Интраназального введения ЦНС терапии, чтобы Awake Мыши

Leah R. Hanson; Jared M. Fine; Aleta L. Svitak; Katherine A. Faltesek

doi:10.3791/4440

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Интраназального введения ЦНС терапии, чтобы Awake Мыши

61.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/4440

⸱

8 апреля 2013 г.

Leah R. Hanson¹ , Jared M. Fine¹ , Aleta L. Svitak¹ , Katherine A. Faltesek¹

¹Alzheimer’s Research Center at Region’s Hospital, HealthPartners Institute for Education and Research

В этой статье

Краткое содержание

Метод управления препаратов интраназально пробудить мышей с целью ориентации мозга описаны. Этот метод позволяет для повторного дозирования в течение длительного периода использования интраназального введения препарата без анестезии, и нос к мозгу доставки с минимальными системными экспозиции.

Аннотация

Интраназальная администрация способ доставки терапевтических агентов в центральной нервной системе (ЦНС). Это является неинвазивным и позволяет большие молекулы, которые не пересекают гематоэнцефалический барьер доступа к ЦНС. Наркотики, непосредственно ориентированных на ЦНС с интраназальной доставки, снижение системного воздействия и, следовательно, нежелательные системные побочные эффекты ^1. Доставка от носа к центральной нервной системе происходит в течение нескольких минут по обеим обонятельного и тройничного нервных путей с помощью внеклеточных маршрут и не требует наркотиков привязать к любому рецептору или аксонального транспорта ^2. Интраназальной доставки широкое распространение метод и в настоящее время используется в клинические испытания на человеке ^3.

Интраназальной доставки лекарств на животных моделях, позволяет первоначальной оценки фармакокинетических распределения и эффективности. С мышами, можно вводить препараты для бодрствования (без наркоза) животных на регулярной основе, используя специальказывают интраназальной захватом. Awake доставки выгодна, поскольку она позволяет долгосрочных хронических дозирования без анестезии, это занимает меньше времени, чем при анестезии, и может быть изучено и сделано много людей, так что команды техников могут доза большого количества мышей в короткие сроки. Эффективность терапии вводят интраназально таким образом, чтобы мышах было показано в ряде исследований, в том числе инсулина у больных сахарным диабетом моделей мышей ^4-6 и дефероксамин в моделях болезни Альцгеймера мыши. ^7,8

Интраназального ручка для мышей можно научиться, но это не легко и требует практики, мастерство и точный захват для эффективного предоставления наркотиков на мозг и избежать дренаж в легких и желудка. Мыши сдерживается вручную с помощью модифицированного шкирку в не доминантной рукой с шеи проведена параллельно полу, а наркотики поставляются с использованием пипетки доминирующей рукой. Обычно это занимает 3-4 недели акклиматизации к обработке до мышеймогут быть проведены с этой рукояткой без стресса. Мы подготовили эту Юпитера видео, чтобы сделать эту технику интраназального доставки более доступными.

Протокол

1. Акклиматизация к обработке для интраназального дозирования Awake Мыши

Введение

Мышь должна приспособиться к обработке в течение двух-четырех недель до наступления интраназального введения. Акклиматизация к обработке важна, так как она помогает обеспечить правильное положение тела для максимальной эффективности проснулся интраназальной доставки лекарственных средств. Кроме того, мыши, которые не были должным образом привыкли к этому процессу может иметь тяжелые реакции тревоги после приема препарата. Мышь должна потратить около 2-3 дней по каждому из девяти шагов перед переходом к следующему шагу, в зависимости от комфорта животных к обработке. Уровень стресса мышь должна быть использована в качестве меры прогресса. Это означает, контроля за движением мыши, количество / частота мочеиспускания, дефекации, дрожа, и кусать. Если мышь имеет высокую реакцию на стресс, пребывание на этот шаг, прежде чем переходить к следующему, пока ответа снижается. Образец акклиматизации SCHedule можно увидеть в таблице 1. Акклиматизация мышей должна развиваться на основе следующих один раз в день шаги. Выполнение этих шагов более чем один раз в день, в попытке ускорить акклиматизацию, не рекомендуется.

