Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Microgavage из личинки данио рерио

17.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4434

⸱

20 февраля 2013 г.

 , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем новый метод микрогаважа личинок zebrafish с использованием стандартного оборудования для микроинъекций эмбрионов и стереомикроскопии. Мы демонстрируем, что микрогаваж является безопасным и эффективным методом, подходящим для доставки контролируемого количества различных материалов непосредственно в просвет кишечника личинок zebrafish.

Аннотация

Рыбка-зебра стала мощным модельным организмом для изучения развития кишечника1-5, физиологии6-11, заболеваний12-16 и взаимодействий между хозяином и микробами17-25. Экспериментальные подходы к изучению биологии кишечника часто требуют введения выбранных материалов в просвет кишечника in vivo. В модели личинок рыбки-зебры это обычно осуществляется путем погружения рыб в раствор выбранного вещества или путем инъекции через брюшную стенку. При использовании метода погружения трудно точно контролировать или отслеживать путь или время доставки материала в кишечник. По этой причине воздействие при погружении может вызвать непреднамеренную токсичность и другие эффекты в тканях вне кишечника, что ограничивает потенциальный диапазон количеств материала, которые могут быть доставлены в кишечник. Кроме того, количество материала, поглощаемого при погружении, может значительно варьироваться между отдельными личинками26. Хотя эти проблемы не возникают при прямой инъекции через брюшную стенку, правильное проведение инъекции затруднительно и вызывает повреждение тканей, что может повлиять на результаты эксперимента. Мы представляем метод микрозондажа (микрогаважа) личинок рыбки-зебры. Целью этого метода является обеспечение безопасного, эффективного и стабильного способа доставки материала непосредственно в просвет переднего отдела кишечника личинок рыбки-зебры с контролируемым временем введения. Микрозондаж использует стандартное оборудование для микроинъекций эмбрионов и стереомикроскопию, имеющиеся в большинстве лабораторий, занимающихся исследованиями рыбок-зебра. После того как рыбки правильно зафиксированы в метилцеллюлозе, зондирование может быть выполнено быстро, со скоростью примерно 7-10 рыб/мин, а выживаемость после процедуры приближается к 100% в зависимости от вводимого материала. Мы также показываем, что микрозондаж позволяет заполнять просвет кишечника высокими концентрациями веществ, которые летальны для рыб при воздействии методом погружения. Чтобы продемонстрировать полезность этого метода, мы представляем анализ микрозондажа с использованием флуоресцентного декстрана, который может быть использован для количественного определения переноса из просвета кишечника в экстракишечные пространства. Этот тест может быть использован для проверки правильности выполнения процедуры микрозондажа, а также представляет собой новый анализ на рыбках-зебра для изучения целостности кишечного эпителиального барьера при различных экспериментальных условиях (например, генетические манипуляции, лекарственная терапия или воздействие факторов окружающей среды). Кроме того, мы показываем, как зондирование может быть использовано для оценки моторики кишечника путем введения флуоресцентных микросфер и последующего мониторинга их перемещения. Микрозондаж может быть применен для доставки различных материалов, таких как живые микроорганизмы, секретируемые микробные факторы/токсины, фармакологические агенты и физиологические зонды. Благодаря этим возможностям метод микрозондажа личинок рыбки-зебры обладает потенциалом для расширения широкого спектра областей исследований с использованием модельной системы рыбки-зебры.

Протокол

Для получения личинок для микрогаважа мы используем опубликованные протоколы стандартного содержания и ухода за зебрафиш27. Для разведения рыб мы преимущественно используем естественный метод; рыбы содержатся при световом режиме 14 ч свет/10 ч темнота. Данный протокол оптимизирован для микрогаважа личинок зебрафиш на 6–7 день после оплодотворения (dpf). Мы полагаем, что эти методы будут в целом применимы к более ранним и более поздним стадиям развития при внесении незначительных модификаций. Если не указано иное, мы использовали штамм зебрафиш TL дикого типа на стадии 6 dpf, рыбы не подвергались кормлению. Все эксперименты проводились в системной воде, полученной из нашего стандартного комплекса по аквакультуре зебрафиш; однако может быть использована любая подходящая среда для зебрафиш (например, среда для эмбрионов или гнотобиотическая среда для зебрафиш (GZM)28). В данном протоколе под термином «среда для зебрафиш» подразумевается выбранная пользователем среда.

