Антигены охраняемых Функциональные эритроциты Мембрана прививки Компактный сверхразветвленных полиглицерины

Rafi Chapanian; Iren Constantinescu; Donald E. Brooks; Mark D. Scott; Jayachandran Kizhakkedathu

doi:10.3791/50075

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Антигены охраняемых Функциональные эритроциты Мембрана прививки Компактный сверхразветвленных полиглицерины

17.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50075

⸱

2 января 2013 г.

Rafi Chapanian¹^,² , Iren Constantinescu¹^,³ , Donald E. Brooks¹^,²^,⁴ , Mark D. Scott¹^,²^,³ , Jayachandran Kizhakkedathu¹^,²^,⁴

¹Centre for Blood Research, University of British Columbia , ²Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia , ³Canadian Blood Services, University of British Columbia , ⁴Department of Chemistry, Life Sciences Centre, University of British Columbia

В этой статье

Краткое содержание

Модификация клеточных мембран красных кровяных телец (эритроцитов) с сверхразветвленных полиглицерина (HPG) представлены. Измененные эритроциты были характерны водной двухфазной разделов, осмотическая хрупкость и дополнения опосредованный лизис. Камуфляж поверхностных белков и антигенов оценивали с помощью проточной цитометрии и Micro System Typing (МТС) карты крови фенотипа.

Аннотация

Красные клетки крови (эритроциты) переливание имеет жизненно важное значение для лечения ряда острых и хронических медицинских проблем, таких как талассемия и серповидно-клеточная анемия ^1-3. В связи с наличием множества антигенов на поверхности эритроцитов (~ 308 известными антигенами ^4), пациентов в хронической терапии переливания крови развиваются аллоантител в связи с матчем мисс незначительных антигенов на переливание эритроцитов ^{4, 5.} Прививка гидрофильные полимеры, такие как полиэтилен гликоля (PEG) и сверхразветвленных полиглицерина (HPG) образует исключения слой на мембране эритроцитов, что препятствует взаимодействию антител с поверхностными антигенами, не влияя на прохождение малых молекул, таких как кислород, глюкоза и ионы ^3. В настоящее время ни один метод не доступен для генерации универсальных красных клеток крови донора отчасти из-за сложной проблемы, связанной с наличием большого количества антигенов (белков и углеводов основе) на поверхности эритроцитов и DРАЗВИТИЯ таких методов позволит существенно повысить безопасность переливания, а также значительно улучшить доступность и использование БС. В этом докладе, эксперименты, которые используются для разработки антигена эритроцитов охраняемой функциональной мембраной прививки HPG и их характеристика представлены. HPGs высоко биосовместимые полимеры компактная ^{6, 7,} и ожидается, что находится внутри клетки гликокаликса, которая окружает липидную мембрану ^{8, 9} и маски РБК поверхностных антигенов ^{10, 11.}

Протокол

А. сверхразветвленных Модификация полиглицеридов (SS-HPG)

Место лиофилизированный HPG 60 кДа (0,5 г, 0,0083 ммоль) в колбу с круглым дном и просушить в течение ночи под вакуумом при 90 ° C.
Охладите колбу до комнатной температуры, и распустить сушеные HPG в безводном пиридине (3 мл).
Для функционализации примерно восемь гидроксильных групп на HPG с карбоксильными группами, добавить каталитическое количество диметиламинопиридина (одна капля 5 мг / мл раствора в пиридине) к HPG решение. К этой смеси добавляют янтарный ангидрид, (0,0067 г, 0,0664 ммоль) растворяли в 0,5 мл пиридина по каплям в течение 10 мин. Смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре в атмосфере аргона.
Осадок смеси в 40 мл холодного ацетона (4 ° C) в 50 мл центрифужные пробирки и центрифугируют использованием Beckman J2-MC центрифуге при 27000 х г в течение 15 мин. Слейте супернатант, и удалить остатки ацетона путем промывки аргона при комнатной температуре.
Для активации карбоксильнойл групп с сукцинимидил сукцинат (SS) групп, растворяться карбоксильных функциональных групп HPG в 3 мл безводного DMF. Добавить N-гидроксисукцинимид (0,0077 г, 0,0664 ммоль) и N, N-диизопропилкарбодиимид (0,0084 г, 0,0664 ммоль), HPG решения и размешать смесь на ночь при комнатной температуре в атмосфере аргона.
Очищают SS-HPG путем осаждения в холодном ацетоне.
Удалите остатки ацетона путем промывки аргона.
Определить чистоту изменение HPG и степень карбоксильных и SS функционализации протона ⁽¹ H) - ЯМР-анализа.

