Методическая статья

Сотовые слежения Использование Photoconvertible белков в процессе развития данио рерио

DOI:

10.3791/4350

⸱

28 сентября 2012 г.

 ,  , 
1Max Delbrück Center for Molecular Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем метод фотоактивированного переключения фотоконвертируемых флуоресцентных белков (PCFP) в живом эмбрионе данио-рерио и дальнейшего отслеживания фотоконвертированного белка в определенные моменты времени во время развития. Эта методология позволяет проводить мониторинг клеточных биологических событий, лежащих в основе различных процессов развития в организме живого позвоночного.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбриогенез - это динамический процесс, который лучше всего изучать с помощью методов, позволяющих документировать изменения в развитии in vivo. Использование генетически кодируемых флуоресцентных белков оказалось ценной стратегией для выяснения динамических морфогенетических процессов, происходящих в интактном организме. В течение последнего десятилетия разработка фотоактивируемых и фотоконвертируемых флуоресцентных белков открыла возможность для исследования судьбы дискретных субпопуляций меченых белков1. В отличие от фотоактивируемых белков, фотоконвертируемые флуоресцентные белки (PCFP) легко отслеживаются и визуализируются в их нативном состоянии излучения до фотоконверсии, что облегчает идентификацию и выбор областей с помощью оптического контроля. PCFP, такие как Kaede2, KikGR3, Dendra4 и EosFP5, могут изменяться из зеленого в красный под воздействием ультрафиолетового или синего света благодаря последовательности трипептидов His-Tyr-Gly, которая образует зеленый хромофор, который может быть фотопреобразован в красный путем катализируемого светом β-элиминации и последующего удлинения π-сопряженной системы3. PCFP и их мономерные варианты являются полезными инструментами для отслеживания клеток6-10 и изучения динамики белка11-14 соответственно. В последние годы PCFP экспрессируются на различных животных моделях, таких как даниорерио 6, курица7,8 и мышь9,10 для отслеживания судьбы клеток. В данной статье мы сообщаем о протоколе клеточно-специфической фотоконверсии PCFP в живом эмбрионе данио-рерио и дальнейшем отслеживании фотоконвертированных белков на более поздних стадиях развития. Эта методология позволяет тканеспецифичным образом изучать клеточные биологические события, лежащие в основе морфогенеза в животной модели рыбок данио.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Получение эмбрионов для фотоконверсионного анализа

При скрещивании трансгенных рыбок данио, экспрессирующих PCFP, выбираются самые яркие, которые являются гомозиготными эмбрионами, и выращиваются при температуре 28,5 °C до желаемой эмбриональной стадии15.

Примечание 1: Этот предварительный отбор позволит сканировать эмбрионы с низкой мощностью лазера, тем самым предотвращая фототоксичность и фотообесцвечивание.

Примечание 2: Мы рекомендуем использовать свет низкой интенсивности при визуализации эмбрионов и поддерживать их в темноте из-за высокой чувствительности PCFP, таких как Kaede и KikGR, к освещению, включая дневной свет.

2. Встраивание

  1. В стеклянной емкости с яйцом-водой дехорионат эмбрионов под стереомикроскопом с помощью щипцов.
  2. Обезболивают эмбрионы путем переноса дехорионированного эмбриона в 0,16 мг/мл раствора Трикаина (3-аминобензойный кислотный эфир, Сигма-Альдрич) (40мкл 4 мг/мл стокового раствора в 1 мл среды Е3 1Х).

Примечание 1: Переносите эмбрионы с помощью стеклянной пипетки или разрезанного наконечника (P1000), чтобы свести к минимуму риск повреждения эмбрионов.

Примечание 2: Молодые дехорионированные эмбрионы не должны подвергаться воздействию воздуха или подниматься на границу раздела вода/воздух, так как яйца легко разрываются при воздействии механического воздействия.

  1. Перенесите обезболиваемый эмбрион на крышку чашки для культивирования и поддерживайте эмбрион в минимально возможном объеме среды.
  2. Перенесите эмбрион в агарозу, пипетируя эмбрион 1% агарозой с низкой температурой плавления (LMA, Lonza) при 30 °C, содержащей 0,16 мг/мл трикаина, и поместите его на покровное стекло чашки для культуры с покровным дном (MatTek Corp., Ashland, MA, США). Затем сориентируйте эмбрион с помощью гладкого пластикового наконечника (например, разрезанного наконечника для пипетки Microloader, Eppendorf) и, когда LMA полимеризуется, покройте агарозу 0,16 мг/мл раствором трикаина.

