Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Сбор и измерения раневого экссудата биохимических медиаторов в хирургических ран

11.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50133

⸱

20 октября 2012 г.

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesia, Stanford University School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье дается подробное и наглядное описание методологии сбора и измерения биохимических воспалительных и ноцицептивных посредников на месте операции раны после кесарева сечения. Этот человек биотестирования были использованы для определения корреляции между раной и сывороточных концентраций цитокинов и лекарственно-опосредованного изменения в ране цитокинов, хемокинов и neuropetides.

Аннотация

Мы описываем методологию, которую мы можем собирать и оценивать биохимические воспалительных и ноцицептивных посредников на месте операции рану. Сбор сайт-специфические биохимические маркеры важно понять взаимосвязь между уровнем в сыворотке крови и хирургические раны, определить любую связь между медиатора, боль, анальгетиков и других решений интерес, и оценить влияние системного и периферического введения препарата на хирургические раны биохимия. Эта методика была применена для здоровых женщин перенесших плановое кесарево сечение со спинальной анестезией. Мы измерили экссудатом раны и сыворотки посредников в те же сроки, как боль пациента оценки и анальгетики потребления до 48 часов после кесарева сечения. С помощью этой методики мы смогли обнаружить различных биохимических медиаторов, включая фактор роста нервов (ФРН), простагландина Е2 (ПГ-Е2), субстанции Р, ИЛ-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8,Ил-10, Ил-12, Ил-13, Ил-17, TNF, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 и MIP-1β. Исследования применения этого человека хирургических ран биотестирования не нашли корреляции между раной и сывороточных концентраций цитокинов или их временной профиль высвобождения (J Боль 2008;. 9 (7) :650-7) 1 Мы также документально полезность технику для идентификации. Препарат-опосредованных изменений в ране содержание цитокинов (Anesth Analg 2010; 111:1452-9) 2.

Введение

После хирургического разреза, проживающих и миграции воспалительных клеток освободить про-и противовоспалительных цитокинов, простагландинов, нейропептидов и хемокинов, которые важны для инициирования и поддержания боли. 3,4 способность собирать сайт-специфические биохимические маркеры имеет решающее значение для определения Отношения между уровнями в сыворотке крови и хирургические раны, разобраться в сложных отношениях между релизе посредника и хирургической боли, и, чтобы иметь возможность оценить влияние как системные и периферическое введение препарата на хирургические раны биохимии. Исследования были направлены на системное определение биохимических посредников и не рассматривали сайт-специфического выпуска. 5,6 Сыворотка измерения цитокинов и хемокинов могут не отражать местные хирургической раны биохимических событий, и только указывают на глобальный системный ответ на хирургическую травму. В этой статье дается подробное и уникальное визуальное описание этой методологии, которая была ельул ссылки в 2008 году в журнале Pain. 1 Цель этой Юпитер статьи заключается в предоставлении уникальной и визуально расширенные описания методов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Протокол исследования

  • Получить Институциональные утверждение наблюдательного совета и письменного информированного согласия.
  • Выберите соответствующие хирургические населения для изучения поведения. Эта методика применялась только к ранам кесарево сечение, но большинство хирургических ран было бы уместно.
  • Рассмотрим критерии включения и исключения для участия в исследовании. Пациенты и процедур с высоким уровнем хирургической раневой инфекции не может быть целесообразно.
  • Стандартизация анестезии и послеоперационного ведения всех пациентов, чтобы избежать возможных вмешивающихся факторов.