1. Приготовление метилцеллюлозы, формы для зондирования и изготовление иглы для микрозондирования

За день до начала эксперимента или рано утром в день проведения подготовьте метилцеллюлозу, агарозную форму для стабилизации личинок и иглы для микрогаважа.

  1. Растворите 3 g метилцеллюлозы в 100 ml стерильной деионизированной воды или среды для данио-рерио (в зависимости от целей вашего исследования), чтобы получить 3% раствор. Поместите в бутыль магнитный перемешиватель, нагрейте воду почти до кипения и установите на магнитную мешалку на сильный нагрев. При перемешивании медленно всыпайте метилцеллюлозу, чтобы избежать образования комков. В течение дня постепенно снижайте скорость перемешивания и температуру плитки до достижения комнатной температуры.
  2. Продолжайте медленно перемешивать раствор в течение ночи до полного растворения метилцеллюлозы. Раствор можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев в герметичном контейнере.
  3. Подготовьте форму из 3% агарозного геля в чашке Петри диаметром 10 cm, используя пластиковую форму (Adaptive Science Tools, TU-1) в соответствии с инструкциями производителя. Загерметизируйте парафильмом и храните при 4 °C до использования во избежание высыхания. Перед началом эксперимента доведите до комнатной температуры или 28 °C. Агарозные формы, как правило, можно использовать повторно несколько раз.
  4. Изготовьте несколько игл для зондового кормления, используя боросиликатные стеклянные капилляры и вытяжку для микропипеток Flaming Brown (FT330B), оснащенную нагревательным элементом с широким желобом. Программы, которые мы используем для изготовления игл, следующие:
Тип иглыДавлениеНагревВытягиваниеСкоростьВремя
эмбриональная50031510050200
для зондового кормления50031512575200

Поскольку характеристики нитей могут различаться в зависимости от прибора, зафиксируйте время разгона (время активного нагрева). Для данной программы время разгона составляет от 8,57 до 8,79 ms. При использовании этой программы получаются более короткие и массивные иглы, чем при использовании традиционных игл для микроинъекций (Рисунок 1). Эти настройки могут потребовать оптимизации для использования в разных вытягивателях микропипеток.

2. Обрезка, заполнение и калибровка игл для микрогаважа

Примечание*: Обрезка иглы является критически важным этапом данного протокола. Кроме того, методы загрузки и калибровки игл будут различаться в зависимости от используемого блока для микроинъекций. Мы оптимизировали этот протокол с использованием микроинъекторов Drummond II, однако полагаем, что он будет применим и к другим инструментам для микроинъекций при внесении незначительных модификаций. Поскольку установки для инъекций и вытягиватели игл различаются в разных лабораториях, важно будет измерить/откалибровать объемы инъекций (см. раздел 2.8).

  1. Иглы обрезают под стереомикроскопом. Мы используем стереомикроскоп Leica S6E с увеличением 2,5x. При таком увеличении окулярная измерительная шкала со 100 делениями имеет длину 2 мм.
  2. Совместите кончик иглы с концом измерительной шкалы (отметка 100) и обрежьте иглу с помощью часового пинцета с тонкими кончиками на расстоянии ~1 мм от кончика (отметки 48-50) (Рисунок 1A).
  3. Диаметр иглы должен составлять ~27-30 μm, кончик должен быть тупым. Осмотрите кончики игл при 100-кратном увеличении. Острые или зазубренные иглы повышают вероятность повреждения при зондировании, поэтому их следует избегать по возможности.
  4. В качестве альтернативы, при наличии, можно использовать микрофорж для более точного контроля точки обреза иглы и огневой полировки кончиков игл для удаления острых краев (Рисунок 1B).
  5. Приготовьте раствор для зондирования. Для большинства применений мы готовим раствор с добавлением разведения 1:10 0,5% раствора фенолового красного в фосфатно-солевом буферном растворе Дульбекко (DPBS) (Sigma-Aldrich), чтобы раствор был виден под стереомикроскопом для контроля правильной работы микроинжектора и размещения раствора в передней луковице. Другие красители для визуализации, помимо фенолового красного, не оценивались, но могут быть использованы.
  6. Подготовьте иглу для зондирования, заполнив ее минеральным маслом с помощью шприца объемом 1 ml с иглой 25G 5/8. Установите иглу в блок для микроинъекций Nanoject II.
  7. Оберните пластиковую чашку Петри диаметром 10 cm парафильмом для создания плоской водонепроницаемой поверхности и нанесите на парафильм аликвоту ~2 μl раствора для зондирования. Вручную заполните иглу для зондирования, стараясь не допускать появления пузырьков воздуха в минеральном масле.
  8. Чтобы проверить работу микроинжектора и откалибровать объем выброса, наполните чашку Петри диаметром 3 cm минеральным маслом и делайте инъекции в масло до тех пор, пока капли не станут одинаковыми по размеру. Измерьте диаметр капель с помощью измерительной шкалы или функции измерения стереомикроскопа, если она имеется. Рассчитайте объем капли (Формула: V=4/3πr3). График стабильности объема между разными иглами представлен на Рисунке 1C.
  9. Перед началом зондирования промойте кончик иглы путем многократного погружения в чистую среду для рыб-зебра (zebrafish media), чтобы удалить остатки минерального масла. Минеральное масло обладает высокой плотностью и может повредить эпителиальные ткани, если оно не будет удалено с кончика иглы.

