В данной работе мы представляем метод фотоактивируемого переключения фотоконвертируемых флуоресцентных белков (PCFPs) в живом эмбрионе данио-рерио с последующим отслеживанием фотоконвертированного белка в определенные моменты времени в процессе развития. Данная методология позволяет осуществлять мониторинг клеточных биологических событий, лежащих в основе различных процессов развития в живом организме позвоночного.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Сотовые слежения Использование Photoconvertible белков в процессе развития данио рерио
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эмбриогенез представляет собой динамический процесс, который лучше всего изучать с помощью методов, позволяющих документировать изменения в развитии in vivo. Использование генетически кодируемых флуоресцентных белков оказалось ценной стратегией для выяснения динамических морфогенетических процессов, происходящих в целом организме. За последнее десятилетие разработка фотоактивируемых и фотоконвертируемых флуоресцентных белков открыла возможность исследовать судьбу отдельных субпопуляций меченных белков1. В отличие от фотоактивируемых белков, фотоконвертируемые флуоресцентные белки (ФКБ) легко отслеживать и визуализировать в их нативном состоянии испускания до фотоконверсии, что упрощает идентификацию и выбор областей путем оптического осмотра. ФКБ, такие как Kaede2, KikGR3, Dendra4 и EosFP5, могут переходить из зеленого в красный спектр при воздействии УФ- или синего света благодаря трипептидной последовательности His-Tyr-Gly, которая формирует зеленый хромофор, способный подвергаться фотоконверсии в красный посредством катализируемого светом β-элиминирования и последующего расширения π-сопряженной системы3. ФКБ и их мономерные варианты являются полезными инструментами для отслеживания клеток6-10 и изучения динамики белков11-14 соответственно. В последние годы ФКБ экспрессировали в различных модельных животных, таких как zebrafish6, курица7,8 и мышь9,10, для отслеживания судьбы клеток. Здесь мы приводим протокол специфичной для клеток фотоконверсии ФКБ в живом эмбрионе zebrafish с последующим отслеживанием фотоконвертированных белков на более поздних стадиях развития. Данная методология позволяет тканеспецифично изучать клеточно-биологические события, лежащие в основе морфогенеза на модельном животном zebrafish.
Протокол
1. Получение эмбрионов для анализа фотоконверсии
После скрещивания трансгенных данио-рерио, экспрессирующих PCFP, выбирают наиболее ярко светящиеся гомозиготные эмбрионы, которые затем выращивают при 28.5 °C до достижения нужной стадии эмбрионального развития15.
Примечание 1: Данный предварительный отбор позволит сканировать эмбрионы при низкой мощности лазера, предотвращая тем самым фототоксичность и фотообесцвечивание.
Примечание 2: Мы рекомендуем использовать свет низкой интенсивности при визуализации эмбрионов и содержать их в темноте из-за высокой чувствительности фотоконвертируемых флуоресцентных белков (PCFPs), таких как Kaede и KikGR, к воздействию света, включая дневной.
2. Заливка
- В стеклянном контейнере с яично-водным раствором проведите дехорионирование эмбрионов под стереомикроскопом с помощью пинцета.
- Проведите анестезию эмбрионов, перенеся дехорионированный эмбрион в раствор Tricaine (этиловый эфир 3-аминобензойной кислоты, Sigma-Aldrich) с концентрацией 0.16 mg/ml (40 µl стокового раствора 4 mg/ml в 1 ml среды E3 1X).
Примечание 1: Переносите эмбрионы с помощью стеклянной пипетки или дозатора с обрезанным кончиком (P1000), чтобы минимизировать риск повреждения эмбрионов.
Примечание 2: Молодые дехорионированные эмбрионы не должны подвергаться воздействию воздуха или подниматься к границе раздела вода/воздух, так как яйца легко разрываются при механическом воздействии.
- Перенесите анестезированный эмбрион на крышку культуральной чашки и поддерживайте его в минимально возможном объеме среды.
- Поместите эмбрион в агарозу, дозировав его с помощью 1% низкоплавкого агароза (LMA, Lonza) при 30 °C, содержащего 0,16 mg/ml трикаина, и расположите его на покровном стекле культуральной чашки с дном из покровного стекла (MatTek Corp. Ashland MA USA). Затем с помощью гладкого пластикового наконечника (например, обрезанного наконечника дозатора Microloader, Eppendorf) сориентируйте эмбрион и, после полимеризации LMA, залейте агарозу раствором трикаина в концентрации 0,16 mg/ml.
