Передача вирусов растений Использование Белокрылки

Краткое содержание

Улучшение понимания и способности управлять многие из передаваемых насекомыми вирусов растений требует использования вектора. Насекомых передачи вирусов растений является tritrophic взаимодействия и, соответственно, требует манипуляции насекомых, вирусов и растения. Векторы должны выращиваться в больших количествах и манипулировать таким образом, чтобы обеспечить высокий уровень передачи испытуемых растений. Основы воспитания и манипулирования белокрылки, Bemisa tabaci ( Hemiptera: Aleyrodidae), Вектор растительных вирусов, принадлежащих к родам несколько новых вирусов растений, представляющих большое количество экономически значимые вирусов представлена.

Аннотация

Белокрылки, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, комплекс морфологически indistinquishable видов ^5, являются переносчиками многих вирусов растений. Некоторые виды этих белокрылки передающейся вирусов растений (Begomovirus, Carlavirus, Crinivirus, Ipomovirus, Torradovirus) включают несколько сотен видов новых и экономически значимых возбудителей важные продукты питания и лубяных культур (обзор ^9,10,16). Эти вирусы не размножаются в их вектора, но тем не менее, легко перемещаются от растения к растению взрослые белокрылки с помощью различных средств (обзор ^{2,6,7,9,10,11,17).} Для большинства из этих вирусов белокрылки кормления необходимы для приобретения и прививки, а для других только зондирование требуется. Многие из этих вирусов не могут или не могут быть легко передаются другим способом. Поэтому поддержание культуры вируса, биологических и молекулярных характеристик (определение круга хозяев и симптомы) ^3,13, Экология ^2,12, требуют, чтобы вирусы передаются хостов, используя экспериментальные белокрылки вектор. Кроме того, разработка новых подходов к управлению, такие как оценка новых химических веществ ¹⁴ или соединения ^15, новый культурных подходов ^1,4,19 или выбора и разработки устойчивых сортов ^7,8,18, требует использования для белокрылки передачи вируса. Использование белокрылки передачи вирусов растений для отбора и развития устойчивых сортов в селекционных программах задача представляется особенно сложной ^7. Эффективное отбора и скрининга на сопротивление использует большое количество растений и существует необходимость в 100% растений быть защищен для того, чтобы найти несколько генотипов, которые обладают генами устойчивости. Эти исследования используют очень большое количество белокрылки содержащий вирус, часто по нескольку раз в год.

Белокрылки обслуживания описанные здесь, могут генерировать сотни или тысячивзрослой белокрылки на растениях каждую неделю, круглый год, без загрязнения других вирусов растений. Растения от обеих белокрылки и вирус должен быть произведен ввести в белокрылки колонии каждую неделю. Белокрылки культур должны быть свободны от белокрылки патогенов, паразитов и паразитов, которые могут уменьшить белокрылки населения и / или снижения эффективности передачи вируса. Колонии, полученную способом, описанным может быть быстро масштабируется для увеличения или уменьшения численности населения в случае необходимости, и может быть скорректировано с учетом кормления предпочтений белокрылки на основе растения-хозяина вируса.

Существуют два основных типа белокрылки колонии, которые могут быть сохранены: nonviruliferous и колонии содержащий вирус белокрылки. Колонии nonviruliferous состоит из белокрылки вскормленных на незараженных растений и позволяет еженедельно наличие белокрылки, которые могут быть использованы для передачи вирусов из разных культур. Колония содержащий вирус белокрылки,состоит из белокрылки воспитанных на инфицированные вирусом растений, позволяет еженедельно наличие белокрылки, которые приобрели вирус что предупреждает один шаг в процессе передачи вируса.

