Количественная клубочковой проницаемости Флуоресцентные макромолекул Используя 2-фотонной микроскопии в Мюнхене крыс Wistar

Summary

Техника использования высокого разрешения intavital 2-фотонной микроскопии непосредственно визуализировать и количественно gloemrular поверхность фильтрации в клубочках. Этот метод позволяет прямое определение характеристик проницаемости макромолекул в нормальных и болезненные состояния.

Abstract

Почки заболеваниях, сопровождающихся потерей мочи необходимы большие макромолекулы, такие как сывороточный альбумин, долгое время считалось, вызваны изменениями в проницаемости барьера состоит из подоциты, сосудистых эндотелиальных клеток и базальной мембраны, работающих в унисон. Данные из нашей лаборатории с использованием прижизненной 2-фотонной микроскопии показало барьер более проницаемым клубочковой фильтрации (GFB), чем считалось ранее в физиологических условиях, с поиска фильтруются альбумина, происходящих в раннем подмножество клеток, называемых клетками проксимальных канальцев (PTC) ^{1,2, 3.}

Предыдущие методы, используемые для изучения почечной фильтрации и создание характеристику фильтрации барьера, связанного микропункции просвета этих первых трубчатых сегментов с отбором проб флюида содержание и анализ ^4. Эти исследования определяется концентрация альбумина в просвете жидкостью практически не существует; соответствующие теснона то, что обычно обнаруживаются в моче. Тем не менее, характеристики полимеров декстрана с определенными размерами по этой методике показали те, размеры которого аналогичны для сывороточного альбумина имели более высокие уровни в просвете канальцев и мочи; предлагая повышенную проницаемость ^5.

Здесь, представляет собой подробное описание техники, используемой непосредственно визуализировать и количественно клубочковой проницаемости люминесцентные альбумина в естественных условиях. Этот метод позволяет обнаруживать фильтрованной альбумина через фильтрационный барьер в пространство Боумена (начальное камеры мочевого фильтрации), а также позволяет количественно альбумина реабсорбции проксимальных канальцев и визуализации последующего альбумин трансцитоза ^6. Отсутствие флуоресцентный белок по позже трубчатых сегментов пути в мочевой пузырь подчеркивает эффективность поиска пути в ранее проксимальных сегментах канальцев. Кроме того, когда эта методика была применена для определения проницаемостидекстранов имеющие такого же размера, альбумина практически одинаковые значения проницаемости были зарегистрированы ^2. Эти наблюдения непосредственно поддерживают необходимость расширения в центре внимания многих протеинурической почечных заболеваний включены изменения в проксимальных канальцах клетки мелиорации.

Protocol

1. Сопряжение Крысы сывороточный альбумин сульфо-родамина 101 сульфонилхлорид (Texas Red)

1. Растворяют 100 мг крысы сывороточного альбумина (RSA) в 6,667 мл 100 мМ бикарбонат натрия рН 9,0; конечной концентрации 15 мг / мл в 50 мл коническую трубку.
2. Место решения в лед / вода стакан и охлаждают до от 0 до 4 ° С.
3. Добавить 200 мкл высокое качество безводном диметилформамиде (ДМФ) до 10 мг флакон Texas Red сульфонилхлорид (ЦДЗТ); вихрь на среде в течение 15 сек.
4. Vortex решений RSA на средних и добавить растворенный ЦДЗТ.
5. Обруч 50 мл конические в фольгу (Parafilm может быть использована для обеспечения герметичного уплотне....

Results

На рисунке 3 показан пример изображения, снятого с поверхности клубочка из Мюнхена крысы линии Вистар Frömter и шаги, предпринятые для определения проницаемости флуоресцентных альбумина. GSC значение для альбумина 0,0111 полученные для этого отдельные клубочки падения в диапазоне видели в этом штамме Мюнхена крыс линии Вистар, когда в условиях ФРС ^3. Стабильность видели в этих изображениях связано с тщательного планирования и исполнения поручений изображенные на рисунках 1 и 2.

Discussion

Шаги отраженных здесь представляют, что мы чувствуем, что те, которые будут производить последовательные и точные значения проницаемости, потому что они обойти ловушки следующие:

1. Рассеяния: использование красного флуорофорам излучающих обеспечить более эффективный сбор света с длиной волны больше фотонов в меньшей степени подвержены разброс. Использование зеленого или синего флуорофорам излучающих представит больший разброс в РКГ из-за усиления колебаний в значениях интенсивности от капиллярных петель и про.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 конфокальный/многофотонный микроскоп	Olympus America		Фильтры для детекторов: Синий 430/100, Зеленый 525/50, Красный 605/90
Синхронизация моды Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Настраиваемые длины волн возбуждения: ~750-1150 нм
Фотодетекторы фосфида арсенида галлия	Hamamatsu Corp		Примечание: Доступны передние или боковые конфигурации.
Метаморф Программное обеспечение для обработки изображений	Молекулярная динамика		Примечание: Версия 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Корпорация		2007
версия Работа с щипцами	Электронная микроскопия Науки	Cat# 78266-04
Ножницы для препарирования Майо	Электронная микроскопия	Науки Cat# 72962
CA Микроножницы Модель 1C300	Электронная микроскопия	Науки Кат# 78180-1C3
Келли Гемостатические щипцы (прямые)	Электронная микроскопия Науки	Кат# 72930
Водяная рубашка Одеяло + грелка	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Одеяло-66N111CC
Repti-Therm Подогреватель бака	ZooMed		RH-4
Техасский красный сульфонилхлорид	инвитроген/молекулярные зонды	Cat# T-353
Сыворотка крови крысы Альбумин	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
Высококачественный безводный DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Автоклавная лента Strate-Line	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Нижняя тарелка (50 мм/40 мм coverslip)	Электронная микроскопия Sciences	Cat# 70665-07