Примечание 1: Расплавьте 1% LMA при 60 °C и поддерживайте расплавленный агароз при 30 °C.
3. Фотоконверсия
- С помощью инвертированного конфокального микроскопа, оснащенного лазерными источниками с длинами волн 405 нм, 488 нм и 561 нм (например, Zeiss LSM 710), визуализируйте образец, выполнив z-стек сканирование всей структуры препарата, который в дальнейшем будет подвергнут фотоконверсии и отслеживанию с использованием лазера 488 нм (т. е., аргоновый лазер мощностью 30 мВт, при интенсивности 5–7 %, детектор настроен на 493–540 нм) и лазер с длиной волны 561 нм (т. е., лазер DPSS 561 мощностью 10 мВт, при интенсивности 7–9%, детектор настроен на 587–651) для сканирования ткани/органа на наличие зелельной и красной флуоресценции фотоконвертируемых белков соответственно.
Примечание 1: Для сканирования перед фотоконверсией мы использовали объектив Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
Примечание 2: Всегда проводите сканирование на наличие красной флуоресценции перед началом эксперимента, чтобы исключить присутствие случайно образованного конвертированного красного PCFP.
- Выберите инструмент Time series (Временные ряды) и установите 2 цикла без интервала (один для этапа до и один для этапа после фотоконверсии).
- Выберите инструмент Regions (Области) и определите одну или несколько областей интереса (ROI) для фотоконверсии.
Примечание 1: Мы рекомендуем сначала определить точность соответствия области, которая фактически подвергается фотоконверсии сканирующим лазером в ROI (области интереса), области ROI, выбранной в программном обеспечении. Для этого измерьте площадь фотоконвертированной ткани/клеток по всем трем направлениям (xy и z) в фиксированном образце, где перемещение клеток или белков исключено. При настройках, описанных в данном приложении, ROI соответствовала области фотоконверсии с высокой точностью, однако этот параметр зависит от используемого объектива и интенсивности лазерного излучения, применяемого для фотоконверсии. Размер ROI может быть уменьшен до размера одной клетки в зависимости от числовой апертуры объектива, коэффициента увеличения и количества лазерного света, используемого для фотоконверсии.
- Выберите инструмент Bleaching и установите начало обесцвечивания после 1-го сканирования из 2. Для фотоконверсии мы использовали диодный лазер с мощностью 30 mW и длиной волны 405 nm, тщательно оптимизируя параметры для достижения минимального количества лазерного излучения, необходимого для полной фотоконверсии; это в основном достигалось путем варьирования интенсивности лазерного излучения, количества итераций сканирования ROI и времени экспозиции пикселя (т. е. скорости сканирования).
Примечание 1: Для фотоконверсии мы использовали объектив Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
Примечание 2: Мощность лазера и количество итераций должны определяться эмпирически для каждой экспериментальной установки и должны обеспечивать полную фотоконверсию PCFP из зеленого в красный цвет в пределах ROI с минимально необходимым количеством лазерного излучения для снижения фототоксичности. Мы рекомендуем начинать испытания с низкой мощности лазера (напр. 3 %, что соответствует 0.03 mW в плоскости объектива) в сочетании с малым количеством итераций (напр. 20), и впоследствии увеличивать мощность лазера до достижения полной фотоконверсии, которая в нашем случае была достигнута при мощности лазера 10% (что соответствует 0.1 mW в плоскости объектива). В этих условиях все протестированные эмбрионы пережили процедуру. Тем не менее, мы заметили, что оболочка желтка чувствительна к лазерным импульсам и может быть легко повреждена, что приведет к гибели эмбриона. По этой причине летальность эмбрионов после фотоконверсии может возникнуть, если целевая ткань расположена близко к желтку.
- Выполните z-стек сканирование образца с использованием лазеров с длиной волны 488 nm и 561 nm для визуализации остаточной зеленой и фотоконвертированной красной флуоресценции PCFP.
Примечание 1: Для сканирования после фотоконверсии мы использовали объектив Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
4. Извлечение эмбриона из агарозы
- Слейте раствор и осторожно извлеките эмбрион из 1% LMA с помощью иглы или гладкого пластикового наконечника.
- Содержите эмбрион в яичной воде в темноте при 28.5 °C до достижения нужной стадии развития.