Протокол

1. Белокрылки обслуживание колонии

1. Условия окружающей среды: белокрылка колониях должны быть сохранены в контролируемой комнате роста. Контроль относительной влажности, температуры, фотопериода, а интенсивность света имеют важное значение для оптимального роста колонии (рис. 1). Температура 28 ° C, относительной влажности 30-50%, и 14 часов светового даст колонии, которая развивается от яйца до взрослого появление в 18 дней (это время варьируется в зависимости от растения-хозяина). Относительная влажность воздуха должна быть ниже 70%, чтобы препятствовать росту насекомых и растений грибковыми патогенами. Нормы удобрений и полива должна быть уменьшена, чтобы препятствовать грибковых патогенов и накопление солей. Интенсивность света для колонии должна быть достаточно высокой. VHO люминесцентных ламп, используемых в достаточном количестве, чтобы генерировать около 800-1000 футов свечи на высоте полога подходят для большинства растений (то есть. Хлопок, фасоль обыкновенную, Лима фасоль, помидор). Чистота имеет важное значение вбелокрылка колонии для поддержания оптимальных условий выращивания.
2. Колония клетки: Белокрылки должна поддерживаться на растениях в клетках, а не бесплатное в росте комнате. Клетки могут быть изготовлены из различных материалов, но должна обеспечивать: вентиляции, простота доступа, способность предотвращать белокрылки утечки или просачивание и достаточного размера, чтобы поддерживать достаточно растений для генерации белокрылки населения необходимо. Хорошие результаты были получены с использованием органзы плюс алюминиевая скрининга (для прочности), а также доказательства белокрылки-скрининга (см. таблицу специального оборудования и расходных материалов).
3. Подготовка колонии растения: виды растений выбраны является важным фактором при запуске белокрылки колонии. Завод должен быть в состоянии поддерживать высокий населения насекомых без разрушения. Растение выбрано для колонии nonviruliferous должна быть нехозяев для вируса или вирусы, которые предназначены для передачи, чтобы избежать загрязнения в колонии и если поддержание viruliferous колонии, он должен быть хозяин вируса. Растения должны расти достаточно быстро, чтобы поддерживать появление новых взрослых в течение 18 дней с момента введен в колонии, но не так быстро как перерастать клетки в течение четырех недель. Гном, куст, или патио типа сортов растений рекомендуется, поскольку они часто производят аналогичную площадь листьев высоких сортов, но без в трубку.
4. Очень важно, чтобы задняя растений для колонии в теплицах в клетках, которые исключают белокрылки и других насекомых. Использование растений, которые являются зараженные белокрылки, трипсы, или клещей до их проникновения в колонию может привести к краху колонии. Зараженные растения также имеют потенциал, чтобы быть заражены насекомыми вирусов, которые будут мешать исследования передаче вируса.

