Методическая статья

Быстрая и эффективная генерация нейронов из стволовых клеток человека плюрипотентных в Multititre Формат плиты

DOI:

10.3791/4335

⸱

5 марта 2013 г.

 ,  , 
1Max Planck Institute for Molecular Biomedicine, 2Medical Faculty, University of Münster

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протоколы для нейрональной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs), часто отнимает много времени и потребует значительных навыков культуры клеток. Здесь мы адаптировали небольшая молекула на основе дифференциации процедуры в формат пластин multititre, позволяющий простым, быстрым и эффективным поколения человеческие нейроны в управляемом режиме.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Существующие протоколы для генерации нейроны из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs), часто утомительной в том, что они многоступенчатой ​​процедуры, связанные с выделением и расширением нейронных клеток-предшественников, до терминальной дифференцировки. По сравнению с этим трудоемким подходы, недавно мы обнаружили, что комбинированное торможение тремя сигнальными путями, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, и FGF / ERK, способствует быстрой индукции нейроэктодермы от hPSCs, с последующим немедленным дифференциации в функциональные нейроны. Здесь мы адаптировали нашу процедуру новый формат пластин multititre, дальнейшего повышения ее воспроизводимости и сделать его совместимым с середины пропускная способность приложений. Она включает в себя четыре дня нейроэктодермы образование в плавающих сфер (эмбриоидных органов), а затем еще четыре дня дифференциацию в нейроны под приверженцем условиях. Большинство клеток, полученных с помощью этого протокола, кажется, биполярное сенсорных нейронов. Кроме того,Процедура очень эффективна, не требует особых навыков эксперта, и основан на простом химически определенной среде с экономичным малых молекул. Благодаря этим особенностям, процедура может служить полезной платформой для дальнейшего функционального расследования, а также для клеточного скрининга приближается требующих человеческих сенсорных нейронов или нейронов любого типа.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hPSCs, включая эмбрионов, полученных человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), являются плюрипотентных смысле, что они могут дать повод для разных линий клеток в лабораторных условиях 1-2. Многочисленные дифференцированных типов клеток были получены из ЭСК на сегодняшний день, подтверждая мнение, что эти клетки представляют ценный инструмент для научных исследований и клеточных подходов скрининга, а также перспективны для клеточной терапии.

Нейронные протоколов дифференциации ЭСК, как правило, сложный и трудоемкий, поскольку они часто основаны на первом вызывающие общий нервный судьбы, после чего руководство изоляции нейронных предшественников, и последующей дифференциации терминал в данном нейроне типа интересом 3-6. В некоторых связи, эта сложность не удивительно и неизбежным, учитывая, что такое государство-оф-искусство направлены протоколы дифференциации, как правило, поэтапно имитировать раннее развитие человеческого потенциала, whicч само по себе чрезвычайно сложно. С другой стороны, оно может частично отражать наше отсутствие понимания основных молекулярных процессов, в результате дифференциации протоколов, которые еще далеко не полностью оптимизирована.

Что касается превращения недифференцированных hPSCs в нейроэктодермы, Пера и соавт. Установлено, что подавление BMP / SMAD1/5/8 сигнализации повышает нейронной индукции ЭСК 7. Кроме того, инактивация SMAD2 / 3 сигнализация была показана способствовать формированию нейроэктодермы 8. Соответственно, в сочетании инактивации этих двух путей имеет тенденцию приводить к более эффективному нейронной индукции hPSCs 4,9. Совсем недавно, мы показали, что третий сигнальный путь, FGF / ERK, служит сильным репрессор из первых шагов обязательства нейроэктодермальных в ЭСК. С другой стороны, одновременное подавление всех этих трех путей приводит к почти однородным преобразованием ЭСК в нейроэктодермы свсего за четыре дня 10. Впоследствии, высокоэффективных терминальной дифференцировке в функциональные нейроны наблюдалось в течение восьми дней. Нейроны были получены, вероятно, будет сенсорных нейронах периферической нервной системы, которое может частично объяснить их быстрого вывода 10. Дефекты в сенсорных нейронов обслуживания считается причиной некоторых болезней человека, таких как семейные Dysautonomia 11. Для моделирования таких заболеваний, основанный на технологии hiPSC 12, для дальнейшего функциональные характеристики, а также для прикладных целей, не требующих особого типа нейронов, эта дифференциация процедуры могут представлять собой полезную основу.