Примечание 1: Важно, чтобы эмбрионы продолжали развитие в яичной воде, особенно в первые дни развития в период удлинения тела эмбриона. Действительно, некоторые эмбриональные ткани/органы меняют свое положение в процессе развития и, следовательно, требуют определенной ориентации при заливке, что зависит от конкретной исследуемой ткани/органа и желаемой стадии развития для анализа.
5. Повторная заливка
- Действуйте в соответствии с пунктом 2.) данного протокола.
6. Отслеживание фотоконвертированной ткани на более поздних стадиях развития эмбриона
- Сканирование интересующей области (z-стек) с использованием лазеров с длиной волны 488 nm и 561 nm для регистрации зеленого и красного флуоресцентных сигналов соответственно.
Примечание 1: Для сканирования через x часов после фотоконверсии мы использовали объектив Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
Примечание 2: Поскольку данный протокол не влияет на нормальное развитие эмбриона, существует возможность наблюдать за фотоконвертированным эмбрионом на более поздних стадиях развития (для этого следуйте инструкциям, изложенным в пунктах 4 - 6).
7. Репрезентативные результаты
Пример анализа фотоконверсии показан на рисунке 1. Мы отслеживали эндотелиальные клетки в процессе развития рыбки-зебры (обзор сосудистой анатомии развивающейся рыбки-зебры см. в16). Соответственно, мы использовали репортерную линию рыбки-зебры Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7, экспрессирующую KikGR в ядрах эндотелия17. Гомозиготные эмбрионы с интенсивной экспрессией выращивали при 28.5 °C до 48 ч после оплодотворения (hpf). После дехорионизации эмбрионы анестезировали и заключали в LMA, располагая передне-дорсальную сторону эмбриона к покровному стеклу для лучшей визуализации сосудов головы. Для анализа фотоконверсии и последующего отслеживания фотоконвертированного белка мы использовали инвертированный конфокальный микроскоп (Zeiss LSM 710 Meta), оснащенный лазерами с длиной волны 405 nm, 488 nm и 561 nm, и объективом Plan Apochromat 20x/NA 0.8. Как показано на рисунке 1A, до фотоконверсии KikGR экспрессировался в эндотелиальной ткани и определялся только как зелетая флуоресценция при использовании аргонового лазера 488 nm. Контрольное сканирование с помощью DPSS 561-10 лазера 561 nm для выявления красной флуоресценции не обнаружило фотоконвертированного KikGR до проведения процедуры фотоконверсии (рисунок 1A). Затем область интереса (ROI) была полностью фотоконвертирована с помощью диодного лазера 405 nm (при интенсивности 10%, 20 итераций), после чего сосуды головы снова сканировали с помощью лазеров 488 nm и 561 nm (рисунок 1B). Как показано на рисунке 1B, в пределах ROI зеленый KikGR полностью перешел в красную форму. После анализа фотоконверсии эмбрион извлекали из агарозы и выращивали при 28.5 °C в яичной воде. Наконец, эмбрион повторно наблюдали через 24 ч после фотоконверсии, примерно на стадии 72 hpf, чтобы проследить за фотоконвертированными эндотелиальными клетками на более поздних этапах (рисунок 1C). Для этого эмбрион снова заключали в LMA и повторно сканировали с использованием лазеров 488 nm и 561 nm. Как показано на рисунке 1C, в эндотелиальной ткани, развившейся из фотоконвертированной ROI, наблюдались как неконвертированный, так и фотоконвертированный белки KikGR, что обусловлено стабильностью красного флуоресцентного фотоконвертированного KikGR и ресинтезом нового зеленого неконвертированного KikGR.
Рисунок 1. Фотоконверсия KikGR в процессе развития данио-рерио. (A,B) Специфический участок эндотелиальных сосудов головы был подвергнут фотоконверсии через 48 hpf в трансгенных эмбрионах Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7, и (C) повторно осмотрен через 24 ч после фотоконверсии (примерно 72 hpf). Показана флуоресценция KikGR (зеленый), фотоконвертированного KikGR (красный) и совмещенные каналы. Пунктирные круги обозначают область интереса (ROI) до, во время и через 24 ч после фотоконверсии. Изображения представляют собой вид на эмбрион данио-рерио сверху (дорсально), передний конец направлен вниз. Масштабный отрезок: 50 μm.
