Методическая статья

Drosophila взрослых Обонятельная Shock Обучение

29.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50107

⸱

7 августа 2014 г.

 , 
1Physiology and Pharmacology, University of Bristol

В этой статье

Краткое содержание

Метод измерения взрослых Drosophila ассоциативной памяти описывается. Анализ основан на способности лету ассоциировать запах, представленный с отрицательным подкреплением (электрическим током), и затем вызвать эту информацию в более позднее время, позволяя памяти должна быть измерена.

Аннотация

Drosophila были использованы в классических экспериментах кондиционирования на протяжении более 40 лет, что существенно облегчает наше понимание памяти, в том числе выяснение молекулярных механизмов, вовлеченных в когнитивных заболеваний 1-7. Обучение и память могут быть проанализированы в личинок, чтобы изучить влияние на развитие нервной системы генов 8-10 и у мух, чтобы измерить вклад взрослых генов пластичности 1-7. Кроме того, короткая продолжительность жизни дрозофилы облегчает анализ генов, опосредующих возрастное ухудшение памяти 5,11-13. Наличие многих индуцируемых промоторов, которые подразделяют Drosophila нервную систему, позволяет определить, когда и где интерес ген необходим для нормального памяти, а также реле различных аспектов подкрепления сигнала 3,4,14,16.

Изучение памяти у взрослых дрозофил позволяет для детального анализаповедение и схема участие и измерение долговременной памяти 15 -17. Длина взрослой стадии вмещает долгосрочные генетические, поведенческие, диетические и фармакологические манипуляции памяти, в дополнение к определению эффект старения и нейродегенеративных заболеваний на память 3-6,11-13,15-21.

Классическая кондиционирования индуцируется одновременного представления нейтральным запахом кия (условного раздражителя, CS +) и армирующей стимула, например., Поражению электрическим током или сахарозы, (безусловный раздражитель, США), что стало ассоциироваться друг с другом животным 1,16. Второй условный раздражитель (CS -) впоследствии представлены без США. На этапе тестирования, Drosophila одновременно представлены CS + и Cs-запахов. После Drosophila предоставляются времени, чтобы выбрать между запахов, распределение животных регистрируется. Эта процедура альминимумы ассоциативным отвращение или аппетитивная кондиционирования чтобы быть надежно оценена без предвзятости, введенной врожденной предпочтение либо условных раздражителей. Различные контрольные эксперименты проводятся также для проверки все генотипы нормально реагируют запахом и арматуры в одиночку.

Введение

Метод, представленный здесь является то, что описывается Талли и Куинн с небольшими изменениями 1. Эксперимент выполняется в два этапа: мухи обучаются на первом этапе, и обученные мухи тестируются на втором этапе. Во время обучения, группа мух одновременно подвергается запах 1 (CS +) и поражение электрическим током (США) в учебном трубки. Мухи затем получить запах 2 (CS -) без поражения электрическим током. Этот сингл спаривание конкретного запаха с током называется обучение 1-цикл, и запахи, которые наиболее часто используются 4-метилциклогексанол (MCH) и 3-октанол (OCT).

Обучение Один цикл приводит к образованию лабильного фазы памяти, которая может быть обнаружена в течение 7 ч; Тем не менее, память, как правило, тестирование сразу определить, что называется обучения, приобретение или 2 мин памяти. Память измеряется в 30 мин или 1 ч упоминается как кратковременной памяти, в то время как3 часа памяти называют среднесрочной памяти. Разоблачение мух повторяющихся циклов обучения с промежутками между циклами подготовки (на расстоянии обучение) приводит к консолидированной форме долговременной памяти, которая зависит CREB транскрипция и длится до недели. Обучение без пробелов (массированная подготовка) приводит к образованию анестезии устойчивостью памяти (ARM), который похож на долговременной памяти, как правило, измеряется через 24 часа после 5 циклов обучения 7,13,15-17,20,21.

При таком подходе эффект различных генных мутаций на этих различных фаз памяти может быть определена. Промоутер приводом выражение световой или чувствительных к температуре трансгенов, чтобы активировать или блокировать нейронной активности специфических нейронов позволяет исследовать которых нейроны необходимы для приобретения памяти, консолидации и поиска 3,4,11,15,16,20, 22-24. Память на 1 час, как правило, измеряется при изучении возрастной ухудшение памяти, потому что этой фORM памяти появляется особенно уязвимы к воздействию старения 11-13. Полный спектр поведенческих и генетических элементов управления выполняются с экспериментами памяти, например, определить, является ли дефект производительность, потому что из центрального дефекта памяти или периферической сенсорной дефекта, который предотвращает муху от ощущая током или обонятельный кий 5 -7, 1 7, 25,26.