Примечание 1: Расплавьте 1% LMA при 60 °C и поддерживайте расплавленную агарозу при 30 °C.

3. Фотопреобразование

  1. На инвертированном конфокальном микроскопе, оснащенном лазерным источником с длиной волны 405 нм, 488 нм и 561 нм, таком как Zeiss LSM 710, визуализируйте образец с помощью сканирования z-Stack, охватывающего всю структуру образца, подлежащего фотопреобразованию, и отслеживайте его позже с помощью лазера 488 нм (т.е. лазера Ar мощностью 30 мВт с интенсивностью 5-7 %, детектора, установленного на 493-540 нм) и лазера 561 нм (т.е., лазер DPSS 561 мощностью 10 мВт, с интенсивностью 7-9 %, детектор установлен на 587-651) для сканирования ткани/органа на зеленую и красную флуоресценцию фотоконвертируемых белков, соответственно.

Примечание 1: Для сканирования перед фотоконверсией мы использовали объектив Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

Примечание 2: Всегда сканируйте красную флуоресценцию перед экспериментом, чтобы исключить присутствие случайно сгенерированного красного преобразованного PCFP.

  1. Выберите инструмент Временные ряды и установите на 2 цикла без интервала (один для предварительного и один для пост-конвертации).
  2. Выберите инструмент «Регионы» и определите одну или несколько областей интереса (ROI) для фотопреобразования.

Примечание 1: Мы рекомендуем сначала определить точность, с которой область, фактически преобразованная сканирующим лазером в ROI, совпадает с ROI, выбранной в программном обеспечении, путем измерения площади фотопреобразованной ткани/клеток во всех трех направлениях (xy и z) в фиксированном образце, где не ожидается движения клеток или белков. Для настроек, описанных в этом приложении, ROI соответствовал области фотопреобразования с большой точностью, но это зависит от используемого объектива и количества лазера, используемого для фотопреобразования. Размер ROI может быть уменьшен до размера одной ячейки в зависимости от числовой апертуры объектива, коэффициента масштабирования и количества лазерного света, используемого для фотопреобразования.

  1. Выберите инструмент Отбеливание и установите начало отбеливания после сканирования 1 из 2. Мы использовали диодный лазер мощностью 30 мВт и длиной волны 405 нм для фотопреобразования и тщательно оптимизировали для минимального количества лазерного света, необходимого для полного фотопреобразования, что в основном достигается за счет изменения интенсивности лазерного света, итераций сканирования ROI и времени пикселя (т.е. скорости сканирования).

Примечание 1: Для фотопреобразования мы использовали объектив Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

Примечание 2: Мощность лазера и количество итераций должны быть определены эмпирически для каждой экспериментальной установки и должны обеспечить полное фотопреобразование из зеленого в красный PCFP в пределах ROI с минимальным необходимым количеством лазерного света для снижения фототоксичности. Мы рекомендуем начинать испытания с использованием низкой мощности лазера (например, 3 %, что соответствует 0,03 мВт в объективном плане) в сочетании с малым количеством итераций (например, 20), и в дальнейшем увеличивать мощность лазера до тех пор, пока не будет достигнуто полное фотопреобразование, которое в наших руках было при 10% мощности лазера (что соответствует 0,1 мВт в объективном плане). В этих условиях все протестированные эмбрионы выжили после плана лечения. Тем не менее, мы заметили, что мембрана желтка чувствительна к лазерным импульсам и может быть легко повреждена, что приведет к гибели эмбриона. По этой причине летальность эмбриона после фотоконверсии может быть вызвана, если положение целевой ткани близко к телу желтка.

  1. Отсканируйте образец с помощью z-Stack с использованием лазеров с длиной волны 488 нм и 561 нм, чтобы визуализировать оставшийся зеленый цвет и фотопреобразованную красную флуоресценцию PCFP.

