Методическая статья

Подготовка везикул F1FO-АТФазы и методика проведения локальной фиксации потенциала (patch clamp) на мембранах субмитохондриальных везикул

DOI:

10.3791/4394

⸱

4 мая 2013 г.

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Yale University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способе выделения пузырьков субмитохондриальных обогащенный F1FO АТФ-синтазы комплексов из мозга крысы описано. Эти пузырьки позволяют изучение активности АТФазы F1FO комплекса и его модуляции с использованием техники записи патч зажима.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии участвуют во многих важных клеточных функций, включая метаболизм, выживание 1, развитие и, кальциевой сигнализации 2. Два из наиболее важных функций митохондрий связаны с эффективного производства АТФ, энергия валюты из клетки, по окислительного фосфорилирования, и посредством сигналов запрограммированной клеточной смерти 3.

Фермент в первую очередь отвечает за производство АТФ F1FO-АТФ-синтазы, которая также называется АТФ-синтазы 4-5. В последние годы, роль митохондрий в апоптозе и некротической гибели клеток получила значительное внимание. В апоптоза, BCL-2 семьи белки, такие как Bax введите митохондриальные наружной мембраны, олигомеризоваться и проницаемыми внешнюю мембрану, высвобождая проапоптотические факторов в цитозоль 6. В классическом некротической гибели клеток, такие как отходы ишемии или эксайтотоксичностью в нейронах, крупе, плохо регулируется увеличение матрицы кальций способствует открытию внутреннего пор мембраны, митохондриальных пор переход проницаемости или МРТР. Это деполяризует внутренней мембраны и вызывает осмотические сдвиги, способствующие разрыву внешней мембраны, выпуск проапоптотические факторы и метаболические дисфункции. Многие белки, включая Bcl-XL 7 F1FO взаимодействовать с АТФ-синтазы, модулирующей функции его. Bcl-X L непосредственно взаимодействует с бета-субъединицы АТФ-синтазы F1FO, и это взаимодействие уменьшается утечка проводимость в F1FOATPasecomplex, увеличение чистой переноса Н + на F1FO в течение F1FO АТФазы 8 и тем самым увеличивая митохондриальной эффективности. Для изучения активности и модуляция АТФ-синтазы, мы изолированы от грызунов мозговых пузырей субмитохондриальных (SMVs), содержащий F1FO АТФазы. SMVs сохранить структурную и функциональную целостность F1FO АТФазы, как показано на Alavian соавт. Здесь мы описываем способчто мы успешно используется для изоляции SMVs из мозга крысы, и мы разграничить технику патч зажим для анализа активности канала (ионная проводимость утечки) из SMVs.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Мозг митохондриальной Изоляция (адаптировано из Браун MR и др.. 9)

  1. Жертвоприношение крысы с использованием методов одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC).
  2. Отрежьте голову животного путем обезглавливания, порезать кожу и выставить черепа.
  3. Откройте череп мягко путем разрезания ножницами или костными кусачками. Удалить мозга.
  4. Пропустить через мясорубку мелко мозг без мозжечка в Изоляции Buffer (см. таблицу 1) и передать его на 5 мл стекло / тефлоновый гомогенизатор (см. список оборудования).
  5. Гомогенизируют ткани мягко 10 раз (без пузырьков), примерно 5 мин.
  6. Центрифуга образца при 1500 х г в течение 10 мин при 4 ° С в настольная центрифуга.
  7. Сохранить супернатант (митохондриальная и синаптосомах) и отказаться от осадка (ядерных материалов и остатков клеток). Центрифуга при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° С в настольная центрифуга.
  8. ОтбрасыватьНадосадочную жидкость и повторно приостанавливать осадок в 500 мкл буфера изоляции. Нарушить синаптосомах с сосудом разрушения клеток (см. список оборудования). Применяют давление 1200 фунтов на квадратный дюйм в течение 10 минут с последующим быстрым декомпрессии.
  9. Слой смеси на Фиколл градиентов (см. таблицу 2), место в SW-50,1 ротора и центрифуге при 126500 × г в течение 20 мин при 4 ° С в ультрацентрифуге (см. список оборудования). Гранулы очищенных митохондрий, слой между различными плотности Ficoll является бесперебойное синаптосомах.
  10. Вымойте гранул путем центрифугирования в Изоляции буфера при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° С в настольная центрифуга.