Поместите мышь в ладони в течение двух-трех минут, не более одной ногой над клетку сверху, как животные часто прыгают во время этой вступительной шаг. Если мышь пытается выбраться из руки и до своей рукой, просто поднять мышь основания хвоста и поместить его обратно в руке.
Поместите мышь в ладони в течение трех минут и погладить животное мягко. Животные мыши направленно от головы до хвоста, позволяя животному свободно передвигаться.
Поместите мышь в ладони в течение трех минут, а массаж за ушами (слегка зажимая вместе кожу на шее, используя большой палец и указательный палец).
Удерживайте / LiFT мышью за шкирку его шею на 30 сек, позволяя остальным мыши на клетке верхней течение 30 секунд, прежде чем повторять трюме снова.
Наведите использованием интраназального власть, которая описана в разделе 2, но не инвертировать животных (полный шаги до 2,4). Держите животное, как это в течение 30 секунд и отпустить обратно в клетку сверху. Повторить второй раз после одной минуты отдыха.
Держите мышь с интраназального сцепления, как описано в разделе 2, в том числе обращения животное так его вентральной стороной вверх к потолку. Убедитесь, что шея животного параллельно полу. Задержитесь в этом положении на 30 секунд. Повторите это второй раз после одной минуты отдыха. Некоторые мыши будет сопротивляться интраназального сцепление больше, чем другие, особенно при использовании в первый раз с инверсией на этот шаг в акклиматизации. Если мышь освобождает себя от власти, положить мышь обратно на верхнюю клетку и повторного захвата. Повторите повторного захвата, если это необходимо, Но контролировать уровень стресса мыши и вернуть его в клетку, если это необходимо. Другой фактор, который может сыграть свою роль в потере сцепления на данный момент в процессе акклиматизации неопытность животных обработчики с интраназального технику доставки.
Держите мышь с интраназального сцепление, инвертирование, кратко разместить пипетки с пустой опрокинуться каждую ноздрю, и удерживать животных положении в течение 30 сек. Повторите это после одной минуты отдыха.
Держите мышь с интраназального сцепление, перевернуть его, и интраназально управлять 6 мкл физиологического раствора в левой и правой наре, как описано в разделе 3 (через шаг 3,7).
Держите мышь с интраназального сцепление, инвертировать его, и интраназально управлять 6 мкл физиологического раствора в левой и правой наре в два раза размещения животное обратно на клетку верхнего между ними, как описано в разделе 3.

2. Интраназальная ручка для иммобилизации Awake Мыши

Наведите оп клетку сверху.
С большим и указательным пальцами вашей доминирующей рукой, держа мышь за хвост. Использование среднего, кольца, пальцы и мизинец, слегка прикрепить нижнюю часть тела к верхней клетки (рис. 1А). Пусть мышь хвататься за решеткой, как вы слегка растянуть мышью, и лучше захватить за шкирку.
С помощью большого и среднего пальцев на не доминантной рукой, зажать мышь твердо на загривок (избыток кожи) за шею и плечи. Потяните вверх на дряблую кожу, чтобы сделать палатку кожи на лопатках (рис. 1б). Принять, как много кожи насколько возможно, но будьте осторожны, чтобы не потянуть мышцы так как это вызовет неудобства для мыши. Соблюдайте осторожность, чтобы не применять слишком большое давление на грудную клетку животного или позвоночника. Избыточное давление или натяжение кожи может привести к угнетению дыхания в некоторых случаях.
Быстро поместите указательный палец не доминантной рукой на голову мыши, какблизко к носу, как можно и отступить на кожу (рис. 1C, 1D). В то же время, сдвиньте большой и средний пальцы к голове для оптимального положения. В идеале, мышь не должна быть в состоянии двигать головой вертикально или горизонтально.
Сохраняя контроль над шкирку, включите мышь на спину. Вернуться мышь должна быть в ладони вашей руки. Крепко держите хвост мыши (у основания) против вашей ладони с вашего последнего двумя пальцами (кольца и мизинец), чтобы стабилизировать мыши, или вы можете обернуть пальцы по нижней части тела (рис. 1E, 1F).
На данный момент убедиться, что шея мыши и подбородок являются плоскими и параллельными полу. Подбородок должен быть близок к 180 градусов, угол с шеей как можно больше, чтобы помочь с интраназальной доставки. Небольшие изменения угла может вызвать препарат в конечном итоге не в том месте. Убедитесь, что мышь способна дышать, наблюдая за живот. Шо мышиULD не сможет двигаться, но должна быть удобной и не в любую боль. Если вы видите шее мыши и подбородок делает "V", то вам необходимо повторно сцепление.

