Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Вирусный наночастиц для

17K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4352

⸱

16 ноября 2012 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University , 2Department of Biomedical Engineering, Radiology, and Materials Science and Engineering, Case Western Reserve University

В этой статье

Краткое содержание

Завод вирусных наночастиц (VNPs) являются перспективными платформами для применений в биомедицине. Здесь мы описываем процедуры завод VNP распространение, очистка, характеристика и bioconjugation. Наконец, мы покажем применение VNPs опухоли самонаведения и визуализации с использованием модели мыши ксенотрансплантата и флуоресценции.

Аннотация

Использование наноматериалов обладает потенциалом произвести революцию в материаловедении и медицине. В настоящее время исследуется ряд различных наночастиц для применения в визуализации и терапии. Вирусные наночастицы (ВНЧ), полученные из растений, можно рассматривать как самосборные бионаноматериалы с определенным размером и формой. Растительные вирусы, изучаемые в лаборатории Штайнмеца, включают икосаэдрические частицы, образуемые Cowpea mosaic virus (CPMV) и Brome mosaic virus (BMV), диаметр которых составляет 30 nm. Мы также разрабатываем стержневидные и нитевидные структуры, полученные из следующих растительных вирусов: Tobacco mosaic virus (TMV), который образует жесткие стержни размером 300 nm на 18 nm, и Potato virus X (PVX), образующий нитевидные частицы длиной 515 nm и шириной 13 nm (для получения дополнительной информации о ВНЧ читателю рекомендуется обратиться к источникам 1 и 2).

С точки зрения материаловедения, VNPs являются привлекательными строительными блоками по нескольким причинам: частицы монодисперсны, могут быть с легкостью получены в больших количествах in planta, обладают исключительной стабильностью и биосовместимостью. Кроме того, VNPs представляют собой «программируемые» единицы, которые могут быть специфически модифицированы с помощью генетической модификации или методов химической биоконъюгации 3. Структура VNPs известна с атомным разрешением, и модификации могут быть выполнены с пространственной точностью на атомном уровне4 — уровень контроля, который невозможно достичь при использовании синтетических наноматериалов с помощью современных передовых технологий.

В данной работе мы описываем размножение CPMV, PVX, TMV и BMV в растениях Vigna ungiuculata и Nicotiana benthamiana. Приведены протоколы экстракции и очистки для каждого VNP. Описаны методы характеристики очищенных и химически меченных VNPs. В этом исследовании мы фокусируемся на химическом мечении VNPs флуорофорами (например, Alexa Fluor 647) и полиэтиленгликолем (PEG). Красители облегчают отслеживание и обнаружение VNPs 5-10, а PEG снижает иммуногенность белковых наночастиц, улучшая их фармакокинетику 8,11. Мы демонстрируем тропность PEGylated VNPs к опухоли с использованием модели ксенографтов опухолей у мышей. Для изучения биораспределения используется сочетание флуоресцентной визуализации тканей ex vivo с помощью системы Maestro Imaging System, количественного определения флуоресценции в гомогенизированных тканях и конфокальной микроскопии. VNPs выводятся через ретикулоэндотелиальную систему (RES); тропность к опухоли достигается пассивно за счет эффекта повышенной проницаемости и удержания (EPR)12. Нанотехнология VNP представляет собой мощный универсальный инструмент («plug-and-play») для визуализации и терапии очагов заболевания in vivo. Мы продолжаем разработку VNPs для доставки лекарственных препаратов и клинически значимых визуализирующих агентов, а также тканеспецифических лигандов для таргетирования молекулярных рецепторов, гиперэкспрессированных при раке и сердечно-сосудистых заболеваниях.