3. Анестезия, монтирование и зондовое введение веществ личинкам zebrafish

  1. Перед началом эксперимента прогрейте форму из агарозы до комнатной температуры или 28 °C.
  2. Подготовьте форму из агарозы для зондирования, заполнив 3 желоба 3% раствором метилцеллюлозы. Используйте количество метилцеллюлозы, достаточное для заполнения желобов и фиксации рыб, но не слишком малое, чтобы она не высохла быстро.
  3. В чистый 6-луночный планшет распределите личинок zebrafish по экспериментальным группам в отдельные лунки, каждая из которых содержит 3,5-4,0 ml среды для zebrafish.
  4. Приготовьте 3-кратный раствор трикаина (0,05% w/v) на соответствующей среде для zebrafish. Анестезируйте рыб поочередно в каждой лунке, добавляя в лунку с личинками равный объем 3-кратного раствора трикаина для достижения конечной концентрации 1,5x (0,025%), и осторожно перемешайте круговыми движениями.
  5. Как только zebrafish перестанут двигаться, извлеките их из лунки с помощью стеклянной пастеровской пипетки с широким отверстием и пипеточного дозатора и поместите по одной на метилцеллюлозу так, чтобы голова находилась под углом 45° к желобу, а хвост был направлен к углу 90°. Осторожно прижмите их к метилцеллюлозе тупым зондом для диссекции, чтобы стабилизировать их положение.
  6. Настройте установку для микроинъекций Nanoject II так, чтобы игла была наклонена под малым углом, примерно параллельно 45°-му углу агарозной формы. Убедитесь, что диапазон выдвижения иглы достаточен для достижения дна лунки формы, чтобы после размещения рыб потребовалось меньше корректировок.
  7. Настройте блок микроинъекций на введение 4,6 nl (максимум) в режиме медленного впрыскивания (23 nl/sec). При таких настройках вводимый объем должен заполнять только переднюю луковицу кишечника, не вытекая через пищевод или клоаку. В зависимости от целей эксперимента могут быть использованы меньшие объемы.
  8. Одной рукой вносите незначительные корректировки в положение планшета с иммобилизованными личинками, одновременно управляя манипулятором блока микроинъекций другой рукой.
  9. Осторожно введите иглу для зондирования в рот анестезированной рыбы, через пищевод, и слегка надавите на сфинктер пищевода, чтобы кончик иглы оказался непосредственно внутри передней луковицы кишечника (Рисунок 2, шаги 1-2, a&b).
  10. После введения иглы в переднюю луковицу аккуратно нажмите на педаль или кнопку инъекции, чтобы ввести вещество. Быстро и плавно извлеките иглу, стараясь не оставить значительного количества вещества в пищеводе (Рисунок 2, шаги 3-4).
  11. После зондирования с помощью стеклянной пастеровской пипетки с широким отверстием и пипеточного дозатора осторожно перенесите личинок zebrafish в свежую среду. Заполните пипетку водой примерно на 1 дюйм выше изгиба горлышка, создайте небольшой водяной карман в метилцеллюлозе у головы личинки, чтобы освободить ее, аккуратно приподнимите голову, поместив ее в отверстие пипетки, и вытяните личинку из метилцеллюлозы. Осторожно выпустите рыбу вместе со всей водой из пипетки в чашку со свежей средой.
  12. Промойте личинок в свежей среде, осторожно прокачивая их пипеткой вверх-вниз или несколько раз ополоснув средой, чтобы удалить метилцеллюлозу и вывести личинок из состояния анестезии. Перенесите личинок в чашку Петри или 6-луночный планшет до момента их использования для последующей визуализации и анализа.