3. Интраназальной доставки наркотиков в Awake Мыши

Введение

Использование интраназального сцепление, каждая мышь сдерживается в два раза и провел с их шеи параллельно полу, в то время как объем 20-30 мкл жидкости вводят. Этот объем является безопасным и эффективным для малого и большого мышей, мы обычно используют 24 мкл, и что описано в этом протоколе. Проснулся интраназального метод может быть использован в мыши в любом возрасте, например, у новорожденных мышей для исследований развития нейронауки. У новорожденных мышей, меньше общего объема (8 мкл) и размер капель (1 мкл) должны быть использованы для размещения меньшего объема полости носа. Наркотиков, как правило, поставляются с двумя мышами в то время, чередуя периоды отдыха, чтобы максимально эффективно использовать время и сохранить оп графику. Настройка будет немного отличаться в зависимости от того, если вы дозирования группы расположены мышами или индивидуально размещены мышей. С индивидуально размещены мышах, было бы полезно разместить все ваши материалы в между клетками, чтобы предотвратить мышей от перехода на другую верхнюю клетку. С группой размещены мышей, дозы, что только клетки. Важно, что каждая мышь в группу размещены клетки получают одинаковые интраназального лечения, так как потенциал для перекрестного загрязнения из двух различных методов лечения существует из-за наркотиков изгнания в воздух или контакт с кожей. Настоятельно рекомендуется дозирование листа печатаются заранее, чтобы напомнить техниками лечения задания, чтобы записать любые заметки о пропущенных капли, отметить общее состояние здоровья каждого животного, и т.д.

Шаги

Установить клетках, где они должны быть для дозирования, а также создать станция дозирования (рис. 2).
Удалить мыши из клетки и держать на верхней клетке во время дозирования.
Возьмите мыши с помощью интраназального сцепление описано в разделе 2.
Использование доминирующей рукой, загрузить пипетка с 6 мкл наркотиков или автомобилей. Поместите кончик пипетки заполнены около левой ноздри мыши, как правило, под углом 45 градусов (рис. 1G, 1H). Если у вас есть вязкий раствор вам может понадобиться увеличить угол до 90 градусов, потому что препарат может достигать стороны пипетки вместо того, чтобы капли. Если очень вязкой, вытирая пипетки с тканью до изгнания жидкости может помочь. Медленно извлечь наркотики, чтобы сформировать небольшую каплю около половины объема (3 мкл).
Капли должны быть размещены достаточно близко к ноздре мыши так, что мышь может вдохнуть капли. Сразу же после мышью вдыхает эту маленькую каплю, извлеките остальные лекарства в пипетку, чтобы сформировать еще один небольшой каплей для мыши вдохнуть через ту же ноздрю 2-3 секунд позже. Будьте уверены, чтобы смотреть в рот. Если яс любой жидкостью в полости рта, падение не сделать его полностью в нос, и это должно быть отмечено.
Держите мышь в этом положении на 15 секунд. Настоятельно рекомендуется использовать таймер, чтобы стандартизировать эти 15 секунд удержания.
Повторите шаги 3,3 - 3,6 для правой ноздре. Если капли из фыркнул, что падение должно быть заменено и отметил.
Наведите снова на вершине своей клетке в течение 2 мин. Повторите весь процесс, начиная 2 мин. После поставки первой капли. Это дает мышью четыре капли 6 мкл каждая на общую сумму 24 мкл раствора. Пример графика для дозирования одного или двух мышей сразу можно увидеть в таблице 2.
После того, как мышь получила все капли, вернуть мышь в клетку.

4. Генеральный животных Обработка методы для акклиматизации и интраназальной доставки наркотиков в Awake Мыши

После каждого акклиматизации или интраназального сессии дозирования, мыши должны быть датьН.А. лечения, такие как Cheerio или очищенных семян подсолнечника в качестве положительного подкрепления. Лечит даются как награда и отвлечь их от царапин носы, возможно причинение вреда самим себе. При работе с группой размещены мышей, достаточно удовольствия должны быть исключены для каждой мыши. Перед возвращением животных в их клетки убедитесь, что восстановление гнезд к их первоначальному состоянию, чтобы уменьшить стресс. При дозировании группы размещаются животные, перчатки должны быть изменены между дозирующим клеток так, чтобы не переносить запах от клетки к клетке колонии колонии, так как они становятся агрессивными по отношению друг к другу.