| Белок (аббревиатура) | Ex (нм) | Em (нм) | Электропроводность | Квантовый выход | Четвертичная структура | Яркость | Применение | Спр. |
| Kaede_G | 508 | 518 | 99 | 0.9 | тетрамер | 259 | Трекинг клеток | 2,6 |
| Kaede_R | 572 | 580 | 60 | 0.3 | тетрамер | 59 | ||
| KikGR_G | 507 | 517 | 54 | 0.7 | тетрамер | 112 | Трекинг клеток | 3,6,8-10 |
| KikGR_R | 583 | 593 | 35 | 0.6 | тетрамер | 68 | ||
| mKikGR_G | 505 | 515 | 49 | 0.7 | мономер | 101 | Динамическое отслеживание изображений сверхвысокого разрешения | 13 |
| mKikGR_R | 580 | 591 | 28 | 0.6 | мономер | 53 | ||
| EosFP_G | 506 | 516 | 72 | 0.7 | тетрамер | 150 | Трекинг клеток | 5,20 |
| EosFP_R | 571 | 581 | 41 | 0.5 | тетрамер | 67 | ||
| tdEos_G | 506 | 516 | 34 | 0.7 | тандемный димер | 165 | Изображения сверхвысокого разрешения | 12,14,21 |
| tdEos_R | 569 | 581 | 33 | 0.6 | тандемный димер | 59 | ||
| mEos2_G | 506 | 519 | 56 | 0.7 | мономер | 140 | Динамическое отслеживание изображений сверхвысокого разрешения | 11,18 |
| mEos2_R | 573 | 584 | 46 | 0.7 | мономер | 90 | ||
| Dendra2_G | 490 | 507 | 45 | 0.5 | мономер | 67 | Изображения сверхвысокого разрешения с динамическим отслеживанием | 4,11 |
| Dendra2_R | 553 | 573 | 35 | 0.55 | мономер | 57 |
Таблица I. Свойства фотоконвертируемых флуоресцентных белков. В таблице приведены общепринятое название и/или аббревиатура каждого PCFP, пиковые длины волн возбуждения (Ex) и эмиссии (Em), молярные коэффициенты экстинкции (EC, 10-3 M-1 cm-1 ), квантовый выход (QY), физиологически релевантная четвертичная структура, относительная яркость (в % от EGFP), область применения и ссылки на литературу. Таблица адаптирована из Day and Davidson, 20101.
| ПЦФП | Трансгенные линии данио-рерио | Пожалуйста, предоставьте исходный текст для перевода. |
| Kaede | Tg(elavl3:Kaede)rw0130a | Лаборатория Окамото |
| Tg(EPV.TP1-Mmu.Hbb:Kaede) | ||
| Tg(ins:Kaede) | ||
| Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede) | ||
| Tg(lhx5:Kaede)b1204/+ | ZIRC | |
| Tg(myl7:kaede) | ||
| Tg(olig2:Kaede) | ||
| Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t | ZIRC | |
| Tg(UAS:Kaede)rk8 | ZIRC | |
| Tg(vsx2:Kaede)nns2 | Лаборатория Хигасисимы | |
| KikGR | Tg(kdrl:nlsKikGR) | |
| Tg(krt4:NTR-KikGR) | ||
| Tg(myl7:nlsKikGR) | ||
| Tg(sox10:KikGR) | ||
| Tg(UAS:KikGR) | ||
| EosFP | Tg(sox10:EosFP) | |
| Tg(sox10:nlsEosFP) | ||
| Dendra | Tg(-8mpx:Dendra2) | |
| Tg(UAS:Dendra-kras) |
Таблица II. Трансгенные линии данио-рерио, экспрессирующие PCFP. Данные получены из базы данных модельных организмов данио-рерио (ZFIN, http://zfin.org/). Указано наличие линий в Международном ресурсном центре данио-рерио (ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В последние годы были созданы трансгенные модели животных для экспрессии фотоконвертируемых белков, таких как Kaede или KikGR. Эти животные развиваются нормально, что указывает на отсутствие токсического воздействия данных белков на эмбриональное развитие. Первый отчет о применении метода фотоконверсии для отслеживания клеток в эмбрионах животных был представлен Хаттой и соавторами; они вводили мРНК или ДНК, кодирующие Kaede, в одноклеточные эмбрионы zebrafish для повсеместной экспрессии, либо экспрессировали Kaede и Kik...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликт интересов не заявлен.