Протокол

1 Fly Подготовка

  1. Скрещивание всех мутантов, GAL4 / UAS и других линий со штаммом дикого типа, такие как CSw-, по крайней мере, шести поколений до поведенческих экспериментов для контроля генетического фона 26.
  2. Вырастить мух на стандартной кукурузной муки, дрожжей и мелассы пищевой рацион под 12:12 ч цикле свет-темнота при 25 ° С, если конкретные манипуляции не требуют разную температуру.
    1. Для определения влияния трансгенной экспрессии: Использование 18 ° C, чтобы предотвратить экспрессию трансгенов в Gal4 Gal80 TS (целевой системе) через развитие, а затем перейти мух к 30 ° С инкубатор за 1-2 дня до поведенческого эксперимента. Провести эксперимент при 30 ° С, чтобы определить влияние трансгенов выражения 3,4,6,7,14.
    2. Для экспериментов с использованием активированного нагреванием TRPA1 каналов, чтобы стимулировать нейроны: Повышение мух при 23 ° C, что является температурой известночтобы поддерживать неактивный канал, а затем перейти к поведению комнате при температуре 30 ° С, чтобы активировать TRPA1, экспрессирующих нейронов.
    3. Для экспериментов с использованием температуры Shibire чувствительную блокировать синаптическую выход 11, 14,24: задний мух при 18 ° С и проводить тестирование при 30 ° С.
  3. Соберите мух 1-2 дня до эксперимента и рассчитывать их в группы по примерно 25 под легкой CO 2 анестезии. Храните мух, по крайней мере O / N в пищевых флаконах (без дрожжей) при 25 ° C (если определенные манипуляции не требуют иной температуры) и 70% относительной влажности в экологически контролируемой комнате с 12:12 ч света: темные условия до времени эксперимента.
    Примечание: Эта хранения позволяет мухи, чтобы акклиматизироваться к последующему испытанию обучения, проведенного в экологически контролируемой комнате, которая имела оптимальные условия для Drosophila обучения и, главное, удаляет любые ежедневный ENVIщей среды изменения, которые, возможно, повлияли на поведенческий фенотип.

2 Подготовка к эксперименту

  1. Выполните эксперименты в заказной плексигласа Т-образном лабиринте (Рисунок 1).
  2. Регулярно проверяйте трубных фитингов для того, чтобы герметичная прокладка получается во время эксперимента. При необходимости измените уплотнительные кольца, которые запечатывают внутренние отсеки Т-образном лабиринте.
  3. Поместите на заказ медных сетей внутри учебных труб. Проверить и очистить эти сетки регулярно, и заменить, если окисляется. Прикрепите медные сетки на провода через крокодил, которые работают с коммутационной коробки, подключенного к электрической стимулятора. С помощью вольтметра убедитесь, что аппарат проводить необходимый шок.
  4. Используйте G-зажимы провести лабиринт плотно, чтобы избежать утечки воздуха.
  5. Прикрепите Т-лабиринт к трубке, которая работает с воздушным насосом, чтобы позволить запахи, который можно сделать через мух, а затем удаляется из Т-образном лабиринте. Поддержание мягкий воздухтечь в ~ 2 л / мин

3. Запах Растворы

  1. Используйте два различных запахов в концентрациях, таких, что мухи показывают одинаковое предпочтение обеих запахов. Используйте 4-метилциклогексанол (1:67) и 3-октанол (1: 100), разбавленного в минеральном масле 7,13.
    Примечание: Тщательно определить эти концентрации, который будет различным по лаборатории. Например другие используют 1:10 для обеих запахов 24. Другие обычно используемые запахи включают этилацетат и изо-амил ацетат.
  2. Внесите 30 мкл разбавленного запаха в изготовленном на заказ чашки запаха, помещенного в запаха блока прикрыт пластиковой трубки с перфорированной верхней, что позволяет воздуху быть обращено на запах в чашке, тем самым подвергая мух к запаха шлейфа.

