Серийный обогащению сперматогониальные стволовых и клеток-предшественников (SSC) в культуре Вывод Долгосрочные взрослых мышей линии Юг-Юг

Краткое содержание

Простой метод для получения и поддержания сперматогониальные ствола и линии клеток-предшественников из взрослых мышей представлена ​​здесь. Метод использует фидерных клеток, происходящих из отсека соматической клетки взрослой семенников мышей. Этот метод применим к общим линий мышей, в том числе трансгенных, нокаут, и забивные мышей.

Аннотация

Сперматогониальные стволовые клетки и клетки-предшественники (SSCs) яичка представляют собой классический пример взрослых стволовых клеток млекопитающих и сохраняют фертильность почти на протяжении всей жизни животного. В то время как точные механизмы, которые управляют самообновлением и дифференцировкой in vivo, представляют собой сложную задачу для изучения, ранее были разработаны различные системы для размножения мышиных SSC in vitro с использованием комбинации специализированных питательных сред и фидерных клеток^1-3.

Большинство попыток in vitro в биологию SSC были получены от новорожденных, возможно, из-за трудностей с получением взрослых клеточных линий⁴. Тем не менее, яичко продолжает созревать до ~5-недельного возраста у большинства линий мышей. В раннем постнатальном периоде происходят драматические изменения в архитектуре яичек и в биологии как соматических, так и сперматогенных клеток, включая изменения в уровнях экспрессии многочисленных генов, связанных со стволовыми клетками. Таким образом, неонатальные линии SSC могут не полностью повторять биологию взрослых SSC, которые сохраняются после того, как взрослые яички достигли устойчивого состояния.

Несколько факторов исторически препятствовали производству взрослых линий SSC. Во-первых, доля функциональных стволовых клеток может уменьшаться во взрослом возрасте либо из-за внутренних, либо из-за внешних факторов^5,6. Кроме того, как и в случае с другими взрослыми стволовыми клетками, было трудно в достаточной степени обогатить ССК из общего количества клеток яичек взрослого человека без использования комбинации иммуноселекции или^{других стратегий сортировки}. Обычно используемые стратегии включают использование мышей-крипторхистов в качестве источника донорских клеток из-за более высокого соотношения стволовых клеток к другим типам клеток⁸. Основываясь на гипотезе о том, что удаление соматических клеток из исходной культуры нарушает взаимодействие со стволовыми клетками, которое имеет важное значение для выживания SSC, мы ранее разработали методы получения взрослых линий, которые не требуют иммуноселекции или крипторхических доноров, а скорее используют серийное обогащение SSC в культуре, именуемое здесь и далее SESC^2,3.

Описанный ниже метод включает в себя простую процедуру получения взрослых линий SSC путем диссоциации семенных канальцев взрослого донора с последующим осаждением клеток на фидерах, состоящих из линии стромальных клеток яичка (JK1)³. С помощью серийного пассирования сильно адгезивные, загрязняющие незародышевые клетки истощаются из культуры с сопутствующим обогащением ССК. Культуры, полученные таким образом, содержат смесь сперматогоний на разных стадиях дифференцировки, которые содержат ССК, основанные на способности к долгосрочному самообновлению. Суть метода SESC заключается в том, что он позволяет SSC совершить сложный переход от самообновления in vivo к долгосрочному самообновлению in vitro в радикально ином микроокружении, создает долгосрочные линии SSC, свободные от загрязняющих соматических клеток, и тем самым делает возможным последующее экспериментальное манипулирование SSC.

Протокол

1. Подготовка фидерных клеток

Отметим, что все реагенты, описанные ниже, должны быть подготовлены в стерильной одежды (см. таблицы 1 и 2). Этот протокол использует JK1 клеточной линии (Cell Biolabs, Inc каталог # CBA-315) в качестве питателей, которая является производной превращается взрослой мыши яичка соматических клеток и была описана в другом месте ^3. Отметим также, что все животные процедуры должны выполняться в соответствии с руководящими принципами институциональных и нормативных актов.

1. JK1 клетки могут поддерживаться в культуре и успешно используются в качестве питателей до ....

Результаты

Появление прохождения нуля дикого типа, взрослый SSC колонии через 7 дней показано на рисунке 1. Трехмерная колонии состоят из слоя плоских клеток, прикрепленных к фидеров или подчиненного внеклеточного матрикса, сданный на хранение фидеров с несколькими слоями КСЭ, растущий на вершине. В то время как здоровые КСЭ ярко и равномерно рефрактильных 11-12 мкм в диаметре, границы ячеек трудно отличить и размер колоний может быть весьма переменная, как внутри, так и между скважинами получают из различных мыше.......