4. Анализ содержания декстрана для проверки безопасности зондового введения и целостности кишечного барьера

Микрогаваж может быть использован для доставки различных веществ в кишечник. В качестве примера ниже представлен протокол введения декстрана 10 kD, конъюгированного с Texas Red, для анализа целостности барьера кишечного эпителия. Существуют как минимум два потенциальных пути парацеллюлярной проницаемости, различающихся селективностью в зависимости от заряда и размера растворенных веществ; их называют путями «пор» (pore) или «утечки» (leak)29. Поскольку данный декстран слишком велик, чтобы абсорбироваться через кишечный эпителий посредством парацеллюлярного порового пути (ограничение по размеру ~4Å, декстран 10kD = ~23Å)9,30-32, он должен оставаться в просвете кишечника, если целостность кишечного барьера не нарушена. Хотя декстран 10 kD может транспортироваться через парацеллюлярный путь утечки, этот путь характеризуется меньшей пропускной способностью и более медленной кинетикой29,33, и, следовательно, вряд ли будет задействован в течение времени проведения данного анализа. В качестве «положительного контроля» для нарушения целостности барьера используется EDTA, который разрушает плотные контакты эпителия34,35. Этот метод гаважа декстраном может использоваться в качестве теста контроля качества, чтобы продемонстрировать, что процедура гаважа выполняется безопасно и без непреднамеренного повреждения тканей. Кроме того, данный анализ можно использовать для проверки целостности кишечного барьера в зависимости от генотипа или проводимого лечения.

  1. Приготовьте следующие растворы для зондового введения: 1% декстран/1x PBS/0,05% феноловый красный и 1% декстран/20 mM EDTA/1x PBS/0,05% феноловый красный (положительный контроль). Стоковый раствор 5% декстрана в ddH2O хранится в аликвотах по 50 μl при -20 °C для уменьшения количества циклов замораживания-оттаивания. Также приготовьте контрольный раствор для зондового введения (mock gavage), состоящий из 1x PBS/0,05% фенолового красного.
    положительный контроль (EDTA)без EDTA
 исходный растворконечная концентрациякоэффициент разведения10 μl10 μl
EDTA, pH 8200 mM20 mM1010
Декстран5%1%522
PBS10x1x1011
Феноловый красный0,50%0,05%1011
   промежуточный итог:54
   ddH2O:56
   Итого:1010
  1. Используйте протокол, описанный в разделе 3, для проведения зондирования групп по 10–20 личинок zebrafish для каждого экспериментального условия. По возможности повторите процедуру на двух или трех группах.
  2. После зондирования выведите личинок из состояния анестезии и дайте им свободно плавать в свежей среде.
  3. Через 18–20 мин после зондирования повторно проведите анестезию личинок, как описано в шаге 3.3. Поместите личинок в 3% метилцеллюлозу на блок из 3% агарозы (это уменьшает фоновое бликование при визуализации).
  4. Сфотографируйте личинок с помощью флуоресцентного стереомикроскопа (например, Leica M205C>) и набора фильтров Texas Red при таком увеличении, чтобы в поле зрения попадали личинки от рыла до области сразу за клоакой.
  5. Снимайте все изображения при одинаковых настройках экспозиции, чтобы в дальнейшем их можно было количественно оценить и сравнить. Флуоресценция будет интенсивной в просвете кишечника всех личинок, которым ввели декстран, однако функция барьера оценивается по уровню декстрана, который появляется в внекишечных тканях (т. е. в туловище и кровеносных сосудах) (Рисунок 5). Настройте экспозицию так, чтобы была видна флуоресценция туловища, даже если это приведет к переэкспонированию флуоресценции в просвете.
  6. Сдвигайте время зондирования таким образом, чтобы каждая группа проводила примерно одинаковое время в состоянии восстановления после процедуры и подвергалась визуализации примерно через одно и то же время после зондирования. В данном эксперименте одному человеку требуется примерно 1 ч на одну группу. Рыбы анестезируются через 18–20 мин после зондирования, а визуализация занимает ~1–2 мин на одну рыбу.
  7. Используйте программу для анализа изображений, такую как ImageJ, чтобы количественно определить относительную среднюю интенсивность флуоресценции в области туловища непосредственно над кишечником. Нормализуйте эти значения, вычтя фоновое измерение, полученное в области изображения вне тела рыбы.
  8. Постройте графики и проанализируйте данные анализа изображений с помощью GraphPad Prism или аналогичного статистического программного обеспечения.