2. Ноцицептивная и воспалительные Биохимические Коллекция посредник

  • Вставьте ON-Q PainBuster с ON-Q SilverSoaker (I-Flow, Lake Forest, CA) в подкожном слое незадолго до закрытия раны (другие слои ткани можно рассматривать). ON-Q PainBuster Pain Relief система непрерывно подает физиологического раствора со скоростью 2 мл / час. Носитель может быть расческаINED с или по сравнению с препаратами интерес, такие как местный анестетик и нестероидные противовоспалительные средства.
  • Включение стандартных трех-ходовой кран в эту систему, чтобы стремление раневого экссудата на указанные моменты времени. Непрерывной инфузии катетер предотвращает свертывание и повышает надежность системы для получения экссудата образцов. Если стремление экссудат трудно (около 5% случаев), рассмотрим нажатия мягко выше раны, меняя положение субъекта (например, сидя пациент или лежа их квартира), используя 0,5-1 мл физиологического раствора заподлицо или снятии Катетер 1-2 см.
  • В моменты времени, указанные в протоколе (например, 1, 4, 6, 24 и 48 часов после кесарева сечения), аспирации и снять 1 мл раны экссудат. Передача экссудата в полиэтиленовую чашку, содержащую 30 мкл ингибитора протеиназ. Мы использовали Полное ингибитора протеиназ (Roche Bioscience, Пало-Альто, Калифорния) для наших целей.
  • В то же интервалы времени, указанного в протоколе исследования, собрать 10 мл крови. Мы использовали трубки для сбора крови, содержащие литий гепарин, в нашем институте это зеленая верхом стеклянной трубки. Добавить дополнительные 300 мкл ингибитора протеиназ в образцах крови.
  • В течение 1 часа сбора, положить образцы на льду и центрифуге при 3000 оборотов в минуту в течение 10 мин.
  • Удалить сыворотке крови и ран надосадочную жидкость и поместить в стандартную трубку микроцентрифужных и хранят при температуре -20 ° C.

3. Пробирного анализа

  • После того как все экссудата исследования и образцы сыворотки собираются и хранятся, разморозить и анализа проб в то же время.
  • Мы измерили цитокинов и хемокинов использованием мультиплексирования иммуноанализа. Мультиплексе иммуноферментный анализ техники позволяет нам анализе многочисленных компонентов из небольшого (50 мкл) образца объема. Мультиплексе производят результаты, сопоставимые с результатами, полученными с ELISA. Мы использовали 17-сложных био-PlexTM системы (BioRad, Геркдулей, CA) для нашего анализа. Этот тест позволяет измерять фактор некроза опухоли α (ФНО), интерферон-α (INFα), интерлейкина 1β (IL-1β), интерлейкин 2 (IL-2), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-5 (IL-5 ), интерлейкина 6 (IL-6), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкина-8 (IL-8), интерлейкин (IL-10), интерлейкин-12 (IL-12), интерлейкин-13 (IL-13), интерлейкин 17 (IL-17), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитов-макрофагов колониестимулирующий фактор (GM-CSF), моноцитов хемоаттрактанта белок 1 (MCP-1) и макрофагов воспалительный белок 1 (MIP-1β). Фактор роста нервов была измерена с NGF DY256 антитела, добавив его в 17-сложная табличка с Bio-Plex комплекте связи амина.
  • Для обеспечения хорошего качества анализа, каждое измерение должно быть составлен в двух экземплярах. Стандартные кривые для каждого анализируемого создаются с помощью ссылки аналитов, предоставляемая изготовителем (при концентрации 0,20, 0,78, 3,13, 12,5, 50, 200, 800, 3200 пг / мл плюснулевой стандарт для нормального физиологического раствора). Стандартные кривые входят в каждом опыте и образцом концентрации рассчитываются с Bio-Plex менеджер программного обеспечения.
  • Вещество Р и простагландин E2 были измерены с помощью высокой чувствительности ELISA Kits. Мы использовали анализа Designs, Inc (Анн-Арбор, штат Мичиган) для этого анализа. Проведение анализа в двух экземплярах в соответствии со спецификацией производителя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