Протокол

1. VNP (CPMV, BMV, PVX, и ВТМ) Распространение

  1. Установите камеру закрытый завод контролирует до 15 часов в день (100% света, 25 ° C, влажность 65%) и 9 ч ночи (0% света, 22 ° С, 60% влажности).
  2. Инокулировать растений в соответствии с графиком в таблице 1.
CPMV PVX, ВТМ, и BMV
День 0: Plant 3 вигны семян / горшок. День 0: Завод ~ 30 Н. benthamiana семян / горшок. Удобрять раз в неделю с 1 столовую ложку удобрения / 5 л воды.
День 14: Re-пот Н. benthamiana на 1 растение / банк.
День 10: Infect оставляет первичные листья с CPMV (5 мкг/50 мкл / лист) механической инокуляции с помощью светового пыль карборунда. День 28: Infect трех до FIve листья с PVX, ВТМ, или BMV (5 мкг/50 мкл / лист) механической инокуляции с помощью светового пыль карборунда.
День 20: Harvest листья и хранят в -80 ° C. День 42: Harvest листья и хранят в -80 ° C.

Таблица 1. Сроки растет, заражение, и сбор урожая листьев.

Примечание: только распространение CPMV показана в качестве примера.

2. VNP (CPMV, BMV, PVX, и ВТМ) очистки

Примечание: Все действия выполняются на льду или при температуре 4 ° C.

  1. Однородный 100 г замороженных листьев в стандартный блендер использованием 2-х томах холодного раствора (см. таблицу 2). Фильтр через 2-3 слоя марли.
  2. Для PVX, отрегулировать рН до 6,5 с помощью 1 M HCl. Добавить 0,2% (вес / объем) аскорбиновой кислоты и 0,2% (вес / объем) натрия sulfiТе.
  3. Центрифуга гомогената растительным сырьем при 5500 х г в течение 20 мин. Сбор супернатант.
  4. Для BMV, слой 25 мл супернатанта более 5 мл 10% (вес / объем) раствор сахарозы. Центрифуга при 9000 мкг в течение 3 ч и ресуспендируют гранул в 38,5% CsCl решение (вес / объем). Mix путем встряхивания в течение 5 часов, а затем продолжить с шага 2.12.
  5. Извлечение растительного материала путем добавления 0,7 объемов 1:1 (объем / объем) хлороформа :1-бутанола. Размешайте смесь в течение 30-60 мин.
  6. Центрифуга решение при 5500 х г в течение 20 мин. Соберите верхнюю водную фазу.
  7. Добавить NaCl до 0,2 М и 8% (вес / объем) ПЭГ (MW 8000). Для ВТМ, добавить 1% (V / V) Triton X-100. Движение по крайней мере, 1 час, то пусть сидят, по крайней мере, 1 час.
  8. Центрифуга решение при 15000 х г в течение 15 мин. Ресуспендируют гранул в 10 мл буфера. Для PVX, добавить 0,1% β-меркаптоэтанол и мочевины до 0,5 М.
  9. Центрифуга при 8000 мкг в течение 30 минут и собирают супернатант.
  10. Ультрацентрифуге супернатанта при 160000 х г в течение 3 часов. Ресуспендируют гранул в 5 мл буфера выводаvernight.
  11. Подготовить 10-40% сахарозы градиентом, используя равные объемы 10%, 20%, 30% и 40% сахарозы в буфере (тяжелый первый). Разрешить градиента, чтобы уравновесить ночь при комнатной температуре.
  12. Ультрацентрифуга суспендируют осадок на градиенте сахарозы при 100000 х г в течение 2 часов (24 ч для BMV).
  13. Сбор светлая полоса рассеяния и диализ против буфера.
  14. Охарактеризовать VNPs (см. ниже) и хранить при 4 ° C. Для длительного хранения, хранят при температуре -80 ° C.
CPMV и ВТМ 0,1 М калий-фосфатного буфера (рН 7,0)
38,5 мм KH 2 PO 4
61,5 мм K 2 HPO 4
PVX 0,5 М бората буфером (рН 7,8)
0,5 М борной кислоты
Отрегулируйте рН с NaOH
BMV SAMA буфером (рН 4,5)
250 мМ ацетата натрия
10 мМ MgCl 2
2 мМ β-меркаптоэтанол (добавить свежие)

Таблица 2. Буферы и их рецепты для каждого VNP.

Примечание: только распространение CPMV показана в качестве примера.