Благодарности
Мы благодарим доктора Иэна К. Скотта за предоставление трансгенной линии данио-рерио Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 из Больницы для больных детей (Hospital for Sick Children, Торонто, Канада). Мы благодарим Центр конфокальной и двухфотонной микроскопии (Max-Delbrueck-Center for Molecular Medicine) и доктора Золтана Черешньеша за превосходную техническую помощь и общую поддержку в области визуализации. S.A.-S. поддерживается стипендией Heisenberg от Немецкого научно-исследовательского сообщества (DFG). Данная работа была поддержана грантом DFG SE2016/7-1.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Материалы: | |||
| Оборудование, необходимое для выращивания рыб и сбора икры (подробности см. в книге по Zebrafish Book22). | |||
| Стереомикроскоп | Leica | Стереомикроскоп Lecia MZ6 | Оснащен лазером, работающим на длине волны 488 nm |
| Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп | Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | оснащен лазерами, работающими на длинах волн 488 nm, 561 nm и 405 nm |
| Нагревательный блок | |||
| Пинцет Dumont #5 | |||
| Культуральная чашка с покровным стеклом на дне | MatTek Corp | Ashland MA USA | |
| Наконечники для микродозатора Microloader | Eppendorf | ||
| Вортекс | |||
| Иглы | |||
| Реагенты: | |||
| Среда для икры (Egg water medium) | |||
| 60 μg/ml морских солей Instant Ocean в ddH2O | |||
| Среда E3 | |||
| 5 mM NaCl | |||
| 0.17 mM KCl | |||
| 0.33 mM CaCl2 | |||
| 0.33 mM MgSO4 | |||
| 0.00001% (w/v) метиленового синего | |||
| Стоковый раствор трикаина 4 mg/ml | |||
| 400 mg трикаина (этиловый эфир 3-аминобензойной кислоты) | Sigma-Aldrich | ||
| 97.9 ml ddH2O | |||
| 2.1 ml 1M Tris (pH 9) | |||
| Довести pH до 7, разлить по аликвотам и хранить при -20 °C | |||
| 1% LMA (низкоплавящий агароза, Lonza) | |||
| 1g LMA / 100 ml среды E3 1X | |||
| Разлить по аликвотам и хранить при 4 °C |
Ссылки
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12651-12656 (2002).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Shimizu, H., Nukina, N., Miyawaki, A. Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. EMBO Rep. 6, 233-238 (2005).
- Gurskaya, N. G., Verkhusha, V. V., Shcheglov, A. S., Staroverov, D. B., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).
- Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K. D., Nienhaus, G. U. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15905-15910 (2004).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nat. Protoc. 1, 960-967 (2006).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev. Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
- Kulesa, P. M., Teddy, J. M., Stark, D. A., Smith, S. E., McLennan, R. Neural crest invasion is a spatially-ordered progression into the head with higher cell proliferation at the migratory front as revealed by the photoactivatable protein, KikGR. Dev. Biol. 316, 275-287 (2008).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC Dev. Biol. 9, 49(2009).
- Griswold, S. L., Sajja, K. C., Jang, C. W., Behringer, R. R. Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time-lapse imaging during development. Genesis. 49, 591-598 (2011).
- Baker, S. M., Buckheit, R. W. 3rd, Falk, M. M. Green-to-red photoconvertible fluorescent proteins: tracking cell and protein dynamics on standard wide-field mercury arc-based microscopes. BMC Cell Biol. 11, 15(2010).
- Watanabe, S., Punge, A., Hollopeter, G., Willig, K. I., Hobson, R. J., Davis, M. W., Hell, S. W., Jorgensen, E. M. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944(2008).
- Fang, Z., Takizawa, N., Wilson, K. A., Smith, T. C., Delprato, A., Davidson, M. W., Lambright, D. G., Luna, E. J. The membrane-associated protein, supervillin, accelerates F-actin-dependent rapid integrin recycling and cell motility. Traffic. 11, 782-799 (2010).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Dev. Biol. 230, 278-301 (2001).
- Lazic, S., Scott, I. C. Mef2cb regulates late myocardial cell addition from a second heart field-like population of progenitors in zebrafish. Dev. Biol. 354, 123-133 (2011).
- McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
- Godinho, L. Live imaging of zebrafish development. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 770-777 (2011).
- Curran, K., Lister, J. A., Kunkel, G. R., Prendergast, A., Parichy, D. M., Raible, D. W. Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest. Dev. Biol. 344, 107-118 (2010).
- Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications. Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