4 Обучение протокола (рисунки 1 и 2)

  1. Для взрослого обонятельной ударной кондиционирования, выполнять все эксперименты в тусклом красном свете (т.е.., Красный светодиод), что позволяет исследователю увидеть, но предотвращает эту видеть, что позволяет мухи сконцентрироваться на обоняния, в отличие от визуальных входов.
  2. Представьте мух в учебный трубки, а затем приложить к Т-образном лабиринте и позволить им адаптироваться к трубе и потока воздуха в течение 90 сек.
  3. Представить первый запах (4-метилциклогексанол, MCH) с 60-V шока (состоящей из двенадцати 1,25 сек импульсов с 3,75 сек между импульсных интервалов) для общей продолжительностью 60 сек.
  4. Следуйте шок с периодом отдыха 30 сек без запаха или шока.
  5. Представить второй запах (3-октанол, октябрь) в течение 60 секунд без шока.
  6. Следуйте шок с периодом отдыха 30 сек без запаха или шока.
  7. Перемещение мух от учебного камеры в центральной камере Т-образном лабиринте поворотом Т-лабиринт на бок и осторожно стучать дно Т-лабиринте на мягкой поверхности, например, как старый коврик мыши. Поддержание мух в центральной камере в течение 90 сек.
  8. Установите выбор трубок в боttom аппарата для формирования Т-образном лабиринте.
  9. Для измерения обучение, перемещения мух на ваш выбор точки Т-образном лабиринте, где они были одновременно подвергаются обоих запахов и двигаться навстречу друг. Провести тестовый период для 120 сек.
  10. Ловушка мухи в выборе труб, сдвинув в центральную камеру до тем самым блокируя концы выбор трубок. Соберите мух в каждой руке Т-лабиринт и в центральном отделении в пищевые флаконов и кол.
  11. Для измерения памяти, собирать мух после тренировки (4.6) и передавать их от Т-образном лабиринте к пищевым флаконах без дрожжей. Магазин летит в темноте при 25 ° С и 70% влажности в течение оставшегося времени, необходимого для определения фазы памяти интереса (см введение). Вновь мух в Т-лабиринте, как в стадии 4.7.
  12. Для долговременной памяти, использовать индивидуальному заказу лабиринт, который позволяет несколько партий мух обучаться одновременно. Администрирование 5 циклов обучения с 15 мин между цикла интервала (спаCED) или без интервала между цикла (массированная). Поддерживать мух при 18 ° С и 70% влажности в темноте, пока тестирование. Перед тестированием двигаться мух до 25 ° С и дать им возможность акклиматизироваться в течение не менее 1 часа. Оценка долговременной памяти 24 ч после обучения.
  13. После поведенческих экспериментов, очистить запах чашки горячей водой и без запаха моющего средства. После сушки пальто чашки с 10 мкл sigmacote. Высушите sigmacote при нагревании в микроволновой печи. Периодически очищайте Т-лабиринт плексигласовые трубы и запах блоки с горячей водой и без запаха моющего средства.

5 Расчет этого индекса: Мера памяти мух "

  1. Рассчитать Индекс эффективности (PI) для каждого условия, как количество мух избегая ударной паре запах (CS -) минус количество мух, выбирающих ударной паре запах (CS +), деленное на общее количество мух (CS - + CS +) 1.
    ПеИндекс rformance (PI) = (# CS - мухи - # CS + летит) / (# Всего мухи)
  2. Рассчитайте окончательное PI эксперимента путем усреднения PI эксперимента, в котором МЧ был шок-парные запах и тот, в котором октября был шок-парные запах. Это удаляет любую предвзятость мух, имеющих более высокую предпочтение одному запаху.

6. сенсомоторной управления

  1. Выполните запах зрения путем введения ~ 40-50 мух в Т-лабиринте 6,7,17.
  2. После 90 секунд, двигаться мух к точке выбора, и позволить им 2 мин выбирать между чистых запахов и воздуха.
  3. Сбор и подсчет мух. Вычислить процент уклонения путем деления общего количества мух, которые выбрали запах от тех, которые приняли участие в тесте.
  4. Для ударной реактивности 6,7,17, ввести мух в ударной камере.
  5. После 90 секунд отдыха, администрировать электрическим током 60-V постоянного тока, от которой мухи могут убежать в аналогичныйтрубка без шока.
  6. Разрешить 2 мин для мухи выбрать; сбор и подсчет мух. Вычислить процент избегания шока путем деления количества мух, которые избегали шок выброса ударную трубку на общее количество мух в эксперименте. Включите мух, которые остаются в центральной камере в общей сложности те, которые избежали поражения электрическим током.

Результаты

Индекс производительности (PI), служит мерой памяти. Таблица 1 иллюстрирует характерную вычисление PI.

