окрашивание произошло, перейдите в раздел 4.
- Образцы могут быть отправлены сразу после окрашивания или после их замораживают при -65 ° C до -95 ° C. Оберните каждую трубу полностью в фольгу и положите в коробку окрашенных образцов. Поместите окрашенные окна образца внутри герметичной поли-мешок с абсорбирующим материалом.
- Поместите герметичный поли-пакет и содержимое в сумку Tyvek и печать с минимальным воздухе как можно в сумке.
- Поместите образец пакета (образец внутри вторичной упаковки) во внутренней коричневой коробке.
- Поместите внутреннюю коричневый бвола внутри грудной клетки пенопласта, закрепив его в углубление для предотвращения смещения.
- Заполните груди пенополистирола с помощью сухого льда (около 8 кг) и поместите крышку плотно на груди.
- Безопасное ленты транспортную коробку и корабль, как биологическое вещество, категория B (UN3373) с соответствующим Dry Ice (UN1845) маркировки; следить IATA PI-650 инструкций.
- После получения, образцы хранятся при -65 ° C до -95 ° C, пока не будут проанализированы.
4. Размораживание и анализа проточной цитометрии
- Снимите окрашенных образцов из морозильной камеры таять при комнатной температуре в темноте до сбора на проточной цитометрии. Если сбор данных о более чем одного образца, стандартизировать процесс для всех труб шатаясь оттаивания так, чтобы трубы не сидят при комнатной температуре в течение более 1 часа каждый.
- Образцы должны быть приобретены с использованием четырех цитометра лазерных оборудованы соответствующими фильтрами, таких как BD LSRII. Используйте стандартные калибровки цитометра и флуоресцентных методов компенсации для сбора данных 4.
Примечание: Не устанавливайте вперед разброс порогов или боковой разброс во время сбора 5. Trucount бисер может упасть ниже минимально возможных пороговые значения для этих параметров вызывает множество шариков, чтобы не учитывается при анализе. Если требуется инструмент для установки порогового значения, установить минимально возможных Am Голубой канал порог. Потому что CD45 + лейкоциты окрашенных панелей будет Am Голубой положительные, и Trucount бисер также светиться в Am Голубой канал, это должно обеспечить все необходимые данные, чтобы быть надлежащим образом собраны.
- Vortex пробирку в течение 5 секунд до погрузки на проточной цитометрии. Trucount бисером флуоресцирует очень во многих каналов. Ворота бисер во время сбора, найдя населения, которая очень двойного положительного для ПЭ Cy5 и APC (два колоRS, что наиболее легко отличить бусы из клеток может изменяться в зависимости от аппаратуры). Выберите борта ворота, как ваша остановка ворот, и записи данных до минимум 20.000 бисер приобрел.
- Анализ данных с помощью соответствующего программного обеспечения, таких как FlowJo (Treestar; Ashland, OR). На рисунке 1 показана схема стробирования используются для анализа различных популяций лейкоцитов от представителя ничьей крови контролем.
5. Trucount Расчеты
- Каждая трубка Trucount содержит лиофилизированный осадок люминесцентные бусины. После добавления жидкости в трубе и встряхиванием, шарики должны стать равномерно распределены по всему образцу. Количество бусин в гранулах немного отличается от номера партии и могут быть найдены на хранение сумку для труб.
- Ворота Trucount бисером и клеточных популяций, как показано на Рисунке 1, чтобы определить событие рассчитывает для каждой группы населения. Сравнивая количество событий яп борта ворота общее количество бисера, первоначально в трубе позволят вам определить соотношение собранных образцов, которые затем могут быть использованы для определения абсолютных концентраций (например, клеток / мкл) для каждой группы населения. Следующее уравнение может быть использовано для этой цели: Сотовый концентрации (# клеток / мкл цельной крови) = [# население события / (# шарик события / # общем бусины в гранулах)] / 100 мкл.
