Microgavage из личинки данио рерио

Краткое содержание

Мы представляем новый метод микрогаважа личинок zebrafish с использованием стандартного оборудования для микроинъекций эмбрионов и стереомикроскопии. Мы демонстрируем, что микрогаваж является безопасным и эффективным методом, подходящим для доставки контролируемого количества различных материалов непосредственно в просвет кишечника личинок zebrafish.

Аннотация

Рыбка-зебра стала мощным модельным организмом для изучения развития кишечника^1-5, физиологии^6-11, заболеваний^12-16 и взаимодействий между хозяином и микробами^17-25. Экспериментальные подходы к изучению биологии кишечника часто требуют введения выбранных материалов в просвет кишечника in vivo. В модели личинок рыбки-зебры это обычно осуществляется путем погружения рыб в раствор выбранного вещества или путем инъекции через брюшную стенку. При использовании метода погружения трудно точно контролировать или отслеживать путь или время доставки материала в кишечник. По этой причине воздействие при погружении может вызвать непреднамеренную токсичность и другие эффекты в тканях вне кишечника, что ограничивает потенциальный диапазон количеств материала, которые могут быть доставлены в кишечник. Кроме того, количество материала, поглощаемого при погружении, может значительно варьироваться между отдельными личинками²⁶. Хотя эти проблемы не возникают при прямой инъекции через брюшную стенку, правильное проведение инъекции затруднительно и вызывает повреждение тканей, что может повлиять на результаты эксперимента. Мы представляем метод микрозондажа (микрогаважа) личинок рыбки-зебры. Целью этого метода является обеспечение безопасного, эффективного и стабильного способа доставки материала непосредственно в просвет переднего отдела кишечника личинок рыбки-зебры с контролируемым временем введения. Микрозондаж использует стандартное оборудование для микроинъекций эмбрионов и стереомикроскопию, имеющиеся в большинстве лабораторий, занимающихся исследованиями рыбок-зебра. После того как рыбки правильно зафиксированы в метилцеллюлозе, зондирование может быть выполнено быстро, со скоростью примерно 7-10 рыб/мин, а выживаемость после процедуры приближается к 100% в зависимости от вводимого материала. Мы также показываем, что микрозондаж позволяет заполнять просвет кишечника высокими концентрациями веществ, которые летальны для рыб при воздействии методом погружения. Чтобы продемонстрировать полезность этого метода, мы представляем анализ микрозондажа с использованием флуоресцентного декстрана, который может быть использован для количественного определения переноса из просвета кишечника в экстракишечные пространства. Этот тест может быть использован для проверки правильности выполнения процедуры микрозондажа, а также представляет собой новый анализ на рыбках-зебра для изучения целостности кишечного эпителиального барьера при различных экспериментальных условиях (например, генетические манипуляции, лекарственная терапия или воздействие факторов окружающей среды). Кроме того, мы показываем, как зондирование может быть использовано для оценки моторики кишечника путем введения флуоресцентных микросфер и последующего мониторинга их перемещения. Микрозондаж может быть применен для доставки различных материалов, таких как живые микроорганизмы, секретируемые микробные факторы/токсины, фармакологические агенты и физиологические зонды. Благодаря этим возможностям метод микрозондажа личинок рыбки-зебры обладает потенциалом для расширения широкого спектра областей исследований с использованием модельной системы рыбки-зебры.

Протокол

Для получения личинок для микрогаважа мы используем опубликованные протоколы стандартного содержания и ухода за зебрафиш²⁷. Для разведения рыб мы преимущественно используем естественный метод; рыбы содержатся при световом режиме 14 ч свет/10 ч темнота. Данный протокол оптимизирован для микрогаважа личинок зебрафиш на 6–7 день после оплодотворения (dpf). Мы полагаем, что эти методы будут в целом применимы к более ранним и более поздним стадиям развития при внесении незначительных модификаций. Если не указано иное, мы использовали штамм зебрафиш TL дикого типа на стадии 6 dpf, рыбы не подвергались кормлению. Все эксперименты проводились в системной воде, полу....

Результаты

При правильном проведении зондирования вводимый материал должен полностью находиться в переднем отделе кишечника, при этом в пищеводе должно остаться минимум материала или его не должно быть вовсе (Рисунок 3). Следует выбрать такой объем введения, который может быть вмещен в переднюю луковицу и не будет вытекать через клоаку или пищевод. Если объем материала или давление при введении будут слишком высокими, физическое воздействие при зондировании может привести к повреждению эпителия или протеканию через.......

Обсуждение

В данной работе мы описываем новый протокол прямой доставки веществ в кишечник личинок zebrafish методом микрозондирования. В ходе процедуры существует несколько критических этапов, которые необходимо учитывать. Во-первых, личинки zebrafish должны быть здоровы перед проведением зондирования, чтобы исключить гибель особей по причинам, не связанным с воздействием. Другим важным фактором является качество иглы для зондирования. Одним из наиболее сложных этапов протокола является обрезка иглы в нужном месте без образования о.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Финкель (трикаинметансульфонат)	Argent Chemical Laboratories	MS-222	Анестезия личинок
Раствор фенолового красного	Sigma-Aldrich	P0290-100 ml	0.5% в DPBS, протестированный на культурах клеток
Минеральное масло, светлое, белое (высокой чистоты)	Amresco	J217-500 ml	Для заполнения игл и проверки объема
TxRed-Декстран, 10 000 ММ, фиксируемый по лизину	Invitrogen/ Molecular Probes	D-1863	1% суспензия в 1x PBS/феноловый красный
FM4-64FX	Invitrogen/ Molecular Probes	F34653	Стоковый раствор 5 mM в воде
Метилцеллюлоза	MP Biochemicals	0215549590
Боросиликатные стеклянные капилляры	Drummond Scientific	3-000-203-G/X	Нар. Ø 1.14 mm, внутр. Ø 0.53 mm, длина 3.5 in
Пластиковая форма для изготовления молдов	Adaptive Science Tools	TU-1
Установка для микроинъекций Nanoject II	Drummond Scientific	3-000-204
Вытяжка для микропипеток Flaming Brown, нить с желобом шириной 3.0 mm	Sutter Instrument Co.	P-97, FT330B	Изготовление игл
Студенческий пинцет Dumont #5	Fine Science Tools	91150-20	0.1 x 0.06 mm, обрезка игл
Окулярная сетка, 5 mm — 100 делений	Leica	10394771	Обрезка игл
Микрокузница (Microforge)	Narishige	MF-900	Обрезка и огневая полировка игл
Игла шприца Tuberculin SlipTip	Becton Dickinson	309626	1 ml, игла 25G 5/8
Флуоресцентные микросферы Fluoresbrite YG (2.0 μm)	Polysciences, Inc.	18338	Анализ моторики кишечника
Диссекционный микроскоп	Leica	S6E	Процедура зондирования (гаваж)
Флуоресцентный стереомикроскоп	Leica	M205C	Анализ барьерной функции декстрана
Конфокальный микроскоп	Zeiss	LSM510	Визуализация декстрана в кровотоке