B. Всего для сбора крови и разъединении красных кровяных телец (эритроцитов)

Сбор цельной крови (40% Гематокрит, 3 мл) с согласия здоровых человеческих доноров в трубку Vacutainer цитрата.
Центрифуга цитрат трубы в 1000 х г в течение 4 мин.
Удалить супернатант, который содержит плазму и тромбоциты, и пальто промежуточных Баффи, которая содержит лейкоциты и plateleTS помощью пипетки Пастера.
Передача эритроцитарной массы (80% гематокрита, 1,2 мл) в 12 мл центрифужные пробирки Falcon, и добавить PBS буфера (8 мл, рН = 8,0), чтобы вымыть эритроцитов.
Смешать эритроцитов обращением для получения равномерного распределения клеток.
Центрифуга трубки сокола в 1000 мкг в течение 4 минут и удалить супернатант.
Вымойте эритроцитов с PBS еще два раза, повторив шаги 5 и 6.
Место упакован-БС (100 мкл) в 1,6 мл трубки Эппендорф, и добавить буфера PBS (300 мкл, рН = 8,0) для получения 20% Гематокрит эритроцитов.

C. HPG Прививка в эритроцитах

Сразу же после осаждения изменение HPG в ацетоне в шаге A6, место SS-HPG (150 мг) в стеклянном флаконе (1 драм) и растворить его в буфере PBS (300 мкл, рН = 8,0).
Добавить SS-HPG раствор полимера в 20% Гематокрит промывают БС для получения конечного объема 400 мкл и SS-HPG концентрации, которая колеблется от 0,5 мм до 3 мм. Например, чтобы подготовить эритроциты обрабатывают 0,5 мМ SS-HPG, удалить 36 мкл PBS из промытого РБК и поместите 36 мкл СС-HPG раствора полимера.
Vortex подвеска мягко и поместить Эппендорфа на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение 1 часа.
Центрифуга Eppendorf трубы при 1000 мкг в течение 4 мин, и пипетки из супернатанта.
Добавить 1 мл PBS, чтобы вымыть эритроцитов, центрифуги и удалите супернатант.
Добавить 1 мл физиологического раствора и промыть эритроциты два раза в шаге 5.
Добавить 300 мкл физиологического раствора до 100 мкл эритроцитарной массы (80% Гематокрит) до конечной концентрации 20% гематокрита.

D. Характеристика HPG изменения эритроцитов

I. Дополнение опосредованный лизис

Сбор около 8 мл цельной крови здоровых доноров человека в BD Vacutainer стеклянной трубки сыворотки, и позволяет крови свертываться при комнатной температуре в течение 30 мин.
Центрифуги трубы при 2000 мкг в течение 10 мин и собирают около 3 мл сыворотки.
Один миллилитр Серум была помещена в водяную баню при температуре 60 ° С в течение 30 мин для подготовки тепла инактивированной сыворотки.
Добавить 60 мкл свежей сыворотки или тепла инактивированной сыворотки в трубку Eppendorf, содержащие 60 мкл 20% Гематокрит HPG измененные эритроциты или немодифицированных эритроцитов.
Инкубируйте эритроцитов в течение 1 часа при 37 ° C.
Для определения количества гемоглобина в клеточной суспензии, место 5,9 мкл 20% гематокрита HPG изменения эритроцитов или немодифицированных клеток в трех экземплярах в 96-луночный планшет. Добавить 294 мкл реагента Драбкин (в реагент, который используется для определения количества гемоглобина spectrophotomerically). Смешать клеток с реагентом Драбкин в пипетированием и выходит. Измеряют поглощение гемоглобином cyanoderivative при 540 нм с использованием SPECTRA MAX 190 ридер.
Для определения количества гемоглобина в супернатант, центрифугируют клетки при 13000 х г в течение 1 мин. Место 50 мкл супернатанта в трех экземплярах в 96-луночный планшет. Добавить 250 мкл реагента в Драбкин. Mix клеток с реагентом Драбкин вс помощью пипетки и выходит. Измеряют поглощение гемоглобином cyanoderivative при 540 нм с использованием SPECTRA MAX 190 ридер.
Определить количество лизированных клеток по отношению гемоглобина в надосадочной жидкости (шаг 7) и общего гемоглобина в образце (шаг 6) ^{8, 11, 12.}

II. Камуфляж крупных и мелких антигенов с помощью карт МТС

Место 50 мкл HPG изменение РБК (10% гематокрита) в трубку Eppendorf, центрифуги при 1000 х г в течение 1 мин, и удалите супернатант.
Добавить 110 мкл разбавителя МТС в осадок клеток и однородной суспензии клеток с помощью пипетки и выходит.
Добавить 11 мкл суспензии клеток в каждой мини-колонки гель. Старайтесь не прикасаться к геля в процессе добавления.
Найдите МТС карты в держатель карты центрифуги и центрифугируют при 156 х г в течение 6 мин.
Охрана поверхностных антигенов определяется из расположения РБК в мини-колонки гель, основанный на производствеГ описания.