3. VNP (CPMV, BMV, PVX, и ВТМ) Характеристика

  1. Выполните УФ / видимой спектроскопии для определения концентрации VNPs.
    1. Измерить абсорбцию во 2 мкл образца с помощью NanoDrop спектрофотометр.
    2. Определить концентрацию частиц и красителей помощью Beer-Lambert закон (= εcl, где это поглощение, ε-коэффициент экстинкции, с-концентрация, и я это путь длиной). Длина пути составляет 0,1 см для NanoDrop.
      VNP конкретные коэффициенты экстинкции являются:
      CPMV: 8,1 см -1 мг -1 мл (при 260 нм)
      PVX: 2,97 см -1 мг -1 мл (при 260 нм)
      TMV: 3,0 см -1 мг -1 мл (при 260 нм)
      BMV: 5,15 см -1 мг -1 мл (при 260 нм)
  2. Анализ частиц по размерам и исключения быстрой жидкостной хроматографии белков (FPLC).
    1. Использование Superose 6 гель-колонки и Akta Explorer, нагрузка 50-100 мкг VNPs в 200 мкл 0,1 М калий-фосфатного буфера (рН 7,0).
    2. Установка детекторов до 260 нм (нуклеиновые кислоты), 280 нм (белок), а длина волны возбуждения любого красителей прилагается.
    3. Запуск при скорости потока 0,5 мл / мин в течение 72 мин.
    4. Профиль элюции и A260: A280 нм указывает, является ли подготовка VNP чисто и ли частицы целы и собраны.
      Следующие A260: 280 отношения указывают чистого препарата VNP:
      CPMV: 1,8 ± 0,1
      PVX: 1,2 ± 0,1
      TMV:1,1 ± 0,1
      BMV: 1,7 ± ​​0,1
  3. Выполните денатурации (сборные NuPAGE) Bis-Tris полиакриламидном 4-12% градиентного гель-электрофореза для анализа чистоты подготовке и сопряжения отдельных белков пальто.
    1. Добавьте 3 мл буфера для образцов 4x LDS до 10 мкг частиц в 9 мкл буферного раствора фосфата калия. Добавить еще 1 мкл образца 4x LDS буфера и 3 мкл β-меркаптоэтанола к BMV сократить большое количество дисульфидных связей.
    2. Инкубируйте в нагревательный блок в течение 5 мин при температуре 100 ° C.
    3. Загрузка образцов на гель SDS.
    4. Выполнить образцы при 200 В в течение 1 часа в 1x MOPS работает буфер.
    5. Документ гель под воздействием ультрафиолетового излучения для визуализации флуоресцентных белков пальто.
    6. Для не-флуоресцентный белок, пятно Кумасси синего (0,25% (вес / объем) Кумасси Brilliant Blue R-250, 30% (об / об) метанола, 10% (V / V) уксусной кислоты) в течение 1 часа.
    7. Destain с 30% метанола, 10% уксусной кислоты в течение ночи. ChanGE решение, если требуется.
    8. Документ гель при дневном свете.
  4. Анализ целостности частиц методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).
    1. Развести образцы 0.1-1 мг / мл в 20 мкл дистиллированной воды.
    2. Поместите 20 мкл капли образца на Parafilm.
    3. Крышка капель с сеткой ТЕА и пусть сидят в течение 2 мин. Вика излишки раствора на сетку с фильтровальной бумагой.
    4. Промойте сетку размещения на каплю воды DI, то влагу сухой.
    5. Пятно сетку, поставив на 20 мкл капли 2% (вес / объем) уранилацетата в течение 2 мин. Вика лишнее пятно с фильтровальной бумагой.
    6. Промойте сетку еще раз в воду.
    7. Соблюдайте сетку под просвечивающего электронного микроскопа.