5. Анализ с использованием флуоресцентных микросфер для тестирования кишечной моторики

Зондовое введение (гаваж) обеспечивает более точный контроль времени и объема вводимого в кишечник материала, что делает этот метод идеальной альтернативой для изучения моторики кишечника. Ранее опубликованные методики измерения моторики кишечника у личинок zebrafish включают прямое наблюдение сокращений и волн в кишечнике с помощью микроскопии1,21,36 или кормление личинок кормом, смешанным с желто-зелеными флуоресцентными полистирольными микросферами26. В некоторых исследованиях количественная оценка паттернов моторики кишечника была улучшена путем погружения личинок в среду, содержащую пищевой краситель37, или с помощью специального метода видеоанализа, называемого пространственно-временным картированием38,39. Здесь мы представляем концептуальное исследование, демонстрирующее возможность введения флуоресцентных микросфер в переднюю луковицу кишечника методом гаважа, при этом отслеживание перемещения микросфер может быть использовано для оценки моторики кишечника (Рисунок 6). Основное отличие данного метода от подхода Field и коллег26 заключается в том, что микросферы вводятся отдельно и не могут быть включены в состав корма из-за ограничений диаметра иглы для гаважа.

  1. Содержите личинок zebrafish в чашках диаметром 10 cm с 35 ml среды до момента проведения эксперимента на 7 dpf. Начиная с 5 dpf, кормите личинок каждое утро, используя ~0.6 mg порошкообразного корма (диета для личинок, как было описано ранее40; вводится с помощью стерильной инокуляционной петли диаметром 1 mm).
  2. Осторожно встряхните флакон с полистирольными микросферами Fluoresbrite YG 2.0 μm (~2.5% водная суспензия) для перемешивания. Нанесите каплю из флакона на парафильм, чтобы можно было отмерить определенный объем с помощью пипетки.
  3. В пробирке типа эппендорф центрифугируйте микросферы на низкой скорости в настольном микроцентрифугаторе, удалите супернатант и замените его 1x PBS в исходном объеме. Повторите эту процедуру, чтобы промыть микросферы 2 раза.
  4. Приготовьте суспензию для зондирования, содержащую 0.25% микросфер (разведение исходной суспензии 1:10)/1x PBS/0.05% фенолового красного. В объеме зондирования 4.6 nl, вводимом одной личинке, содержится ~2.6x103 микросфер.
  5. Используйте протокол, описанный в разделе 3, для зондирования необходимого количества личинок. Микросферы обладают определенной плавучестью, поэтому зондирование следует проводить как можно быстрее для обеспечения максимальной однородности суспензии.
  6. В данном эксперименте 15 личинок подвергли зондированию, а затем после выхода из наркоза содержали в отдельных лунках 12-луночного планшета для отслеживания транзита у каждой особи. Однако можно проводить зондирование и более крупных групп, оценивая транзит в популяции, а не индивидуально. Стандартные методы описаны в работе Field et al.26
  7. Оценивайте моторику кишечника, определяя наиболее ростральное (или переднее) положение флуоресцентных микросфер у живых личинок в разные моменты времени с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. Кратковременно анестезируйте личинок в 1x (0.017%) трикаине, определите зоны расположения микросфер или сделайте снимки для последующего анализа.
  8. Постройте график и сравните процент общего числа личинок с микросферами в определенной области кишечника с течением времени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

При правильном проведении зондирования вводимый материал должен полностью находиться в переднем отделе кишечника, при этом в пищеводе должно остаться минимум материала или его не должно быть вовсе (Рисунок 3). Следует выбрать такой объем введения, который может быть вмещен в переднюю луковицу и не будет вытекать через клоаку или пищевод. Если объем материала или давление при введении будут слишком высокими, физическое воздействие при зондировании может привести к повреждению эпителия или протеканию через...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной работе мы описываем новый протокол прямой доставки веществ в кишечник личинок zebrafish методом микрозондирования. В ходе процедуры существует несколько критических этапов, которые необходимо учитывать. Во-первых, личинки zebrafish должны быть здоровы перед проведением зондирования, чтобы исключить гибель особей по причинам, не связанным с воздействием. Другим важным фактором является качество иглы для зондирования. Одним из наиболее сложных этапов протокола является обрезка иглы в нужном месте без образования о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не задекларирован.