III. Водные два измерения фазы раздела

Подготовка Декстран 500 кДа / PEG 8 кДа двухфазного разделения системы, состоящей из (5% декстран 500k, 4% ПЭГ-8К, 150 мМ NaCl, 10 мМ фосфат) в соответствии с ^13.
Центрифуга при 433 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы получить два системных этапа (декстран в нижней).
Отделить два этапа тщательно.
Алиготе 1,0 мл верхней фазы ПЭГ в меченых трубку (с вогнутым дном), добавить 20 мкл 20% гематокрита HPG изменения эритроцитов, клеток и перемешать осторожно стряхивая.
Добавить 0,5 мл верхней фазы, которые содержат клетки до 0,5 мл нижней фазы, и смешивать системе осторожно стряхивая.
Положите трубку на скамейке запасных ~ 2 мин для системы отделить и определить расположение клеток в системе. Локализация эритроцитов (в верхней фазе PEG, в нижней фазе декстран или в обоих) есть функция от степени модификации и молекулярныхвес HPG.

IV. Осмотическое измерения хрупкости

Подготовка NaCl решений с концентрацией в диапазоне от 0 до 0,9 (в / о)%.
Место 0,4 мл NaCl решений в 1,5 мл пробирок Эппендорф.
Добавить 20 мкл эритроцитов (20% гематокрита) в растворы NaCl.
Mix клетки тщательно инверсии и разместить их на водяной бане при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
Приостановить клетки тщательно инверсии. Принимать по 50 мкл суспензии эритроцитов и добавить его в 1 мл реагента Драбкин, в помещают в кювету. Смешать клеток с реагентом Драбкин в пипетированием и выходит. Измеряют поглощение гемоглобином cyanoderivative при 540 нм с использованием BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS читателя.
Для определения количества гемоглобина в супернатант, центрифугируют клетки при 1000 х г в течение 1 мин. Добавить 200 мкл супернатанта в 1 мл реагента Драбкин в кювет. Смешать клеток с реагентом Драбкин в пипетированием и выходит. Измеряют поглощение hemoglОБИН cyanoderivative при 540 нм с использованием BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS читателя.
Подсчитайте количество клеток лизируется в различных раствором хлорида натрия с отношением количества гемоглобина в надосадочной (шаг 6) на общую сумму гемоглобина в клеточной суспензии (шаг 5).

В. проточной цитометрии измерения - защита резус-D (РЖС) антигена

Добавьте 5 мкл управления или HPG измененные эритроциты (20% гематокрита) в трех экземплярах в PBS буфере с добавлением 0,5% BSA в общем объеме 25 мкл.
Добавить 25 мкл FITC моноклональными анти-резус-D (РЖС) приобретены у Quotient Biodiagnostics (штат Пенсильвания, США).
Выдержите смесь в течение 30 мин при 37 ° С на водяной бане.
Вымойте смеси с 1,5 мл PBS буфера в два раза. Центрифуга при 1000 мкг в течение 1 мин, чтобы удалить супернатант.
Приостановить эритроцитов в 1 мл физиологического раствора, и передать суспензии в 4 мл потока BD трубки проточной цитометрии.
Анализ использования FACSCanto II FloW цитометр, приобретая 5000 событий на ворота РБК контроля, а также использовать весь событий для анализа.

VI. Проточной цитометрии измерений - Экспрессия CD47

Добавить 1,54 мкл управления или HPG измененные эритроциты (20% гематокрита) в трех экземплярах в PBS буфере с добавлением 0,5% BSA в общем объеме 44 мкл.
Добавить 6 мкл фикоэритрин (PE), меченного мышиного анти-CD47 человека приобрести BD Biosciences (Нью-Джерси, США).
Выдержите смесь в течение 30 мин при 37 ° С на водяной бане.
Вымойте смеси с 1,5 мл PBS буфера два раза. Центрифуга при 1000 мкг в течение 1 мин, чтобы удалить супернатант.
Приостановить эритроцитов в 1 мл солевого, и пройти через 26 G 5/8 иглу, чтобы минимизировать клетки слипания.
Передача суспензии в 4 мл потока BD трубки проточной цитометрии.
Анализ использования FACSCanto II проточной цитометрии, приобретая 10000 событий на ворота РБК управления.