4. Химическая Сопряжение VNPs с ПЭГ и флуорофоры, очистка и характеристика

  1. Для расчетов для реакций ниже, молярная масса VNPs являются:
    CPMV: 5,6х 10 6 г / моль
    PVX: 35 х 10 6 г / моль
    TMV: 41 х 10 6 г / моль
    BMV: 4,6 х 10 6 г / моль
  2. Сопряженные красителей и ПЭГ на поверхности лизинов из CPMV и ХВК, используя один шаг N-гидроксисукцинимид реакции сочетания: Добавить 2500 молярных эквивалентов (все молярной эксцессов относятся к молярным избытком в ВНП) от Alexa Fluor 647 сукцинимидил эфира и 4500 эквивалентами NHS- PEG (MW 5.000) растворяли в ДМСО в CPMV в 0,1 М фосфатного буфера калия. При работе с PVX, добавьте 10000 молярный избыток NHS-красителя и NHS-PEG. Отрегулируйте буфер и ДМСО объемы такие, что конечная концентрация CPMV и PVX составляет 2 мг / мл и ДМСО содержание составляет 10% от общего объема реакции. Выдержите в течение ночи реакционную смесь при комнатной температуре в защищенном от света месте. CPMV и PVX есть 300 и 1270 адресуемых лизина, соответственно. (Отсылаем читателя к следующей ссылки для дальнейшего чтения похимическая модификация CPMV и PVX: 13-15).
  3. Сопряженные красителей и PEG в тирозины ВТМ по диазония связи следует меди (I)-катализируемой азид-циклоприсоединения алкинов.
    1. Подготовка соли диазония (алкинов) путем смешивания 400 мкл 0,3 М р-толуолсульфокислоты, 25 мкл 3,0 М нитрита натрия и 75 мкл 0,68 млн. дистиллированной 3-ethynylaniline растворяют в ацетонитриле при 4 ° С в течение 1 часа.
    2. Добавить 3,3 мл боратного буфера, рН 8,8, содержащий 100 мМ NaCl в 1,25 мл ВТМ (20 мг / мл раствора).
    3. Реакция ВТМ с 450 мкл соли диазония (алкинов) раствор в ледяной бане в течение 3 часов, чтобы добавить алкином перевязки обращаться к ВТМ по диазония связи. Решение превратится в светло-коричневый цвет. TMV есть 2140 доступных тирозины для сопряжения.
    4. Очищают окончательного продукта с использованием сахарозы подушке, как описано в пункте 4.4.
    5. Прикрепить азид-функциональной Alexa Fluor 647 и ПЭГ-азид (MW 5.000) Усинг меди (I)-катализируемой азид-циклоприсоединения алкинов (CuAAC). Добавить 2 эквивалентов красителей и PEG-азид в белковую оболочку и инкубируют с 1 мМ CuSO 4, 2 мМ AMG, и 2 мМ аскорбата натрия при комнатной температуре в течение 15 мин. Отрегулируйте объем буфера так, чтобы конечная концентрация реакции ВТМ составляет 2 мг / мл. (Отсылаем читателя к следующей ссылки для дальнейшего чтения по химической модификации TMV: 16,17).
  4. Сопряженные красителей для лизина и цистеина PEG, чтобы из BMV цистеина мутант (cBMV):
    1. Добавить 2000 молярных эквивалентов Орегон Зеленый 488 сукцинимидил эфира растворяют в ДМСО в cBMV в 0,1 М TNKM буфера (50 мМ Трис-основания, 50 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2, рН 7,4). Отрегулируйте буфер и ДМСО объемы такие, что конечной концентрации BMV составляет 1 мг / мл и ДМСО содержание составляет 10% от общего объема реакции. Инкубируйте реакционной смеси в течение ночи при 4 ° C в защищенном от света.
    2. Purify частицы с помощью центробежнойfugal фильтры, как описано в пункте 4.4.
    3. Добавить 2000 молярного избытка PEG-малеимида (MW 2.000) с использованием тех же условиях реакции, как до, так и инкубировать реакционной смеси в течение 2 ч при 4 ° C. cBMV имеет 180 реактивных лизина и цистеина. (Отсылаем читателя к следующей ссылки для дальнейшего чтения по химической модификации BMV: 18).
  5. Очистка: Передать раствор через 40% (вес / объем) сахарозы подушке на 160000 мкг в течение 2,5 часов. Повторно растворить осадок в буфер. Кроме того, диализ против соответствующего буфера, используя 10 кДа отсечки фильтров спина.
  6. Характеристика: ПЭГилированный и флуоресцентно-меченных VNPs анализируются с помощью описанных выше методов: УФ / видимой спектроскопии, SDS гель-электрофореза, FPLC, и TEM (не показан, однако, относятся к рис. 6 и 7).