2. Белокрылки Создание колонии

1. Начать колонию в первый раз используя чистую белокрылки - те, бесплатное вирусов растений, других насекомых, патогенов и насекомых. Они могут быть полученыиз соавторов или с поля. Если в поле собирать, белокрылки должны воспитываться в течение не менее 8 недель на нехозяев растений вирусов растений, и проверить его на отсутствие симптомов растения, чтобы убедиться, что они свободны от вирусов растений.
2. Неделя 1: Внедрение чистых белокрылки на первую клетку растения. Белокрылки могут быть введены стремление известные номера или, осторожно встряхивая белокрылки из другого источника растений в зависимости от требований к колонии. В выходные 1, белокрылки которые откладывают яйца на нижнюю поверхность листьев растений. Приблизительная численность населения может быть предсказано для каждого появления в зависимости от количества взрослых использоваться, чтобы отложить яйца и среднее количество яиц, отложенных самкой белокрылки на растения-хозяина в вопросе.
3. Неделя 2: начинайте другую клетку путем введения белокрылки новых растений-хозяев, чтобы отложить яйца. Растений в клетке начались в неделю 1 будет иметь яйца, и некоторые незрелые белокрылки покрытие нижней стороне листьев (рис. 2). Некоторыевзрослые белокрылки введена в течение 1 недели еще будет жив.
4. Неделя 3: Начните третий клетку путем введения белокрылки новым растениям, чтобы отложить яйца. Растения в клетке начались на неделе 1 будет незрелым, а также много новых взрослых белокрылок возникающих и там должно быть очень заметному увеличению взрослого населения белокрылки. Растения в клетке начались на неделе 2 будет иметь много яиц и незрелых белокрылки охватывающих нижней стороне листьев.
5. Неделя 4: Начало четвертую клетку путем введения белокрылки новым растениям, чтобы отложить яйца. Растений в клетке начались в неделю 1 будет много взрослых белокрылок, которые являются приблизительно одной недели после появления всходов. Растения в клетке начались на неделе 2 будет иметь много новых взрослых белокрылок возникающих и там должно быть очень заметным увеличением белокрылки населения. Растения в клетку начался во время недели 3 будет иметь много яиц и незрелых белокрылки охватывающих нижней стороне листьев.
6. Неделю после первых 4 крошечныйKS: Каждую неделю, начать новую клетку путем введения взрослой белокрылки из четвертого старейших клетку (клетка начались на неделе 1) на новых заводах в новые, чистые клетки. Старая клетка должна быть удалена и свои заводы выбрасывают. Эти белокрылки около 1 недели после появления всходов. В случае колонии содержащий вирус, эти белокрылки будет передавать вирус на новые растения, а также откладывают яйца для следующего поколения белокрылки.
7. Эксперименты план передачи использовать белокрылки, которые будут возникать в клетке третьей недели. Если больше белокрылки необходимы, растение чисел может быть увеличена, а более белокрылки могут быть добавлены в неделю одна клетка увеличить белокрылки населения.