Примечание 1: Для сканирования после фотопреобразования мы использовали Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

4. Удалить эмбрион из агарозы

  1. Сбросить раствор и осторожно извлечь зародыш из 1% ЛМА с помощью иглы или гладкого пластикового наконечника.
  2. Выдержите эмбрион в яичной воде в темноте при температуре 28,5 °C до желаемой стадии развития.

Примечание 1: Важно, чтобы эмбрионы продолжали свое развитие в яичной воде, особенно в первые дни развития во время расширения эмбрионального тела. Действительно, некоторые эмбриональные ткани/органы меняют положение в процессе развития и, следовательно, требуют специфических ориентаций во время встраивания, которые зависят от конкретной ткани/органа, представляющего интерес, и желаемой стадии развития анализа.

5. Повторное встраивание

  1. Действуйте так, как указано в пункте 2 настоящего протокола.

6. Отслеживание фотопреобразованной ткани на поздних эмбриональных стадиях

  1. Сканирование области интереса (z-Stack) с использованием лазеров для 488 нм и 561 нм для зеленого и красного флуоресцентных сигналов соответственно.

Примечание 1: Для сканирования x часов после фотопреобразования мы использовали Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

Примечание 2: Поскольку этот протокол не влияет на нормальное развитие эмбриона, можно наблюдать за фотопреобразованным эмбрионом на более поздних стадиях развития (для этого действуйте, как описано в пунктах 4 - 6).

7. Репрезентативные результаты

Пример анализа фотоконверсии показан на рисунке 1. Мы отслеживали эндотелиальные клетки во время развития рыбок данио (обзор сосудистой анатомии развивающихся рыбок данио см.в 16). Соответственно, мы использовали репортерную линию рыбки данио Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7, экспрессирующую KikGR в эндотелиальных ядрах17. Гомозиготные и ярко экспрессирующие эмбрионы выращивали при температуре 28,5 °C до 48 часов после оплодотворения (HPF). После дехорионации эмбрионы подвергались анестезии и встраивались в ЛМА, располагая передне-дорсальную сторону эмбриона по направлению к покровному стеклу для лучшей визуализации сосудов головы. Для фотоконверсионного анализа и дальнейшего отслеживания фотоконвертированного белка мы используем инвертированный конфокальный микроскоп (Zeiss LSM 710 Meta), оснащенный лазерами, работающими на длинах волн 405 нм, 488 нм и 561 нм, и объектив Plan Apochromat 20x/NA 0.8. Как показано на рисунке 1A, до фотоконверсии KikGR экспрессировался в эндотелиальной ткани и был обнаружен только в виде зеленой флуоресценции с помощью аргонового лазера с длиной волны 488 нм. Контрольное сканирование с помощью лазера DPSS 561-10 с длиной волны 561 нм для красной флуоресценции не выявило фотопреобразованных KikGR до фотоконверсии (рис. 1A). Впоследствии ROI был полностью фотопреобразован с помощью диодного лазера с длиной волны 405 нм (с интенсивностью 10%, 20 итераций), а сосуды головки были снова отсканированы с помощью лазеров с длиной волны 488 нм и 561 нм (рис. 1B). Как показано на рисунке 1B, зеленый KikGR полностью переключился на красный в пределах ROI. После фотоконверсионного анализа эмбрион извлекали из агарозы и выращивали при температуре 28,5 °C в яичной воде. Наконец, эмбрион снова наблюдали через 24 часа после фотоконверсии, около 72 hpf, чтобы отслеживать фотоконвертированные эндотелиальные клетки на более поздних стадиях (рис. 1C). Таким образом, эмбрион был внедрен в ЛМА, а образец был повторно отсканирован с помощью лазеров с длиной волны 488 нм и 561 нм. Как показано на рисунке 1C, в эндотелиальной ткани, возникающей в результате фотоконвертированного ROI, наблюдались как не-, так и фотоконвертированные белки KikGR из-за стабильности красных флуоресцентных фотоконвертированных KikGR и ресинтеза новых зеленых нефотоконвертированных KikGR.

figure-protocol-1
Рисунок 1. Фотоконверсия KikGR в процессе развития рыбок данио. (A,B) Специфическая область сосудистой сети эндотелиальной головки была фотоконвертирована при 48 hpf у трансгенных эмбрионов Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 и (C) наблюдалась повторно через 24 часа после фотоконверсии (около 72 hpf). Показаны флуоресценция KikGR (зеленый), фотопреобразованный KikGR (красный) и объединенные каналы. Пунктирные круги показывают ROI до, после и через 24 часа после фотоконверсии. Изображения представляют собой дорсальный вид эмбриона данио-рерио, расположенного спереди от дна. Масштабные линейки: 50 μм.