5. Нацеливание на опухоль и визуализации с использованием модели мыши ксенотрансплантата

  1. Культура НТ-29 толстой кишки человека раковых клеток в среде RPMI с добавлением 5% FBS, 1% пенициллина, стрептомицина и 1% L-глутамина при 37 ° С в 5% СО 2 с использованием 175 см 2 колбы культуре клеток.
  2. Вымойте клетки дважды стерильной PBS и сбора урожая путем инкубации с 5 мл трипсина-EDTA при 37 ° C в течение 5 мин. Инактивации трипсина с 5 мл среды RPMI. Сбор клеток путем центрифугирования при 500 мкг в течение 5 мин. при 4 ° С и ресуспендируют в свежей RPMI на 5x10 6 cells/50 мкл среды (определить общее количество клеток с использованием трипанового синего и гемоцитометр). Смешать с равным объемом матригель перед инъекцией (держать все решения и реагенты стерильные).
  3. Закупка шестинедельных NCR Nu / Nu мыши и сохранить их на люцерну диета на 2 недели. [Примечание:. Всех животных процедуры должны быть IACUC утвержденных] Вызвать ксенотрансплантатов опухоли путем подкожной инъекции 5x10 6 клеток/100 мкл / опухоли в бока (2 опухолей / мышь), используя 18 1/2 калибровочных стерильныхиглу. Следить за животным регулярно. Измерьте размер опухоли использованием суппортами и позволяют опухоли расти в среднем объеме 20 мм 3 (в течение 12 дней). Назначение мышей к двум различным группам случайным: PBS и ВНП (п = 3 животных / группы / момент времени). Использование 1 мл 28 Шприц инсулин датчика, управление внутривенно хвостовой вены для инъекций 100 мкл стерильной PBS или 10 мг / кг VNP формулировки.

Примечание: Культура ткани экспериментов и исследований с живыми животными не будет показано. Практическая демонстрация будет ограничено обработки тканей и сбора данных. Для ссылки на HT-29 модель ксенотрансплантатов опухоли, мы отсылаем читателя к работе 19.

Три методы используются для оценки опухоли самонаведения VNPs:

  1. Флуоресценция визуализации с использованием Maestro Imaging System: Жертва мышей в различные моменты времени (2, 24 и 72 часов) с использованием CO 2газа. Препарировать животных и акцизных все основные органы (мозг, сердце, легкие, селезенка, почки и печень), а также опухоли на флангах, разместить тканей на парафильмом и анализа с флуоресцентной инструмент визуализации с использованием желтого возбуждения и испускания фильтры (800 мс воздействия), чтобы обнаружить присутствие флуоресцентные сигналы в тканях (производное от A647 этикетке сопряженных с VNPs). Сохранить изображения и анализа интенсивности использования флуоресцентных ImageJ 1.44o программного обеспечения ( http://imagej.nih.gov/ij ). Сравните структуру поглощения VNPs в опухолях с другими крупными ткани со временем.
  2. После обработки изображений, разрезать каждую ткань пополам и одну половину вставлять в октябре соединение для крио-срезов и конфокальной анализа. Сбор другая половина в предварительно взвешенные крио-флаконов и сразу же заморозить их использованием жидкого N 2. Хранить при температуре от -80 ° C до готовности для дальнейшей обработки.
  3. Флуоресценция определения: ReШнур тканей веса. Оттепель замороженных тканей при комнатной температуре и поместите их в отдельную 50 мл пробирки Сокол, содержащий 1 мл PBS. Использование ручной гомогенизатор тканей, гомогенизации ткани в течение 2-3 мин в PBS затем передать гомогената в микроцентрифуге труб. Центрифуга гомогенатах в течение 10 мин при 13000 мкг для удаления не гомогенизированные ткани.
  4. Внесите 100 мкл супернатанта из тканей из каждой группы (PBS и VNP составы / моменты времени) в 384-луночные черные УФ пластины. Оценка интенсивности флуоресценции (Ex / Em длинами волн 600/665) с помощью планшетов. Нормализация полученных флуоресцентных значения по ткани весом.
  5. Иммуногистохимия: Подготовка крио-микротома разделах (10 мкм) и хранить при температуре -20 ° C. Пятно срезов тканей для клеточных ядер (DAPI) и эндотелиальные клетки маркером (FITC-меченных анти-CD31 антитела мыши). Провести конфокальной микроскопии анализа для сопоставления сосудистой и внутри опухолевой локализации флуоресцентно-меченных VNPс.