3. Метод прививки испытуемых растений

1. Для обеспечения высокой скорости передачи данных: 1) Белокрылки должны быть обработаны как можно осторожнее, чтобы не повредить насекомое, которое приведет к сокращению скорости передачи данных, 2) Там должна быть адекватной площади листа доступны для белокрылки к СПЭее зондом или корма. Увеличение времени приобретение или увеличение количества растений приобретение хост может увеличить низкие цены инфекционности в опытных растений за счет вытеснения или в приобретении или периода прививки доступа.
2. Коллекция Белокрылки. Ниже процедура сбора и движение точное количество белокрылки необходимые для экспериментальных целей. Для перемещения большого количества белокрылки, как это необходимо для сопротивления скрининг например, необходимо лишь слегка встряхнуть белокрылки-зараженных растений в течение испытуемых растений или инфицированных вирусом приобретение хостов (а позже испытуемых растений). Будьте уверены, чтобы поколебать растений в течение многих объектов для минимизации эффектов агрегации.
3. Недавно появились взрослые белокрылки (1-3 дней после всходов) обладают высокой активностью и кормят так часто, как правило, дают самую высокую скорость передачи данных ^4. Старые белокрылки еще передать, но на более низкой частоте. Несколько белокрылки на тест растение (15-40 плаNT) следует использовать для высоких скоростей передачи, так как соотношение 1 белокрылки на растение часто приводит к неприемлемо низкой скорости передачи ^3,4. Число необходимых зависеть от вирусов и виды приобретения и опытных растений.
4. Соберите стремление устройств и коллекции флаконов. (Рис. 3)
5. С одной стороны, провести желтые пластиковые карты внутри колонии клетку, содержащую белокрылки быть собрана. Слегка постучите растений для поощрения взрослых белокрылки летать. Белокрылки будут привлечены к желтую карточку, и будет летать с завода на карте, где они могут собираться с помощью аспиратора и очень нежным дыханием. Никогда не аспирации белокрылки, которые питаются растениями. Их стилеты, внедренных на заводе во время кормления так тянет их с растениями будут нарушать их стилеты и лишение их возможности либо приобрести или передачи вируса (рис. 4).
6. Собрать около 20 взрослых белокрылки в единый Коллеие флакон, чтобы минимизировать физические повреждения насекомыми от повторных устремлений (рис. 5).
7. Чтобы изменить коллекцию флакон, мягко нажмите на флакон на твердую поверхность и колпачок с парафильмом в то время как белокрылки дезориентированы от нарезания резьбы.
8. Поместите новую собирать флакон на аспиратор и повторяют, пока число белокрылки необходимо не собираются. Белокрылки может оставаться в коллекции флаконов при комнатной температуре в течение нескольких часов.
9. Приобретения. Белокрылки размещаются на инфицированных вирусом растений и разрешили питаться зараженных растений в течение 48-72 часов. Приобретение срок более 72 часов, как правило, не увеличивает скорость передачи данных. Для тех, вирусы передаваться в непостоянные или semipersistent образом, 1 час до нескольких часов, соответственно, являются достаточными получение доступа периоды (табл. 1). Лучшие результаты получаются, когда белокрылки бесплатно получают доступ к в клетках растений, удерживающие насекомых одного растения илинесколько растений. Однако некоторые эксперименты требуют приобретения у конкретного листья, в которых клетки случай клип может быть использован. При использовании клипа клетки важно, чтобы приспособить белокрылки предпочтение кормления нижней стороне листьев. Кроме того, скученность белокрылки в клипе клетки может уменьшить скорость передачи данных - приемлемые скорости передачи были достигнуты с использованием 10 женщин белокрылки за клип клетку 2,5 см в диаметре.
10. Прививка. Подготовка клетке, соответствующий размеру после заражения и поместить испытуемых растений внутри. Если только один завод должен быть засеяна рассмотреть одну клетку растения. Если более чем один завод должен быть засеяна рассмотрим небольшой ПВХ кадров / органзы клетке сумке или клетке алюминия (рис. 6). Размер клетки использовали для инокуляции должна быть немного больше размер завода (ы) быть защищен. Более высоких скоростях передачи получаются, когда белокрылки находятся недалеко от завода купол и не дали много свободного пространства.
11. Коллекция белокрылки с приобретением хостов зависит от потребностей эксперимента. При небольшом количестве необходимы, аспирации белокрылки, как описано выше. Поместите коллекцию флаконов белокрылки в клетке рядом с растениями и снимите крышку (рис. 7). Откройте флакон и отпустите белокрылки или инвертировать и мягко нажмите на флакон, чтобы освободить белокрылки. Если большое количество необходимых просто переместить приобретении растения с белокрылки в садки, где тест заводы расположены и аккуратно встряхните белокрылки от растения-хозяина приобретения. Для обоих типов введения, обязательно распределять белокрылки через растения, чтобы минимизировать агрегацию и обеспечить равномерное прививки.
12. Разрешить белокрылки, чтобы исследовать или корм для соответствующего количества времени, снова зависит от вирусов и до некоторой степени растения-хозяина (таблица 1).
13. Проверьте белокрылки по крайней мере один раз в течение периода прививки доступа для обеспечения того, белокрылки являютсяпрощупывания или кормления, открыв клетку и переворачивая некоторых листьев на каждом растении.
14. Для более длительных периодов прививки доступа, нарушают растения осторожно (с помощью бамбуковой палкой или эквивалент), чтобы почистить вершины заводов и поощрять белокрылки перераспределить на растения. Перераспределение белокрылки помогает обеспечить более высокую скорость передачи путем противодействия естественной тенденцией белокрылки к агрегации.
15. Прекращение. Период прививки доступ закончился, убивая белокрылки с утвержденными химических веществ. Нанесите два инсектициды один за другим: контактный инсектицид быстро прекратить взрослые белокрылки и системный инсектицид прекратить любые белокрылки, которые развиваются в течение следующих недель и те, пропущенные контактный инсектицид (рис. 8). Контактный инсектицид, таких как инсектицидные мыла и системные инсектициды, такие как имидаклопридом или пиметрозин были использованы с хорошим успехом.