Тем не менее, стратегия дифференциации мы изначально занято участвуют формирования эмбриональных органов (ЭТ) от скопления колоний ЭСК 10, и это привело к довольно степень неоднородности в отношении EB размеров, а также появилась на компромисс нейрона эффективности формирования в некоторых сеLL линий. Кроме того, из-за неоднородности в размерах EB, способность к систематическому проверить эффекты дополнительных факторов роста или малых молекул, во время и после формирования нейронов, казалось, несколько сбит с толку.

В этом докладе мы адаптировали нашу предыдущую процедуру для средней пропускной совместимы, вынуждены агрегации на основе техники для создания ЭТ в высшей степени размер контролируемой форме, а также показаны в других контекстах 13. Впоследствии ЭТ генерируется в V-формы лунки 96-луночных были переданы в П-образной ультра-низким вложений 96-луночные планшеты, инициировать нейроэктодермы образование в суспензии. Четыре дня спустя, ЭТ может быть высевают что приводит к терминально дифференцированные нейроны с высокой эффективностью и однородностью. Кроме того, день-4 ЭТ были распадается на отдельные клетки и высевают, как такие, в результате которых низкой плотности монослоя человеческих нейронов. Когерентные результаты были получены до сих пор с двумя независимыми де-rived линий ЭСК, HuES6 и NCl3.

В качестве предпосылки, успешное формирование EB было строго зависит от использования синтетических полимеров, поливинилового спирта (ПВС), вместе с рок-ингибитор Y-27632 известно, способствуют выживанию чЭСК 13-14. В результате, однородность ЭТ формируется в 96-V-пластины были существенно расширены по сравнению с формирования ЭТ как массовое культур на основе случайных методов расщепления. Эта система обеспечивает, таким образом значительно улучшить платформу для нейроэктодермы образование в суспензионной культуре, а затем строго контролируемых нейронов при формировании приверженцем условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка Matrigel покрытие пластин и СМИ

  1. Подготовка Matrigel покрытием Matrigel пластины были найдены, чтобы быть предпочтительным субстратом для прикрепления дифференциации ЭТ, а также способствует эффективному вырост нейронов из этих 10.
    1. Оттепель 10 мл Matrigel ночь на льду.
    2. На следующий день, развести желеобразной Matrigel с двумя объемами ледяной DMEM/F-12 и подготовить аликвоты по 1 мл в prechilled 15 мл конические пробирки, которые могут храниться замороженными при -20 ° C.
    3. Решают на пластину формата дифференцировку нейронов. Например, в качестве отправной точки, мы рекомендуем выполнить первый раунд дифференциации в 12-луночный формат. Предварительно прохладно четыре 12-луночных планшетах при 4 ° C. Растворите одну аликвоту замороженных Matrigel путем добавления 9 мл предварительно охлажденного DMEM/F-12 затем с помощью пипетки вверх и вниз, пока все разведенного Matrigel оттаивания и растворяют.
    4. Затем, Передавать содержимое в новый 50 мл пробирку, содержащую 15 мл DMEM/F-12 на льду (конечное разведение Matrigel: 1:75). Затем добавить 0,5 мл разведенной Matrigel в каждую лунку предварительно охлажденные 12-луночных планшетах. Оберните пластин с Parafilm и дать постоять при комнатной температуре в течение ночи.
    5. На следующий день, передавать пластин до 4 ° C. Покрытые пластины можно хранить в течение нескольких недель перед использованием.
  2. Средства массовой информации

EB формирования среднего (~ 15 мл, необходимых для выполнения дифференциации в одном 96-луночный планшет - см. таблицу 1 и схему на рисунке 2):
DMEM/F-12 с 0,4% (PVA)
1x N2
1x B27
0,05% BSA
20 нг / мл FGF2
10 мкм Y-27632
1x PenStrepGln