Примечание: Эта процедура не будет продемонстрировано, представитель данные приведены на рисунке 8. Для ссылки на иммуногистохимии и описаны методы окрашивания, мы отсылаем читателя к работе 19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сравнительный анализ роста растений; экспериментальная установка, исследование вариаций окраски листьев, метод определения хлороза.
Рисунок 1. Растения, зараженные растительными вирусами. Vigna unguiculata, зараженные CPMV (A). Nicotiana benthamiana, зараженные PVX (B), TMV (C) и BMV (D). Фотографии были сделаны примерно через 10 дней по...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает подход к химической модификации VNPs и их приложения в естественных изображений опухоли. Животное флуоресценции, флуоресценции количественного и иммуногистохимических методов, представленные здесь, полезны для изучения и оценки биораспределения опухоли самонаведения. Эти методы дают ценную информацию в отношении доступа наночастиц в опухоли с помощью ЭПР-эффект. Объединив результаты различных аналитических методов, мы получаем мощный подход к оценке локализации и биораспределение VNPs...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана NIH / NIBIB грантов R00 EB009105 (для NFS) и P30 EB011317 (для NFS), NIH / NIBIB обучение грант T32 EB007509 (для AMW), Case Western Reserve University Междисциплинарный Alliance Investment Грант (для NFS), и дело Всесторонний Онкологический центр грант P30 CA043703 (для NFS). Мы благодарим Steinmetz Лаборатории бакалавриата студент исследователей для их практической поддержки: Надя Аят, Кевин Чен, Sourav (Sid) Dey, Элис Янг, Сэм Александр, Craig D'Cruz, Стивен Херн, Лорен Рэндольф, Брайан Таким образом, и Павел Chariou .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Производство ВНЧ
Камера для комнатных растенийPercival ScientificE-41L2
V. unguiculata семена (California black-eye № 5)Берпи51771A
N. benthamiana семенаСемена N. benthamiana были предоставлены в качестве подарка Институтом Солка. Семена получают путем размножения растений.
КарборундФишерC192-500
Посадочный грунт Pro-mix BXPremier Horticulture713400
Профессиональное удобрение Jack's Professional 20-10-20 для торфяных субстратов (Peat-Lite)Дж. Р. Питерс77860
Оборудование
50,2 Ти rotor (титановый ротор)Beckman337901
Ротор SW 32 TiBeckman369694
Ультрацентрифуга Optima L-90KBeckman365672
ротор SLA-3000Thermo Scientific07149
ротор SS-34Thermo Scientific28020
Центрифуга Sorvall RC-6 PlusThermo Scientific46910
Полипропиленовый флаконBeckman355607Для ротора SLA-3000
Поликарбонатная бутыльBeckman357002Для ротора SS-34
Прозрачная пробирка Ultra-ClearBeckman344058Для градиента сахарозы и ротора SW 32 Ti
Поликарбонатная бутылкаBeckman355618Для осаждения и ротора 50.2 Ti
Спектрофотометр NanoDropThermo ScientificNanoDrop2000c
Система готовых гелей PowerEase 500InvitrogenEI8675EU
Колонка для эксклюзионной хроматографии Superose 6 10/300 GL (24 мл)GE Healthcare17-5172-01
ÄХроматограф KTA Explorer 100GE Healthcare28-4062-66
Allegra X-12RBeckman392302Настольная центрифуга
КриостатLeicaCM1850
Maestro 2Caliper Life SciencesIn vivo система визуализации
Разрыв тканейBiospec Products985370-395
Считыватель микропланшетовTecanInfinite-200
Просвечивающий электронный микроскопZEISSLibra 200FE
Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп FluoViewOlympusFV1000
Химические вещества и реагенты
3-этиниланилинSigma Aldrich498289-5G
черный 384-луночный планшетBD Biosciences353285
4–12% Bis-Tris NuPAGE SDS-гельInvitrogenNP0321BOX
4X буфер для образцов LDSInvitrogenNP0008
Уксусная кислотаFisherA385-500
АцетонитрилSigma Aldrich271004-1L
азид Alexa Fluor 647InvitrogenA10277