МЧ в паре с током 3-октябре в паре с током
Мухи избегая МЧ (в октябре трубки) = 80
Мухи, предпочитающие МЧ (в MCH трубки) = 20
PI 1 - (80-20) / 80 + 20)
= 0,6 		Мухи избегая октября (в MCH трубки) = 75
Мухи, предпочитающие октября (в октябре трубки) = 25
PI 2 = (75-25) / (75 + 25)
= 0,5
PI эксперимента = (0,6 + 0,5) /2=0.55

Таблица 1 представитель расчет индекса производительности с использованием наглядных данных. Индексы производительности для различных экспериментов можно сравнить с выяснения эффекта памяти. Как только такаясравнение показано на рисунке 3, который содержит результаты серии экспериментов, выполненных с Canton S дикого типа взрослых мух (WT) и балбес обучения мутантный взрослых мух 1. Средняя из 10 ИП обеспечивается, с барами об ошибках, представляющих стандартную ошибку среднего (SEM). Эти результаты показывают, что Dunce мухи показывают снижение обучения по сравнению с диким типом.

figure-results-1
Рисунок 1 взрослый Экспериментальная установка. Мухи обучены и испытаны в T лабиринт. Обучение включает в себя представляя запах А с электрическим током с последующей второй запаха B без поражения электрическим током. После периода отдыха в средней камере мухи представлены обоих одновременно запахов. Мухи оказались в ловушкев двух труб и собраны и подсчитаны получить баллы обучения / памяти.

figure-results-2
Рисунок 2 Протокол обучение взрослых. Мухи тренируются в два этапа. Первый шаг, где мухи получают запах (CS +) в паре с электрическим током (США) в течение 60 сек. На следующем этапе мухи приема второго запах (CS-) без поражения электрическим током. Мухи затем оставляют на 90 сек, после чего они проверены на их выбор между CS + и CS-.

figure-results-3
Рисунок 3 Представитель график, показывающий балбес и дикого типа обучения во взрослой дрозофилы. WT и балбес мухи были протестированы после одного сеанса обучения. Балбес мухи показывают снижение в изучении сравнению с WT (п = 10).

Обсуждение

Drosophila взрослых обонятельный шок обучения Анализ, представленный здесь позволяет анализ молекулярных механизмов, лежащих в основе различных фаз памяти, в том числе долговременной памяти 15-17. А также определение влияния циркадных ритмов 18, сна 19, диеты 20,21, старением 11-13, нейродегенеративные заболевания 5 и медикаментозного лечения 5,6,19 на память.

Многие мощные подходы были недавно разработаны для функциональной визуализации нейронных цепей, которые обеспечивают обонятельный память у мух 3,4,7,11,16,27. Эти optogenetic методы использовать огромный репертуар различных промоутеров имеющихся у дрозофилы 14,16. Эти промоторы используются, чтобы выразить генетически закодированные кальция и цАМФ журналистам в нейронах памяти 16,27 изучение влияния специфических генных мутаций по следам памяти.

Чтэ использование условных промоутеров и мутаций у взрослых позволяет изучение роли пост-развивающего генного продукта в памяти 3,4,6,7,13,14. Изображений и поведенческие подходы могут быть объединены с легких и активированных нагреванием каналов стимулируют или ингибируют различные нейроны в запоминающей схеме 11,14,16,22-24 дальнейшего выяснения их функции. Кроме того, нейроны памяти тела гриба доступны цельноклеточных патч зажим записи 28 и математических и вычислительных методов, которые используются для моделирования Drosophila обонятельный память 29.

Эти экспериментальные результаты, в сочетании с различными формами ассоциативных протоколов памяти, представленных здесь, позволяют Drosophila, которые будут использоваться для моделирования молекулярно-и схема изменения уровней в ассоциативной памяти, которые происходят в ответ на вознаграждения, наказания, мотивация, склонность, старения и болезней 5,6,11-13,16,30-31.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Мы признаем, Блумингтон фондовых центров для штамма лету. Эта работа была поддержана исследовательского гранта от BBSRC (BB / G008973 / 1).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3-октанолSigma218405
4-метилциклогексанолSigma15309-5
БензальдегидSigma418099
минеральное маслоFlukaBP2629-1
ГексилацетатSigma108154
фруктозойSigmaF0127
AgaroseБиолайнБИО-41025