шт. шт.
Белок (аббревиатура)Ex (нм)Em (нм)Европейское сообщество QYЧетвертичное строениеяркость приложениеСсылка
Kaede_G508518990,9Тетрамер259Отслеживание ячеек2,6
Kaede_R572580600,3Тетрамер59
KikGR_G507517540,7Тетрамер112Отслеживание ячеек3,6,8-10
KikGR_R583593350,6Тетрамер68
mKikGR_G505515490,7мономер101Динамическое слежение Изображения сверхвысокого разрешения13
mKikGR_R580591280,6мономер53
EosFP_G506516720,7Тетрамер150Отслеживание ячеек5,20
EosFP_R571581410,5Тетрамер67
tdEos_G506516340,7Тандемный димер165Изображения со сверхвысоким разрешением12,14,21
tdEos_R569581330,6Тандемный димер59
mEos2_G506519560,7мономер140Динамическое слежение Изображения сверхвысокого разрешения11,18
mEos2_R573584460,7мономер90
Dendra2_G490507450,5мономер67Динамическое слежение Изображения сверхвысокого разрешения4,11
Dendra2_R553573350,55мономер57

Таблица I. Свойства фотоконвертируемых флуоресцентных белков. Наряду с общим названием и/или аббревиатурой для каждого PCFP в таблице приведены пиковые длины волн возбуждения (Ex) и излучения (Em), молярные коэффициенты экстинкции (EC, 10-3 M-1 см-1), квантовый выход (QY), физиологически значимая четвертичная структура, относительная яркость (в % от EGFP), применение и ссылки. Таблица адаптирована из Day and Davidson, 20101.

ФКПТрансгенные линии данио-рериоисточник
KaedeTg(elavl3:Kaede)rw0130aЛаборатория Окамото
Tg(EPV. TP1-Mmu.Hbb:Kaede) 
Tg(ins:Kaede) 
Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede) 
Tg(lhx5:Kaede)b1204/+ZIRC
Tg(myl7:kaede) 
Tg(olig2:Kaede) 
Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999tZIRC
Tg(UAS:Kaede)rk8ZIRC
Tg(vsx2:Kaede)nns2Лаборатория Хигасидзима
KikGRTg(kdrl:nlsKikGR) 
Tg(krt4:NTR-KikGR) 
Tg(myl7:nlsKikGR) 
Tg(sox10:KikGR) 
Tg(UAS:KikGR) 
EosFPTg(sox10:EosFP) 
Tg(sox10:nlsEosFP) 
ДендраTg(-8mpx:Dendra2) 
Tg(UAS:Dendra-kras) 