6. Представитель Результаты
Рисунок 1. Gating схема использована для анализа основных популяций лейкоцитов показывает репрезентативные данные от здоровых добровольцев. A) Trucount шарики (я) являются закрытого типа, и исключить из клетки. Гранулоцитов (II) очерчены и lympohcytes и моноциты делятся на 3 popluations: CD14отрицательное лимфоцитов (III), все негативные клетки CD14 (IV), и не-лимфоцитов (V). B) CD14 отрицательными лимфоциты закрытом отличить CD4 + Т-клеток (VI), CD8 + Т-клеток (VII), В-клетки (VIII), CD56 яркие NK клеток (IX), CD56 тусклом клеток NK (х) и CD56 отрицательными NK клеток (XI). C) Все CD14 негативные клетки являются закрытом отличить миелоидного (XII) и плазмацитоидных (XIII), дендритные клетки. D) Non-lympocytes являются закрытом отличить неклассической (XIV), промежуточный (XV), и классический (XVI) моноциты. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Более конкретная ячейка подмножества, которые не показаны на рисунке 1 (например, NKT клетки или нейтрофилы) также можно отличить с помощью панели мы представляем, и литниковой системы могут быть расширены или изменены в соответствии с конкретными потребностями исследования. Определенные шаги стробирования показаны уникальные для данного метода. Следует особо отметить, включение ворот иИсключение ворот тянутся по всему Trucount бисером и размещены на верхней части друг друга, один к воротам шарики для подсчета, и один, чтобы исключить бусы из сотовых анализа (рис. 1А). Кроме того, поскольку лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов не так легко отличить в цельной крови, как в мононуклеарных клетках периферической крови от рассеяния вперед и боковой разброс, стробирование этих клеток с помощью экспрессии CD45 и боковой разброс часто необходимо (рис. 1А). Загрязняющие гранулоцитов (в кружке), которые не могут быть отделены от лимфоцитов и моноцитов использованием CD45 и боковой разброс различимы в некоторых участках их высокой CD16 выражении (рис. 1С и рис. 1D). Количество загрязняющих гранулоцитов, как правило, небольшие, и они не мешают моноцитов и NK клетки стробирования.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В данном отчете мы представляем шарик на основе метода для перечисления популяции лейкоцитов в свежей цельной крови методом проточной цитометрии и охватывают параметры, необходимые для его использования в многоцентровых клинических испытаний с централизованным анализом образцов. Этот метод основан на и оптимизирует протокол BD Trucount и дает возможность ее надежного использования в многоцентровых клинических испытаний. Окрашивание теста проста и занимает около 45 минут для выполнения, что делает его возможным для крови...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы благодарим Джессика Джонс, Эрик Кларк, Констанция Ducar, Донна Смит, Рой Льюис, Лили Apedaile, Джоан Визнер, Девин Адамс, Кори McBain и Стивен Voght за их помощь в развитии этого метода, рукописи и видео.
Эта работа была поддержана Фондом Билла и Мелинды Гейтс грант CAVD 38645 (MJM) и Национального института здоровья гранты UM1 AI068618 и U01 AI069481 (MJM). EA-N. при поддержке гранта NIH T32 AI007140. Мы благодарим Джеймс Б. Пендлтон благотворительного фонда за их щедрые пожертвования оборудованием.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Реагент Имя | Компания | Номер в каталоге | |
| Trucount Абсолютный подсчет труб | BD Biosciences | 340334 | |
| 10X FACS Lysing Solution | BD Biosciences | 349202 | |
| Категория B & Освобожденный система доставки, изолированный | Saf-T-Pak | STP-320 | |
| AmCyan CD45 моноклональных антител | BD Biosciences | 339192 | |
| CD3 FITC моноклональных антител | BD Biosciences | 349201 | |
| CD8 PerCP-Су 5,5 моноклональных антител | BD Biosciences | 341051 | |
| CD4 Alexa Fluor 700 моноклональные Antiboду | BD Biosciences | 557922 | |
| HLA-DR ECD моноклональных антител | Beckman Coulter | IM3636 | |
| V450 CD14 моноклональных антител | BD Biosciences | 560349 | |
| CD19 PE моноклональных антител | BD Biosciences | 555413 | |
| CD16 APC-H7 моноклональных антител | BD Biosciences | 560195 | |
| CD56 PE-Cy7 моноклональных антител | BD Biosciences | 335791 | |
| CD11c APC моноклональных антител | BD Biosciences | 559877 | |
| CD123 PE-Cy5 моноклональных антител | BD Biosciences | 551065 |
Ссылки
- Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing. Cryobiology. 27, 269-278 (1990).
- Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories. Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).
- Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure. Blood. 56, 237-245 (1980).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).
- Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry. 42, 327-346 (2000).
- Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials. J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).
- Kantor, A. B., Roederer, M. The handbook of Experimental Immunology. Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. 43, 1-49 (1996).
- Hulspas, R. Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates. Cytometry A. 75, 966-972 (2009).
- Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism. Cytometry A. 75, 882-890 (2009).
- Mandy, F., Brando, B. Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6(2001).
- Vuckovic, S. Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay. J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).
- Lichtner, M. Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response. Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).
- Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram. Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