С помощью этой методики мы были в состоянии обнаружить все биохимические медиаторы, изложенных выше, за исключением ИЛ-5 в экссудате раны и плазмы. 1,2 Некоторые дополнительные цитокины не были обнаружены в плазме крови (IL-4, IL-17, TNF, INFγ , GM-CSF). 1 Время хода измеряется цитокинов и хемокинов в опубликованных исследованиях были последовательны, достигая плато в течение первых нескольких часов, сохранялась на протяжении 24-часового периода наблюдения 1,2 .. Тем не менее, NGF постоя...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это методологии, изложенной выше, было установлено, что достаточно чувствительны, чтобы обнаружить биохимические воспалительных и ноцицептивных медиаторов в раны экссудат. Отбор проб на различные моменты времени также позволила нам наблюдать изменения этих медиаторов с течением времени. 1,2 Мы не знаем другого человека хирургических ран анализа, которые могут серийно измерения профиля высвобождения воспалительных и ноцицептивных медиаторов в хирургическом экссудатом раны. Результаты нашей методологии раны кол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Работа д-ра Карвальо был поддержан грант от Управления по исследованию здоровья женщин и Национального института здоровья ребенка и развития человека Национального института здоровья (5K12 HD043452). Доктор Angst получила питания (On-Q PainBuster Post-Op Pain Relief System) и фонды (для биохимических анализов) от I-Flow (Лейк-Форест, Калифорния).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Ссылки

  1. Carvalho, B., Clark, D. J., Angst, M. S. Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. J. Pain. 9, 650-657 (2008).
  2. Carvalho, B., Clark, D. J., Yeomans, D. C., Angst, M. S. Continuous subcutaneous instillation of bupivacaine compared to saline reduces interleukin 10 and increases substance P in surgical wounds after cesarean delivery. Anesth. Analg. 111, 1452-1459 (2010).
  3. Verri, W. A., Cunha, T. M., Parada, C. A., Poole, S., Cunha, F. Q., Ferreira, S. H. Hypernociceptive role of cytokines and chemokines: targets for analgesic drug development. Pharmacol. Ther. 112, 116-138 (2006).
  4. Watkins, L. R., Maier, S. F. Immune regulation of central nervous system functions: from sickness responses to pathological pain. J. Intern. Med. 257, 139-155 (2005).
  5. Beilin, B., Bessler, H., Mayburd, E., Smirnov, G., Dekel, A., Yardeni, I., Shavit, Y. Effects of preemptive analgesia on pain and cytokine production in the postoperative period. Anesthesiology. 98, 151-155 (2003).
  6. Wu, C. T., Jao, S. W., Borel, C. O., Yeh, C. C., Li, C. Y., Lu, C. H., Wong, C. S. The effect of epidural clonidine on perioperative cytokine response, postoperative pain, and bowel function in patients undergoing colorectal surgery. Anesth. Analg. 99, 502-509 (2004).
  7. Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2006).
  8. Kristiansson, M., Soop, M., Sundqvist, K. G., Soop, A., Suontaka, A. M., Blomback, M. Local vs. systemic immune and haemostatic response to hip arthroplasty. Eur. J. Anaesthesiol. 15, 260-270 (1998).
  9. Liu, S. S., Richman, J. M., Thirlby, R. C., Wu, C. L. Efficacy of continuous wound catheters delivering local anesthetic for postoperative analgesia: a quantitative and qualitative systematic review of randomized controlled trials. J. Am. Coll. Surg. 203, 914-932 (2006).
  10. Eriksson, A. S., Sinclair, R., Cassuto, J., Thomsen, P. Influence of lidocaine on leukocyte function in the surgical wound. Anesthesiology. 77, 74-78 (1992).
  11. Clark, J. D., Shi, X., Li, X., Qiao, Y., Liang, D., Angst, M. S., Yeomans, D. C. Morphine reduces local cytokine expression and neutrophil infiltration after incision. Mol. Pain. 3, 28(2007).
  12. Webb, S. T., Ghosh, S. Intra-articular bupivacaine: potentially chondrotoxic. Br. J. Anaesth. 102, 439-441 (2009).
  13. Scott, N. B. Wound infiltration for surgery. Anaesthesia. 65, Suppl . 1. 67(2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

On Q Pain BusterE2P6
Сбор и измерения раневого экссудата биохимических медиаторов в хирургических ран
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.