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лаборатории Ролза за полезные предложения по содержанию и доктора Алана Фэннинга за ценные обсуждения проницаемости плотных соединений по размеру и методов их разрушения. Мы также благодарим доктора Майкла Чуа и доктора Нила Крамарси из Центра микроскопии Майкла Хукера за поддержку при использовании конфокального микроскопа. Данная работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения T32 DK007737-15 (стажер J.L.C.), F32 DK094592 (J.L.C.) и R01 DK081426 (J.F.R.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Финкель (трикаинметансульфонат)Argent Chemical LaboratoriesMS-222Анестезия личинок
Раствор фенолового красногоSigma-AldrichP0290-100 ml0.5% в DPBS, протестированный на культурах клеток
Минеральное масло, светлое, белое (высокой чистоты)AmrescoJ217-500 mlДля заполнения игл и проверки объема
TxRed-Декстран, 10 000 ММ, фиксируемый по лизинуInvitrogen/ Molecular ProbesD-18631% суспензия в 1x PBS/феноловый красный
FM4-64FXInvitrogen/ Molecular ProbesF34653Стоковый раствор 5 mM в воде
МетилцеллюлозаMP Biochemicals0215549590
Боросиликатные стеклянные капиллярыDrummond Scientific3-000-203-G/XНар. Ø 1.14 mm, внутр. Ø 0.53 mm, длина 3.5 in
Пластиковая форма для изготовления молдовAdaptive Science ToolsTU-1
Установка для микроинъекций Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
Вытяжка для микропипеток Flaming Brown, нить с желобом шириной 3.0 mmSutter Instrument Co.P-97, FT330BИзготовление игл
Студенческий пинцет Dumont #5Fine Science Tools91150-200.1 x 0.06 mm, обрезка игл
Окулярная сетка, 5 mm — 100 деленийLeica10394771Обрезка игл
Микрокузница (Microforge)NarishigeMF-900Обрезка и огневая полировка игл
Игла шприца Tuberculin SlipTipBecton Dickinson3096261 ml, игла 25G 5/8
Флуоресцентные микросферы Fluoresbrite YG (2.0 μm)Polysciences, Inc.18338Анализ моторики кишечника
Диссекционный микроскопLeicaS6EПроцедура зондирования (гаваж)
Флуоресцентный стереомикроскопLeicaM205CАнализ барьерной функции декстрана
Конфокальный микроскопZeissLSM510Визуализация декстрана в кровотоке