Alexa Fluor 647, карбоновая кислота, сукцинимидовый эфирInvitrogenA20006
Центрифужные фильтры Amicon Ultra объемом 0,5 млMilliporeUFC501096порог отсечения 10 кДа
Гидрохлорид аминогуанидинаAcros Organics36891-0250
Борная кислотаFisherA74-500
Кумасси бриллиантовый синий R-250ФишерBP101-25
CsClAcros Organics42285-1000
DAPIMP Biomedicals157574
ДиметилсульфоксидFisherBP231-100
Фильтровальная бумагаFisher09-801KСорт P5
FITC-меченные антитела к мышиному CD31BioLegend102406
Сыворотка козыInvitrogen16210-064
KClФишерBP366-500
натриевая соль L-аскорбиновой кислотыAcros Organics35268-0050
МетанолФишерA412P-4
MgCl₂2ФишерBP214-500
Предметные стеклаFisher12-544-3
Покровное стекло для микроскопаVWR48366-277
буфер MOPSInvitrogenNP0001
mPEG-malНаночастицыPG1-ML-2kММ 2000
mPEG-N3НаночастицыPG1-AZ-5kММ 5000
mPEG-NHSНаночастицыPG1-SC-5kММ 5000
NaClФишерBP358-212
сукцинимидный эфир Oregon Green 488, *6-изомер*InvitrogenO-6149
моногидрат п-толуолсульфоновой кислотыAcros Organics13902-0050
Закрепитель для микропрепаратов (Permount)ФишерSP15-100
Дигидрофосфат калияFisherBP363-1
Дигидрофосфат калияФишерBP362-1
Ацетат натрияФишерBP333-500
Нитрит натрияAcros Organics42435-0050
Сульфит натрияAmresco0628-500G
СахарозаFisherS6-500
Сетка для ПЭМТед ПеллаFCF-400Cu
Tris-основаниеФишерBP152-500
Triton X-100EMD ChemicalsTX1568-1
β-меркапто–этанолФишерO3446I-100
Культура тканей
Фетальная бычья сывороткаInvitrogen12483-020
ГемоцитометрФишер0267110
клетки HT-29ATCCHTB-38
L-глутаминInvitrogen25030-080
ФСБ (фосфатно-солевой буфер)Cellgro21-040-CV
Пенициллин-стрептомицинInvitrogen10378-016
RPMI-1640Invitrogen31800-089
Флаконы для культивирования тканейCorning431080175 см2
Трипановый синийThermo ScientificSV30084.01
Трипсин, 0,05% (1X) с EDTA 4Na, жидкостьInvitrogen25300-054
Исследования на животных
Корм для грызунов с содержанием белка 18%Harlan TekladTeklad Global 2018SДиета без люцерны
Инсулиновый шприцBD Biosciences329410игла 28G
ИзофлуранБакстерAHN3637
Матрикс Matrigel, базальная мембранаBD Biosciences356234
мыши NCR nu/nuШкола CWRU
Центр по работе с атимическими животными и ксенотрансплантатами медицинского факультета
Стерильный шприцBD Biosciences305196игла калибра 18 1/2
Состав Tissue-Tek CRYO-OCTAndwin Scientific4583

Ссылки

  1. Description of Plant Viruses [Internet]. , Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: http://dpvweb.net/ (2012).
  2. Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
  3. Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
  4. Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
  5. Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. , (2011).
  6. Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
  7. Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
  8. Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
  9. Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
  10. Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
  11. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
  12. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
  13. Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
  14. Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
  15. Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
  16. Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. , (2012).
  19. Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
  20. Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. , (2012).
  21. Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Вирусы растенийочистка CPMVфлуоресцентное мечениеПЭГилированиетропность к опухолимодель ксенотрансплантата у мышейфлуоресцентная визуализацияконфокальная микроскопияэксклюзионная хроматография
Вирусный наночастиц для
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.