Результаты

Эти методы для создания колонии белокрылки и техническому обслуживанию, а также манипуляции для передачи вирусов растений успешно используются в ряде исследований, ^4,11,12,14, а также многие другие не приводятся. С помощью этих методов с постоянно передается вирусы, мы обычно получены требуемые скорости передачи 100% для селекции на устойчивость, скрининг инсектицидов на их способность препятствовать передачи (и оценки соединений, индуцирующих резистентность) ^13,14,17,18 ( Рисунок 9). Процедуры, описанные здесь могут и были быть адаптированы к многих местах в государственных и частных научно-исследовательских учреждений.

Тип коробки передач	Приобретение Периода доступа (час)	Прививка Периода доступа (час)	Ссылка
Непостоянные	1	10
Semipersistent	6-24	8-24	10, 16
Стойкий	48-72	48-72	3, 6, 8, 9

2-24

Таблица 1. Расчетное время которые могут быть использованы для получения высоких показателей передачи вирусов с различными типами отношений с вектором Bemisia tabaci вид комплекса. Оценка раза основаны на опубликованных минимальное время, необходимое для передачи 80-100% и модифицированный в некоторых случаях для учета латентные периоды и различия между населением белокрылки, вирусов и растений-хозяев.

Рисунок 1. Пример колонии содержащий вирус белокрылки. Этот рост помещение содержит клетки растений, пораженных begomovirus и инфоюSTED с белокрылки содержащий вирус.

Рисунок 2. Слева: неполовозрелых стадий белокрылки, Bemisia tabaci Меам клады смысле слова Де Барро ⁶ около 1 недели после появления всходов и право: взрослые белокрылки, эффективным вектором многие вирусы растений.

Рисунок 3. Типы коллекцию устройств, которые могут быть использованы для сбора белокрылки растений передачи вируса.

Рисунок 4. Слева: Желтая карточка пластик, используемый для сбора белокрылки взрослых показывает белокрылки готова к коллекции . Право: Сбор белокрылки из желтой пластиковой карты. Белокрылки можно увидеть на карте в виде небольших белых / серых пятен.

Рисунок 5. Белокрылки собранные аспирации (20 во флаконе) из колонии готова к опроса или прививки.

Рисунок 6. Вверху слева:. Отдельных клетках растений, используемых для опроса или прививки справа сверху: больше клеток из ПВХ трубы и органзы. Нижняя: алюминий / экрана и органза клетки в теплице растений, содержащих предназначенные для белокрылки колонии.

32fig7.jpg "/>
Рисунок 7. Белокрылки передаются одно растение для прививки (или приобретения).

Рисунок 8. Добавление системным инсектицидом мочить прекратить доступ белокрылки период прививки.

Рисунок 9. Поле растений при оценке устойчивости к вирусу желтой Томатный завиток листа. Все растения были привиты как 5 недели сеянцы, а затем пересаживаются на поле для оценки. Растения на переднем плане устойчивые линии зародышевой плазмы, растения в фоновом режиме восприимчивы линии зародышевой плазмы.

Обсуждение

Методы, описанные здесь, были разработаны в течение двух лет и основаны на основной информации, предоставленной многих исследований белокрылки передачи, поведение и биологии. Так как существует много публикаций, эта рукопись относится прежде всего к отзывам и несколько выбранных конкретных публикаций, чтобы проиллюстрировать, какие данные используются для разработки этой техники. Это очень важно в этой процедуре, что белокрылки обрабатываются осторожно, так как нарушение ноги и антенны могут привести к нарушениям поведения и низким показателем передачи ВИЧ. Коллекция с пылесосов и других механических всасывающих устройств никогда не производил хорошие результаты. Другим аспектом успеха в том, что количество белокрылки использованы для получения 100% передачи испытуемых растений, должны быть определены для каждой комбинации растения-хозяина и вируса. Это оптимальное соотношение только должен быть установлен один раз. Наилучшие результаты были получены при использовании молодых взрослых белокрылок (1-3 дня появления прошлом), поскольку они §,ив самых высоких скоростях передачи. Пожилые люди могут быть использованы, но большее количество белокрылки будут необходимы, чтобы компенсировать их снижение уровня передачи. Женщины, как известно, передают по более высоким ставкам, чем мужчины, так как они питаются чаще, чем мужчины. Однако это, как правило, не стоит время, чтобы отделить полов для передачи. Эта процедура может быть модифицирован различными способами в соответствии с ресурсов и потребностей исследователя.