2. Субмитохондриальных пузырьки (SMV) Изоляция (адаптировано из Chan и соавт. 10)

  1. Повторное приостановить митохондрий в 200 мкл буфера Выделение смешивали с равным объемом 1% дигитонина и позволяют сидеть на льду в течение 15 мин.
  2. Добавить еще Изоляция БуффER и центрифуге при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° С в настольная центрифуга. Сделайте это в два раза.
  3. Повторное приостановить осадок в 200 мкл буфера для изоляции и добавить 2 мкл 10% Lubrol PX (C12E9). Перемешать и дать сидеть на льду в течение 15 мин.
  4. Слой смеси на Выделение буфера, место в SW-50,1 ротора и центрифугируют при 182000 × г при 4 ° С в течение 1 часа.
  5. Вымойте конечный осадок путем центрифугирования в настольные центрифуги в Изоляции буфера при 16000 × г в течение 10 мин при 4 ° C.

3. Электрофизиологические записи

  1. Типичная установка электрофизиологии включает в себя усилитель, компьютер компьютер, оснащенный Digidata 1440A аналого-цифровой преобразователь интерфейса в сочетании с pClamp10.0 программное обеспечение, манипуляторы, микроскоп, стол виброизоляции, клетки Фарадея.
  2. Боросиликатного стекла капиллярные трубки вставляются в Flaming / коричневый микропипетки съемник Модель P-87. Пипетки съемник Программа оптимизирована длягенерировать пипетки с сопротивлением от 80 до 100 МОм.
  3. SMVs помещают в физиологический внутриклеточный раствор (добавляют АТФ в соответствующее время в процессе записи) (табл. 3). Пипетки патч зажим заполнены тем же раствором (без АТФ). Записи выполняются путем формирования гига-ом уплотнение на SMVs при комнатной температуре. Пузырьки визуализируются фазово-контрастной микроскопии с Nikon или инвертированный микроскоп Zeiss.
  4. Мембранный потенциал поддерживается при напряжении в диапазоне от -100 мВ до +100 мВ в течение периода 10 секунд. Записи фильтруют при 5 кГц при помощи схему усилителя. Уровень паразитных электрических или неспецифический шум меньше 1 мкА являются желательными для успешной записи.
  5. Данные анализируют с Clampfit 10,0 программного обеспечения, например, чтобы определить частоту и амплитуду одного события канала. Напряжение зависимость определяется путем построения нынешние отношения напряжения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первый этап нашего протокола позволяет выделить очищенные митохондрии, что подтверждается результатами вестерн-блоттинга на рисунке 1. На рисунке 2 представлен пример записи патч-клампа субмитохондриальных везикул, выделенных из мозга. Используя конфигурацию патча «изнутри-наружу» (inside-out), мы демонстрируем активность каналов, модулируемую ATP. Контрольная (CTL) запись (слева) показывает активность многопроводящих каналов со средней пиковой проводимостью 600 pS, которая немедленно сн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанные здесь способы включить выделение чистой митохондрий в конце стадии 1 и субмитохондриальных везикулы (SMVs) после шага 2 от всего головного мозга без различия клетки phenotypes.SMVspurified этим методом, по существу свободный от загрязнения другими субклеточные органеллы, как показано На рисунке 1 и нашей предыдущей работе (Alavian К.Н. и соавт. 8) и сохраняют свою структурную и функциональную целостность перед замораживанием. После замораживания и оттаивания, изолированными...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Гомогенизатор Поттера-Эльвехьема с ПТФЭ-пестикомKrackeler Scientific, Inc.1-7725T-5
Центрифуга Eppendorf 5424 Eppendorf5424 000.410
4639 Сосуд для разрушения клетокParr Instrument Company4639
ФикольSigma-AldrichF5415
Центрифужные пробирки из поликарбонатаBeckman CoulterP20314
ротор SW-50.1 Beckman Coulter
Ультрацентрифуга L8-70MBeckman Coulter
ДигитонинSigma-AldrichD5628
Lubrol PX (C12E9) Calbiochem205534
Axopatch 200B Axon Instruments
Digidata 1440A Молекулярное устройство
pClamp10.0Молекулярное устройство
МанипуляторSutter Instrument
Боросиликатная стеклянная капиллярная трубкаWorld Precision Instruments1308325
Вытяжка микропипеток методом обжига/нагрева, модель P-87Sutter Instrument

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
  2. Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).
  3. Lemasters, J. J. Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism. J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).
  4. Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit. Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).
  5. Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits. Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).
  6. Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis. Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).
  7. Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis. Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).
  8. Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).
  9. Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
  10. Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities. J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).
  11. Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. Mitochondrial ATP Synthasomes. J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи