Серийный обогащению сперматогониальные стволовых и клеток-предшественников (SSC) в культуре Вывод Долгосрочные взрослых мышей линии Юг-Юг

Laura A. Martin; Marco Seandel

doi:10.3791/50017

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Серийный обогащению сперматогониальные стволовых и клеток-предшественников (SSC) в культуре Вывод Долгосрочные взрослых мышей линии Юг-Юг

13.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50017

⸱

25 февраля 2013 г.

Laura A. Martin¹ , Marco Seandel¹

¹Department of Surgery, Weill Cornell Medical College

В этой статье

Краткое содержание

Простой метод для получения и поддержания сперматогониальные ствола и линии клеток-предшественников из взрослых мышей представлена здесь. Метод использует фидерных клеток, происходящих из отсека соматической клетки взрослой семенников мышей. Этот метод применим к общим линий мышей, в том числе трансгенных, нокаут, и забивные мышей.

Аннотация

Сперматогониальные стволовые клетки и клетки-предшественники (SSCs) яичка представляют собой классический пример взрослых стволовых клеток млекопитающих и сохраняют фертильность почти на протяжении всей жизни животного. В то время как точные механизмы, которые управляют самообновлением и дифференцировкой in vivo, представляют собой сложную задачу для изучения, ранее были разработаны различные системы для размножения мышиных SSC in vitro с использованием комбинации специализированных питательных сред и фидерных клеток^1-3.

Большинство попыток in vitro в биологию SSC были получены от новорожденных, возможно, из-за трудностей с получением взрослых клеточных линий⁴. Тем не менее, яичко продолжает созревать до ~5-недельного возраста у большинства линий мышей. В раннем постнатальном периоде происходят драматические изменения в архитектуре яичек и в биологии как соматических, так и сперматогенных клеток, включая изменения в уровнях экспрессии многочисленных генов, связанных со стволовыми клетками. Таким образом, неонатальные линии SSC могут не полностью повторять биологию взрослых SSC, которые сохраняются после того, как взрослые яички достигли устойчивого состояния.

Несколько факторов исторически препятствовали производству взрослых линий SSC. Во-первых, доля функциональных стволовых клеток может уменьшаться во взрослом возрасте либо из-за внутренних, либо из-за внешних факторов^5,6. Кроме того, как и в случае с другими взрослыми стволовыми клетками, было трудно в достаточной степени обогатить ССК из общего количества клеток яичек взрослого человека без использования комбинации иммуноселекции или^{других стратегий сортировки}. Обычно используемые стратегии включают использование мышей-крипторхистов в качестве источника донорских клеток из-за более высокого соотношения стволовых клеток к другим типам клеток⁸. Основываясь на гипотезе о том, что удаление соматических клеток из исходной культуры нарушает взаимодействие со стволовыми клетками, которое имеет важное значение для выживания SSC, мы ранее разработали методы получения взрослых линий, которые не требуют иммуноселекции или крипторхических доноров, а скорее используют серийное обогащение SSC в культуре, именуемое здесь и далее SESC^2,3.

Описанный ниже метод включает в себя простую процедуру получения взрослых линий SSC путем диссоциации семенных канальцев взрослого донора с последующим осаждением клеток на фидерах, состоящих из линии стромальных клеток яичка (JK1)³. С помощью серийного пассирования сильно адгезивные, загрязняющие незародышевые клетки истощаются из культуры с сопутствующим обогащением ССК. Культуры, полученные таким образом, содержат смесь сперматогоний на разных стадиях дифференцировки, которые содержат ССК, основанные на способности к долгосрочному самообновлению. Суть метода SESC заключается в том, что он позволяет SSC совершить сложный переход от самообновления in vivo к долгосрочному самообновлению in vitro в радикально ином микроокружении, создает долгосрочные линии SSC, свободные от загрязняющих соматических клеток, и тем самым делает возможным последующее экспериментальное манипулирование SSC.

Протокол

1. Подготовка фидерных клеток

Отметим, что все реагенты, описанные ниже, должны быть подготовлены в стерильной одежды (см. таблицы 1 и 2). Этот протокол использует JK1 клеточной линии (Cell Biolabs, Inc каталог # CBA-315) в качестве питателей, которая является производной превращается взрослой мыши яичка соматических клеток и была описана в другом месте ^3. Отметим также, что все животные процедуры должны выполняться в соответствии с руководящими принципами институциональных и нормативных актов.

JK1 клетки могут поддерживаться в культуре и успешно используются в качестве питателей до прохождения 39. Культура JK1 клеток в клетки 100 мм культуры блюдо (BD Falcon, каталог # 353003) с 10 мл фильтр стерилизовать среднего роста подачи (DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки [FBS], 2 мМ L-глутамин и антибиотики). Когда культура достигает 95% слияние, разделение клеток 1:06 -1:10 отношение.
Удалить среды от сливной JK1 моно ячейки подачислоя.
Вымойте клеточный слой один раз PBS без кальция и магния.
Добавить подогретого трипсин / ЭДТА, 1x (0,05% trypsin/0.53 мМ EDTA; Corning Cellgro, каталог № 25-051-CI), и инкубировать при 37 ° С в течение 5-10 мин.
Деактивировать трипсина с равным объемом подачи среднего роста. Сбор клеток и центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин. Повторное приостановить клеток в питатель среднего роста.
Предварительное покрытие мульти-и клеточной культуры пластин, добавив достаточное 0,4% раствора желатина, чтобы покрыть также и удалить через 5 мин при комнатной температуре.
Плита ~ 250 клеток на мм ² в желатин покрытием пластин культуры клеток (например, 48-а и 6-а формат). Инкубируют культуры при 37 ° C в течение 16 до 24 часов.
Удалить культуральной среды из скважин. ВНИМАНИЕ: Для инактивации рост клеток, добавить свежий раствор митомицином-C в концентрации 10 мкг / мл разбавляют в DMEM в каждую лунку (например, 200 мкл / лунку для 48-луночный планшет). Митомицин-C является токсичным. Аккуратное использование и утилизация его с осторожностью. Инкубировать при37 ° C в течение 4 часов.
Удалить митомицином-C раствор из клетки. Промыть 3 раза с DMEM до клеток покрытие ствола.
Удалить DMEM от фидерных клеток скважин и добавить достаточно стволовых клеток средней (100 мкл / лунку в 48-луночный планшет, см. таблицу 3), чтобы предотвратить высыхание фидеров во время пассажей. Добавить КСЭ в тот же день, как описано ниже в разделах 3.1 или 3.4, используя указанный размер лунки, содержащие фидеров.

2. Диссоциация ткани яичка мыши, чтобы получить донорских половых клеток

Урожай семенников взрослых мышей в стерильных моды и временного хранения семенников в закрытом чашке Петри (без жидкости добавлен). Блюдо должно располагаться непосредственно на льду для предотвращения высыхания и поддержания жизнеспособности клеток.
Использование стерильного пинцета штраф и штраф ножницами в капот культуре клеток, сделать поперечный надрез на белочной оболочки, не полностью, пересекающих яичка (например, сокращение ~ ½ - ¾ расстояние Четух) и используйте щипцы, чтобы выжать из семенных канальцев в угол пластины, оболочки выбросить и придает ткани. Храните пластины на льду в течение держать ткань охлажденная, тем самым сохраняя его целостность и предотвращения испарения.
Быстро пропустить через мясорубку с мелкой канальцев ножницы весны по крайней мере 3 мин в яичках, сохраняя при этом пластину на льду.
Сбор трубочку фрагментов в 50 мл коническую трубку и мыть в ~ 40 мл охлажденной PBS / 1% бычьего сывороточного альбумина.
Центрифуга на 60 мкг в течение 10 мин, чтобы отделить трубочку фрагменты из сперматозоидов и мусора. Удалите супернатант.
В 15 мл коническую трубку, ресуспендируют осадок в 3 мл на яичко предварительно нагретого диссоциации буфером (DMEM, 0,05% трипсина, 0,03% коллагеназы типа I, 80 U / мл ДНКазы I и 0,5% бычьего сывороточного альбумина, см. таблицу 2 для более конкретных деталей диссоциации буфера).
Установите коническую трубку горизонтально в стойку в шейкере до 150 мин при 37 ° С в течение 15 мин, чтобы максимизироватьgitation.
Спином вниз на уровне 60 мкг в течение 10 мин для разделения одной клетки от недиссоциированной куски.
Сохранить осадок, содержащий куски до следующего шага. Сбор супернатант с шага 2,8 и добавляют 3 мл DMEM/10% эмбриональной телячьей сыворотки, чтобы нейтрализовать диссоциации буфера. Поместите пробирку на льду временно.
Повторите шаг от 2,6 до 2,7 с сохраненными гранул, начиная с шага 2,9 до повторного дайджест куски оставшиеся после шага 2.8.
Добавить равный объем DMEM/10% FBS, чтобы нейтрализовать диссоциации буфера.
Рекомбинируют отстранение от шага 2,11 с сохраненной клеточной суспензии с шагом 2,9. Центрифуга течение 5 мин при 300 х г.
Ресуспендируют гранул в области стволовых клеток среды в объеме 16 мл на пару яичек (см. таблицу 3).

3. Покрытие из яичек клеточной суспензии

Plate 2 мл клеточной суспензии на лунку в 6-луночный планшет, содержащий клетки подачи митотически инактивированные митомицином-C и место в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 &град, С в 5% СО _2.
После 48 часов, аспират среды, добавляют 2 мл свежей среды и вернуться в инкубаторе.
После 48 часов, добавляют 0,5 мл свежей среды стволовых клеток в каждую лунку и вернуться в инкубаторе.
После 48 часов, затем кормить клетки три раза в неделю после этого, как следует, пока большая, сдержанный колоний (> 50 клеток) появляются (в пределах от 7 до 21 дней). Для первой и второй кормления каждую неделю (например, понедельник и среда) удалить ~ 50% от среднего и добавить туда 50% по объему свежей среды. Для Третью подкормку (например, пятницу), аспирации всех средних и заменить 2 мл свежей среды. Этот подход основан на обоснование, что отказ от полного среднего изменения минимизирует колебания в концентрации паракринной сигналов, которые выделяются в культуральной среде ^9.

4. Колония для комплектования первого прохода

Удалить среды от лунки, содержащие колонии для пассировать и добавить свежую среду стволовых клеток.
Определить колонии использовании 10x цели. С микроскопом немного де-ориентированной, SSC колонии на краю также будет выглядеть как однородная яркие сгустки, состоящие из многих 11-12 мкм в диаметре клетки, в которых трудно или невозможно различить отдельные границы ячейки, так как клетки появляются сливаются (рис. 1А). Non-SSC колонии могут появиться темные, более детальный, или менее однородным, с заметной границы (рис. 1А, вставка).
С помощью 200 мкл кончика пипетки, с pipetteman набор до 50 мкл, в первую занимают средние из колодца и высылать к влажному чаевых. Затем, мягко подтолкнуть колонии с кончика до быстрого снятия 50 мкл среднего выбить колонии путем всасывания в наконечник (рис. 1б).
Выгнать среду, содержащую колонии в одну лунку 48-луночных планшет, содержащий инактивированные клетки питатель с 100 мкл стволовых клеток среде (рис. 1С).
Повторите шаг4,3 и добавить до 8 колоний к тому же и без превышающей 500 мкл на лунку.
Повторите шаги с 4,3 до 4,5 для получения дополнительных скважин из 48-луночный планшет с прохождением один колонии SSC.
Wells будут готовы разделить на 7-14 дней или после большого скопления до 500 клеток появились (рис. 1D).

5. Последующее расширение и Пассирование КСЭ растиранием

Клетки при прохождении нужно быть субкультивируют на свежие фидеров после до 14 дней при расколе соотношении 1:2 в течение первых 3 проходов, а затем 1:4 до 1:6 (каждые 7 дней) после этого следующим образом. Аккуратно растереть колонии с полу-сливной ямы (например, ~ 300,000 КСЭ / лунку 6-луночный планшет) с 1 мл пипетки промывкой средних по ячейкам. Колонии можно увидеть отсоединения. Слишком много сил с потоком жидкости может вызвать нежелательные клетки подачи оторваться тоже.
Сбор растертых клеток в конической трубе и центрифуги при 300 х г в течение5 мин. Примечание: трипсинизации шаг может быть безопасно добавить, по желанию исследователя.
Супернатант и вновь приостановить в свежую среду стволовых клеток тщательным пипетки вверх и вниз, чтобы сорвать колонии.
Плита КСЭ на свежеприготовленных фидерных клеток инактивированные митомицином-C, как описано в разделе 1.
Поток клетки три раза в неделю следующим образом. За первое и второе кормление (например, понедельник и среда) добавить 50% по объему свежей среды. Для Третью подкормку (например, пятницу), аспирации всех средних и заменить 2 мл свежей среды. Плиты станет вырожденной в 7-10 дней. Культура должна состоять из> 98% половых клеток (например, <1% загрязняющих соматических клеток) после 5-7 проходов, на основе иммунной (например, с помощью мышиной зародышевой клетки маркером GCNA), чтобы отличить половых клеток от соматических клеток ^10. Примечание: Эти методы были разработаны в соответствии с правилами и требованиями, установленными учреждениеАль уходу и использованию животных комитета на Weill Cornell Medical College.