Таблица II. Трансгенные линии данио-рерио, экспрессирующие PCFPs. Данные получены в базе данных модельных организмов данио-рерио (ZFIN, http://zfin.org/). Указано наличие линий в Международном ресурсном центре данио-рерио (ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние годы были созданы трансгенные животные модели для экспрессии фотоконвертируемых белков, таких как Kaede или KikGR. Эти животные развиваются нормально, что указывает на то, что эти белки не оказывают токсического воздействия на эмбриональное развитие. Первое сообщение о фотоконверсионном анализе для отслеживания клеток в эмбрионах животных было выполнено Хаттой и его коллегами путем инъекции мРНК или ДНК, кодирующей Kaede, в одноклеточные эмбрионы данио-рерио для повсеместной экспрессии, или путем экспрессии K...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфликт интересов не декларируется.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Яна С. Скотта за любезное предоставление линии трансгенной линии Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 рыбки данио-рерио в больнице для больных детей, Торонто, Канада. Мы благодарим Центр конфокальной и 2-фотонной микроскопии (Центр молекулярной медицины Макса Дельбрюка) и доктора Макса Дельбрюка. Золтану Череснюсу за отличную техническую помощь и общую поддержку в области визуализации. С.А.-С. поддерживается стипендией Гейзенберга Немецкого научно-исследовательского общества (DFG). Эта работа была поддержана грантом DFG SE2016/7-1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Materials:
Необходимое оборудование для выращивания рыбы и сбора икры (подробности см. в Книге данио-рерио22).
СтереомикроскопLeica Lecia MZ6 СтереомикроскопОснащен лазером, работающим на длине волны 488 нм
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопZeissZeiss LSM 710 NLOоснащен лазерами, работающими на длинах волн 488 нм, 561 нм и 405 нм
Блок
Пара щипцов
Чашка для культуры со стеклянным дномMatTek CorpНаконечники для дозаторов Ashland MA США
MicroloaderИглы
Reagents:
Egg water medium60 μ
г/мл Растворимые морские соли в ddH2O
E3 medium
5 mM NaCl
0,17 mM KCl
0,33 mM CaCl2
0,33 mM MgSO4
0,00001% (w/v) Метиленовый синий
4 мг/мл Трикаин стоковый раствор
400 мг Трикаин (3-аминобензойная кислотаэтилестер)Sigma-Aldrich
97,9 мл ddH2O
2,1 мл 1M Tris (pH9)
Отрегулируйте при pH 7, аликвоте и храните -20 ° C
1% LMA (Низкая температура плавления агарозы, Lonza)
1g LMA/100 мл E3 medium 1X
Aliquot и хранить при 4° С
нагреваDumont #5 для вихревых игл Eppendorf

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).
  2. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12651-12656 (2002).
  3. Tsutsui, H., Karasawa, S., Shimizu, H., Nukina, N., Miyawaki, A. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. EMBO Rep. 6, 233-238 (2005).
  4. Gurskaya, N. G., Verkhusha, V. V., Shcheglov, A. S., Staroverov, D. B., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
  5. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K. D., Nienhaus, G. U. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15905-15910 (2004).
  6. Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat. Protoc. 1, 960-967 (2006).
  7. Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev. Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
  8. Kulesa, P. M., Teddy, J. M., Stark, D. A., Smith, S. E., McLennan, R. Neural crest invasion is a spatially-ordered progression into the head with higher cell proliferation at the migratory front as revealed by the photoactivatable protein, KikGR. Dev. Biol. 316, 275-287 (2008).
  9. Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Dev. Biol. 9, 49(2009).
  10. Griswold, S. L., Sajja, K. C., Jang, C. W., Behringer, R. R. Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time-lapse imaging during development. Genesis. 49, 591-598 (2011).
  11. Baker, S. M., Buckheit, R. W. 3rd, Falk, M. M. Green-to-red photoconvertible fluorescent proteins: tracking cell and protein dynamics on standard wide-field mercury arc-based microscopes. BMC Cell Biol. 11, 15(2010).
  12. Watanabe, S., Punge, A., Hollopeter, G., Willig, K. I., Hobson, R. J., Davis, M. W., Hell, S. W., Jorgensen, E. M. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
  13. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944(2008).
  14. Fang, Z., Takizawa, N., Wilson, K. A., Smith, T. C., Delprato, A., Davidson, M. W., Lambright, D. G., Luna, E. J. The membrane-associated protein, supervillin, accelerates F-actin-dependent rapid integrin recycling and cell motility. Traffic. 11, 782-799 (2010).
  15. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
  16. Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Dev. Biol. 230, 278-301 (2001).
  17. Lazic, S., Scott, I. C. Mef2cb regulates late myocardial cell addition from a second heart field-like population of progenitors in zebrafish. Dev. Biol. 354, 123-133 (2011).
  18. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
  19. Godinho, L. Live imaging of zebrafish development. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 770-777 (2011).
  20. Curran, K., Lister, J. A., Kunkel, G. R., Prendergast, A., Parichy, D. M., Raible, D. W. Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest. Dev. Biol. 344, 107-118 (2010).
  21. Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications. Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).
  22. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Confocal MicroscopyPhoto ConversionFluorescent ProteinsTissue Specific ExpressionLow Melting Temperature AgaroseEgg Water MaintenanceEndothelial Cell Tracking

Похожие статьи