Дифференциация среднего (~ 30 мл, необходимых для выполнения дифференциации в одном 96-луночный планшет с последующим формированием нейрона в одной Matrigel покрытые 12-луночный планшет, см. таблицу 1):
DMEM/F-12
1x N2
1x B27
0,05% BSA
0,5 мкМ PD0325901
15 SB431542 мкМ
0,5 мкМ Dorsomorphin
1x PenStrepGln

2. Принудительное EB Формирование

  1. Расти hPSCs под нужный фидерных свободных условиях. Мы используем MEF-кондиционированной среды на матригеле покрытием 6-луночных планшетах 15. Тем не менее, другие системы культуры, такие как домашние или коммерческие определены средства массовой информации также должны работать. На момент начала эксперимента дифференциации, hPSCs должна быть суб-вырожденная и активно растет.
  2. Механически удалить спонтанно дифференцировать колонии, используя стерильный пластиковый наконечник пипетки под стерео микроскоп.
  3. Вымойте оставшиеся недифференцированные колонии использованием PBS, и дайджест на одной клетки, используя Accutase 1X содержащие Y-27632. Пелле отдельных клеток путем центрифугирования при 200 мкг в течение 2 мин, ресуспендируют в небольшом объеме EB среднего формирования и определить титр клетки помощью гемоцитометр.
  4. Добавить аликвоты клетокостальные средние формирования EB привести к титр между 40000 и 80000 клеток на мл.
  5. С помощью многоканальной пипетки, передавать 100 мкл на лунку для 96V-нижняя плита, в результате чего 4000 до 8000 клеток на лунку. Спин 96-луночный планшет в свинг-из тарельчатой ​​центрифуге при 400 мкг в течение 1 мин, чтобы собрать клетки в нижней части скважины, и передать культуру клеток инкубатора. ЭТ образуют одну ночь, как показано на рисунке 1.

3. Нейроэктодермы индукционные

  1. На следующий день (день 0), собирать ЭТ от 96V пластины под стерео микроскопа и передаче в небольшом объеме в 3,5 см бактериальной блюдо, содержащий 2 мл дифференциации среды. Аккуратно перемешивать блюдо в течение нескольких секунд, чтобы вымыть EB.
  2. Добавить 100 мкл дифференциации среды в скважине ультра-низким вложение U-дно 96-луночный планшет. В стереомикроскопа, передача ЭТ в небольших объемах из стиральной блюдо в 96U скважин (одна EB за намиLL). Место 96U пластины в культуре клеток инкубаторе в течение 4 дней, чтобы нейроэктодермы образования.

4. Нейрон Формирование

  1. На 4-й день, подготовить стиральную блюдо, как в шаге 3.1 и дополнительно заменить DMEM/F-12 в предварительно нагретой Matrigel покрытые 12-луночный планшет дифференциация среды (1 мл на лунку).
  2. Покрытие из ЭТ
    1. Сбор ЭТ от 96U плиты, мыть этим, как указано выше, и тщательно семя их по одной в лунки Matrigel покрытые 12-луночный планшет (около 8 ЭТ на лунку): EBS должны быть равномерно распределены в пределах скважины, чтобы спокойно следствием нейронов в течение ближайших дней (см. "5-й день" Изображение на рисунке 2).
    2. До передачи на 12-луночный планшет обратно в инкубатор, позволяют ЭТ в свободно закрепить около 10 минут при комнатной температуре. Затем осторожно переносить 12-луночный планшет для культуры клеток инкубатора. Нейроны будет расти из покрытием ЭТ в радиальном порядке в течение следующих 4 дней, а шоWn на рисунке 2 ("8-й день" изображение справа).