Ссылки

  1. Kuhlman, J., Eisen, J. S. Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system. Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).
  2. Pack, M., et al. Mutations affecting development of zebrafish digestive organs. Development. 123, 321-328 (1996).
  3. Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Dev. Biol. 255, 12-29 (2003).
  4. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mech. Dev. 122, 157-173 (2005).
  5. Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Dev. Biol. 286, 114-135 (2005).
  6. Hama, K., et al. In vivo imaging of zebrafish digestive organ function using multiple quenched fluorescent reporters. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 445-453 (2009).
  7. Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev. Biol. 360, 276-285 (2011).
  8. Rich, A. A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the zebrafish. Neurogastroenterol Motil. 21, 225-228 (2009).
  9. Bagnat, M., Cheung, I. D., Mostov, K. E., Stainier, D. Y. Genetic control of single lumen formation in the zebrafish gut. Nat. Cell Biol. 9, 954-960 (2007).
  10. Bagnat, M., et al. Cse1l is a negative regulator of CFTR-dependent fluid secretion. Curr. Biol. 20, 1840-1845 (2010).
  11. Shepherd, I., Eisen, J. Development of the zebrafish enteric nervous system. Methods Cell Biol. 101, 143-160 (2011).
  12. Brugman, S., et al. Oxazolone-induced enterocolitis in zebrafish depends on the composition of the intestinal microbiota. Gastroenterology. 137, 1757-1767 (2009).
  13. Oehlers, S. H., et al. The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish. Dis. Model Mech. 4, 832-841 (2011).
  14. Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240, 288-298 (2011).
  15. Faro, A., Boj, S. F., Clevers, H. Fishing for intestinal cancer models: unraveling gastrointestinal homeostasis and tumorigenesis in zebrafish. Zebrafish. 6, 361-376 (2009).
  16. Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: a feasibility study. Inflamm. Bowel Dis. 16, 1162-1172 (2010).
  17. Kanther, M., et al. Microbial colonization induces dynamic temporal and spatial patterns of NF-kappaB activation in the zebrafish digestive tract. Gastroenterology. , (2011).
  18. Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4596-4601 (2004).
  19. Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Goodman, A. L., Trent, C. M., Gordon, J. I. In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7622-7627 (2007).
  20. Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
  21. Bates, J. M., et al. Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation. Dev. Biol. 297, 374-386 (2006).
  22. Cheesman, S. E., Guillemin, K. We know you are in there: conversing with the indigenous gut microbiota. Res Microbiol. 158, 2-9 (2007).
  23. Bates, J. M., Akerlund, J., Mittge, E., Guillemin, K. Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota. Cell Host Microbe. 2, 371-382 (2007).
  24. Camp, J. G., Jazwa, A. L., Trent, C. M., Rawls, J. F. Intronic cis-regulatory modules mediate tissue-specific and microbial control of angptl4/fiaf transcription. PLoS Genetics. , In Press (2012).
  25. Cheesman, S. E., Neal, J. T., Mittge, E., Seredick, B. M., Guillemin, K. Epithelial cell proliferation in the developing zebrafish intestine is regulated by the Wnt pathway and microbial signaling via Myd88. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4570-4577 (2011).
  26. Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterol. Motil. 21, 304-312 (2009).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 4 edn, University of Oregon Press. (2000).
  28. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nat. Protoc. 3, 1862-1875 (2008).
  29. Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. Tight junction pore and leak pathways: a dynamic duo. Annu. Rev. Physiol. 73, 283-309 (2011).
  30. Van Itallie, C. M., et al. The density of small tight junction pores varies among cell types and is increased by expression of claudin-2. J. Cell. Sci. 121, 298-305 (2008).
  31. Van Itallie, C. M., Anderson, J. M. Measuring size-dependent permeability of the tight junction using PEG profiling. Methods Mol. Biol. 762, 1-11 (2011).
  32. Watson, C. J., Rowland, M., Warhurst, G. Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, 388-397 (2001).
  33. Rodgers, L. S., Fanning, A. S. Regulation of epithelial permeability by the actin cytoskeleton. Cytoskeleton (Hoboken). 68, 653-660 (2011).
  34. Gonzalez-Mariscal, L., Chavez de Ramirez, B., Cereijido, M. Tight junction formation in cultured epithelial cells (MDCK). J. Membr. Biol. 86, 113-125 (1985).
  35. Palant, C. E., Duffey, M. E., Mookerjee, B. K., Ho, S., Bentzel, C. J. Ca2+ regulation of tight-junction permeability and structure in Necturus gallbladder. Am. J. Physiol. 245, C203-C212 (1983).
  36. Holmberg, A., Schwerte, T., Pelster, B., Holmgren, S. Ontogeny of the gut motility control system in zebrafish Danio rerio embryos and larvae. J. Exp. Biol. 207, 4085-4094 (2004).
  37. Rich, A., et al. Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative. 236, 903-911 (2007).
  38. Holmberg, A., Olsson, C., Hennig, G. W. TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae. J. Exp. Biol. 210, 1084-1091 (2007).
  39. Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps. J. Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).
  40. Flynn, E. J. 3rd, Trent, C. M., Rawls, J. F. Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio. J. Lipid Res. 50, 1641-1652 (2009).
  41. Clifton, J. D., et al. Identification of novel inhibitors of dietary lipid absorption using zebrafish. PLoS One. 5, e12386(2010).
  42. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  43. Berghmans, S., Hunt, J., Roach, A., Goldsmith, P. Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants. Epilepsy Res. 75, 18-28 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Microgavage из личинки данио рерио
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.