Ссылки

  1. Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology A. 157, 263-277 (1985).
  2. Bolduc, F. V., Tully, T. Fruit flies and intellectual disability. Fly (Austin). 3, 91-104 (2009).
  3. McGuire, S. E., Deshazer, M., Davis, R. L. Thirty years of olfactory learning and memory research in Drosophila melanogaster. Prog Neurobiol. 76, 328-347 (2005).
  4. Keene, A. C., Waddell, S. Drosophila olfactory memory: single genes to complex neural circuits. Nat Rev Neurosci. 8, 341-354 (2007).
  5. Chiang, H. C., Wang, L., Xie, Z., Yau, A., Zhong, Y. PI3 kinase signaling is involved in Abeta-induced memory loss in Drosophila. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7060-7065 (2010).
  6. Kanellopoulos, A. K., Semelidou, O., Kotini, A. G., Anezaki, M., Skoulakis, E. M. C. Learning and memory deficits consequent to reduction of the Fragile X mental retardation protein result from metabotropic glutamate-mediated inhibition of cAMP signalling in Drosophila. J Neurosci. 32, 13111-13124 (2012).
  7. Malik, B. R., Gillespie, J. M., Hodge, J. J. L. CASK and CaMKII function in the mushroom body a’/ß’ neurons during Drosophila memory formation. Front Neural Circuits. 7, 52(2013).
  8. Gerber, B., Stocker, R. F. The Drosophila larva as a model for studying chemosensation and chemosensory learning: a review. Chem Senses. 32, 65-89 (2007).
  9. Gillespie, J. M., Hodge, J. J. L. CASK regulates CaMKII autophosphorylation in control of synaptic growth and appetitive learning. Front Molecular Neuroscience. 6, 27(2013).
  10. Apostolopoulou, A. A., Widmann, A., Rohwedder, A., Pfitzenmaier, J. E., Thum, A. S. Appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. J Vis Exp. (72), e4334(2013).
  11. Tonoki, A., Davis, R. L. Aging impairs intermediate-term behavioral memory by disrupting the dorsal paired medial neuron memory trace. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 6319-6324 (2012).
  12. Yamazaki, D., Horiuchi, J., Nagano, S., Tamura, T., Saitoe, M. The Drosophila DCO mutation suppresses age-related memory impairment without affecting lifespan. Nat Neurosci. 10, 478-484 (2007).
  13. Cavaliere, S., Malik, B. R., Hodge, J. J. L. KCNQ channels regulate age-related memory impairment. PLoS One. 8, e62445(2013).
  14. Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
  15. Isabel, G., Pascual, A., Preat, T. Exclusive consolidated memory phases in Drosophila. Science. 304, 1024-1027 (2004).
  16. Perisse, E., Burke, C., Huetteroth, W., Waddell, S. Shocking revelations and saccharin sweetness in the study of Drosophila olfactory memory. Curr Biol. 23, R752-R763 (2013).
  17. Tully, T., Preat, T., Bonyton, S. C., Del Vecchio, M. Genetic dissection of consolidated memory in Drosophila. Cell. 79, 35-47 (1994).
  18. Lyons, L. C., Roman, G. Circadian modulation of short-term memory in Drosophila. Learning and memory. 16, 19-27 (2009).
  19. Le Glou, E., Seugnet, L., Shaw, P. J., Preat, T., Gouguel, V. Circadian modulation of consolidated memory retrieval following sleep deprivation in Drosophila. Sleep. 35 (10), 1377-1384 (2012).
  20. Placais, P. Y., Preat, T. To favour survival under food shortage, the brain disables costly memory. Science. 339, 440-442 (2012).
  21. Hirano, Y., et al. Fasting launches CRTC to faciltate long-term memory formation in Drosophila. Science. 339, 443-446 (2012).
  22. Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16, 1741-1747 (2006).
  23. Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139, 405-415 (2009).
  24. Aso, Y., et al. Three dopamine pathways induce aversive odor memories with different stability. PLoS Genetics. 8, e1002768(2012).
  25. Connolly, J. B., Tully, T. Drosophila: a Practical Approach. Roberts, D. B. , Oxford University Press. 265-319 (1998).
  26. Connolly, J. B., et al. Associative learning disrupted by impaired Gs signaling in Drosophila mushroom bodies. Science. 274, 2104-2107 (1996).
  27. Davis, R. L. Traces of Drosophila memory. Neuron. 70, 8-19 (2011).
  28. Gu, H., O'Dowd, D. K. Cholinergic synaptic transmission in adult Drosophila kenyon cells in situ. J Neurosci. 26, 265-272 (2006).
  29. Young, J. M., Wessnitzer, J., Armstrong, J. D., Webb, B. Elemental and non-elemental olfactory learning in Drosophila. Neurobiol Learn Mem. 96, 339-353 (2011).
  30. Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. .A. Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
  31. Waddell, S. Dopamine reveals neural circuit mechanisms of fly memory. Trends Neurosci. 33, 457-464 (2010).

Перепечатки и разрешения

Теги

DrosophilaDrosophilaT
Drosophila взрослых Обонятельная Shock Обучение
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.