5. Нейрон формирование в виде монослоев

  1. В качестве альтернативы шаги пункт 4), на 4 день процедуры, собирать ЭТ в 3,5 см бактериальной блюдо, содержащий 2 мл дифференциации среднего, а затем передать ЭТ в небольшом объеме PBS-содержащих блюдо, а затем в другое блюдо, содержащее Accutase.
  2. Пусть переварить в одиночных камерах, центрифуги при 200 мкг в течение 2 мин, ресуспендируют в небольшом объеме дифференциации среднего и определить титр клетки помощью гемоцитометр. Отрегулируйте титры к 1-2х10 6 клеток на мл, используя дифференциацию среды (без Y-27632).
  3. Пластина клеток в предварительно нагретой Matrigel покрытые 12-луночный планшет (1 мл на лунку), и переход к культуре клеток инкубатора. Нейрон образование в виде монослоев наблюдается между днями 7 до 8 (рис. 3С). Следует отметить, однако, что этот монослой вариантПроцедура не полностью оптимизирована по отношению к выживаемости клеток и наиболее подходящим субстратом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В нашем предыдущем докладе, в соответствии с многими другими, EBS от hPSCs может быть создан просто replating агрегатов на рутину расщепления hPSCs в низких вложений блюда 10. Это обычно приводит к широкому распространению в результате EB размеров (рис. 1С, вверху). Еще одна проблема, в результате этого в том, что ЭТ поддерживается во взвешенном состоянии, как правило, совокупности друг с другом, что приведет к еще более высокой неоднородностью EB размеров. Чтобы обойти эти проблемы, поэтому ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большинство дифференциация протоколы с участием EB образования из hPSCs, в том числе наших ранее опубликованных процедуры 10, основаны на ручном или фермента при содействии уборки ЭСК в виде агрегатов, что неизбежно приводит к неоднородности в EB размеров. Этот факт приводит к изменчивости в дифференциации эффективность некоторых клеточных линий, тем самым делая систематического анализа трудно, особенно на средних масштабах пропускной способности. Кроме того, руководство рассечение является трудоемким что сам...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась Общества Макса Планка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии
Matrigel HC Becton Dickinson 354263 См. текст подробности по обращению
DMEM/F-12 Life Technologies 21331-020
Поли (виниловый спирт) Сигма 363170 Растворить в 0,4% в DMEM/F-12 с помощью ультразвукового водяной бане / во избежание перегрева / можно хранить при температуре 4 ° C в течение нескольких недель
Дополнение N2 Life Technologies 17502-048 100X, хранить как замороженные аликвоты
B27 дополнения Life Technologies 12587-010 50X, магазина, как замороженные аликвоты
Бычьего сывороточного альбумина Сигма A1595 10% = 500X, хранить как замороженные аликвоты
L-глютамин с пенициллина / стрептомицина PAA P11-013 Или эквивалент
FGF2 Peprotech 100-18B Растворите в концентрации 10 мкг / мл в 0,1% BSA / PBS = 1000X, магазина, как замороженные аликвоты
ROCK ингибитор Y-27632 abcamBiochemicals Asc-129 Растворить в 10 мМ в ДМСО = 1000X, магазина, как замороженные аликвоты
PBS PAA H15-002 Или эквивалент
Accutase PAA L11-007
96-и V-днища Nunc 277143
PD0325901 Axon Medchem Axon 1408 Растворить в 0,5 мМ в ДМСО = 1000X, магазина, как замороженные аликвоты
SB431542 abcamBiochemicals Asc-163 растворяют в 15 мМ в ДМСО = 1000X, хранить как замороженные аликвоты
Dorsomorphin Санта-Крус SC-200 689 растворяют в 0,5 мМ в ДМСО = 1000X, магазина, как замороженные аликвоты
96-луночные U-нижний ультра-низким пластин вложения Гранулирование 7007
Бета-III тубулина антитело (мышь) Сигма T8660 использовать при 1:1000
Бета-III тубулина антителами (кролик) Covance PRB-435P использовать при 1:2000
BRN3A (POU4F1) антитела Санта-Крус SC-8429 использовать при 1:500
Таблица 1. </ STRONG> Специальные реагенты и оборудование.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  3. Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
  4. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  5. Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
  6. Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
  7. Pera, M. F., et al. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).
  8. Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).
  9. Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity. Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).
  10. Greber, B., et al. FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).
  11. Anderson, S. L., et al. Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene. Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).
  12. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  13. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
  14. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  15. Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
  16. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293(2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Neuron DifferentiationNeuroectoderm FormationEmbryoid Body FormationSmall Molecule InhibitionMatrigel CoatingImmunofluorescence StainingSensory Neuron MarkersEB Formation Medium

Похожие статьи