Обсуждение

Этот способ для получения взрослого КСЭ использовании семенников взрослых клеток, полученных из питателя является надежной и удалось, когда общий генетический фон (например, FVB, C57BL6 и смешанных 129SV/C57Bl/6) и различные мутантные штаммы были заняты ^2,3,7,14. В самом деле, микросреда создан системе культуры достаточно, чтобы преодолеть некоторые генетические барьеры для поддержания взрослого КСЭ в естественных условиях (например, в случае PLZF ^{- / -} животных) ^7. В т.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название Реагенты / Материал	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
DMEM	Гранулирование	10-013	Разбавитель для диссоциации буфера
Трипсин / ЭДТА	Mediatech	25-051-ДИ
Стволовые клетки базе среднего (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Требуется добавок в соответствии с Shinohara и соавт. (2003) *
Стволовые клетки добавки среде	различный	см. таблицу 3	Требуется добавок в соответствии с Shinohara и соавт. (2003) *
JK1 клеток	Сотовые Biolabs, Inc	CBA-315	Можно заменить взрослых яичка стромальных клеток в соответствии с Seandel и соавт. (2007)
митомицином-C (ВНИМАНИЕ)	Sigma-Aldrich	M4287	Токсичные; Обращаться с осторожностью.
Желатин	Sigma-Aldrich	G1890	0,4% раствор в воде
EVOS х цифровых инвертированным микроскопом	Advanced Group микроскопии	-
			Таблица 1. Конкретные реагентов и оборудования. * См. таблицу 3
DMEM	Гранулирование	10-013	Разбавитель для диссоциации буфера
трипсина (1:250)	Life Technologies	27250-018	Диссоциация буфера: Final 0,05% вес / объем
коллагеназы, тип I, 235 U / мл	Worthington	CLS1 235	Диссоциация буфера: Final 0,03% вес / объем
ДНКазы	Сигм-Aldrich	DN25	Диссоциация буфера: Final 80 U / мл
бычьего сывороточного альбумина	ICP Bio	ABRE-100г	Диссоциация буфера: Final 0,5% вес / объем
			Таблица 2. Диссоциация буфер
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 Питательные добавки	Life Technologies	10639-011
Дополнительные добавки **
Номера для незаменимых аминокислот	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM Витамин решения	Life Technologies	11120-052	1X
L-глютамин	Mediatech	25-005	2 мМ
бычьего сывороточного альбумина	ICP Bio	ABRE	0,50%
Антибиотик-противогрибковым решение	Mediatech	30-004-ДИ	1X
D (+) глюкозы	Sigma-Aldrich	G8769	6 мг / мл
β-эстрадиола	Sigma-Aldrich	E2758	30 нг / мл
прогестерон	Calbiochem	5341	60 нг / мл
эмбриональной бычьей сывороткой	переменная	N / A	1%
бычьего голо-трансферрин	Sigma-Aldrich	T1283	100 мкг / мл
инсулин	Близнецы Bio-Products	700-112P	25 мкг / мл
GDNF человека	Жизнь Technologies	PHC7041	10 нг / мл
человека шФРФ	Life Technologies	PHG0023	10 нг / мл
мышь EGF	Life Technologies	PHG0313	20 нг / мл
путресцина	Исследования Organics	0778P	60 мкМ
селенит натрия	Sigma-Aldrich	S5261	30 нМ
пировиноградная кислота	Alfa Aesar	A13875	30 мкг / мл
DL-молочной кислоты	JT Baker	0196-04	1 мкг / мл
β-меркаптоэтанола	Life Technologies	21985-023	50 мкМ
аскорбиновая кислота	Sigma-Aldrich	A4544	100 мкМ
D-биотин	Sigma-Aldrich	B4639	10 мкг / мл
			Таблица 3. Стволовые клетки среде
			* Примечание: Добавить добавки ниже, прежде чем использовать среду. Фильтр стерилизовать и хранить его при температуре 4 ° C. Среда стабильна в течение по крайней мере 2 недели.
			** Мы использовали разные производители, формулировки, и / или номер лота этих реагентов без видимых вредных последствий. В общем, мобильный реагентов культуры классе должны быть использованы.