При работе с несколькими вирусами лучше всего держать отдельную колонию белокрылки воспитанных на нехозяев растений вируса. Эти белокрылки могут быть собраны размещены на вирус-инфицированных растений на приобретение и затем после приобретения белокрылки, можно снова к испытуемых растений. Установок, предназначенных для колонии должны быть выращены в теплицах в клетках, чтобы предотвратить введение белокрылки, способных заразить его с другим вирусом. Заражение этих растений с клещами, трипсов и других вредителей растений может поставить под угрозу чДОРОВЬЕ колонии и привести к ее краху. Наконец полива растений колонии должно быть сделано с большой осторожностью. Эти растения подвергаются колоссальным стрессом, кормление так много белокрылки и ниже нормальных условиях освещения. Гниения корней грибов, которые вводятся на торфе в незапятнанный смесей может стать проблемой, если растения overwatered ни разу. Предварительная обработка растений с фунгицидом промокания может устранить некоторые проблемы.

В то время как белокрылка передачи вирусов растений может занять много времени и требуют ценные ресурсы (такие как рост номеров) очень важно для передачи некоторых вирусов, для которых у нас нет других средств передачи. Он также является ценным средством скрининга растений на устойчивость к вирусам, так как она использует тот же тип передачи, что растения в области будет оказывать сопротивление. Использование более искусственных средств передачи не всегда дают лучшие результаты в оценки зародышевой плазмы для ViruS-сопротивления.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название товара<	strong>Company<	strong>Каталожный No	Комментарии (необязательно)Whitefly
proof screening	Klayman Meteor Ltd. Petah Tikva 49130, Israel	---	BioNet 50 mesh screen Антивирусный экран от насекомых
Whitefly proof screening	Hummert International (www.hummert.com)	27-4050-1 - 27-4062-1	Экран BioNet 50 меш Антивирусный экран от насекомых
Устройства для сбора белокрылки	BioQuip	1135A	также могут быть изготовлены с использованием глазных пипеток, гибких пластиковых трубок, пластиковых вакуумных адаптеров и марли
Флаконы для сбора	BioQuip	8909	Используемые флаконы зависят от используемого аспиратора.
Желтые пластиковые карты	любой компании	---	Подойдет любая ярко-желтая пластиковая карта, ее можно приобрести во многих местах.
Клетки для белокрылки	---	---	Они не доступны в продаже и должны быть изготовлены. Клетки 60 см x 60 см x 60 см хорошо подходят для нас. Мы отдаем предпочтение тем, которые изготовлены из алюминиевых оконных экранов, нейлоновой органди, винилового пластика, со структурой, созданной с использованием алюминиевых оконных рам. Двери крепятся с помощью рояльных петель и герметизируются с помощью уплотнительной защиты; Верхние части клеток выполнены из винилового пластика. Клетки также могут быть изготовлены из: 1) оргстекла, склеенного по краям, с вентиляцией, обеспечиваемой экранированными отверстиями, вырезанными на боковых деталях; 2) большие мешки из нейлоновой органди, органзы или фильтра из белокрылки 50 меш с внутренними опорами, обеспечиваемыми трубами из ПВХ и фитингами, нарезанными до нужной длины и собранными внутри мешков, 3) деревянные рамы и нейлоновая органди, органза или фильтр из белокрылки 50 меш.