Методическая статья

Выделение и дифференциация стромальные клетки сосудов в бежевый / Brite клетки

38.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50191

⸱

28 марта 2013 г.

 ,  , 
1UCSF Diabetes Center and Department of Cell and Tissue Biology, University of California, San Francisco , 2Department of Biology, University of Copenhagen, Denmark, 3National Institute of Nutrition and Seafood Research, Bergen, Norway

В этой статье

Краткое содержание

Первичные белые преадипоциты изолированы от белого жировой ткани у мышей, могут быть дифференцированы в бежевый / Brite клеток. Представленные здесь является надежной системы сотовой модель для изучения молекулярных регулировании "Браунинг" белый жир.

Аннотация

Браун адипоциты имеют возможность отделить дыхательной цепи митохондрий и рассеивать химическую энергию в виде тепла. Развитие UCP1-положительных коричневый адипоцитов в белой жировой ткани (так называемый бежевый или Brite клеток) очень индуцированных различными сигналами окружающей среды, таких как хроническая холода или PPAR-агонистов, поэтому этот тип клеток имеет потенциал в качестве терапевтической мишени для лечения ожирения. Хотя большинство увековечили линий адипоцитов не может повторять процесс "Браунинг" белый жир в области культуры, основной адипоцитов изолированы от стромальных сосудистой фракции в подкожной жировой ткани белого (WAT) обеспечивают надежное сотовой системы для изучения молекулярного контроля бежевый / Brite развития клеток . Здесь мы опишем протокол для эффективной изоляции первичной преадипоциты и для индукции дифференцировки бежевый / Brite клеток в культуре. Эффект потемнения может быть оценена по выражению бурого жира-селективные маркиERS, таких как UCP1.

Введение

Ожирение является резко возрастает во всем мире и в настоящее время считается одной из наиболее серьезных проблем общественного здравоохранения 1. Это условие связано с дисбалансом энергии относительного потребления в расходах и в результате избыточная энергия хранится в виде липидов в белой жировой ткани (WAT). Расширенное WAT связана с повышенной массой тела и вес, а бурой жировой ткани обладает способностью рассеивать избыток энергии для производства тепла. Поэтому BAT может функционировать в качестве защиты от холодного и ожирением 2,3. Это достигается путем разобщения транспорта электронов в митохондриях на разобщение белков 1 (UCP1). Этот белок считается признаком для nonshivering термогенеза в BAT 3. Некоторые исследования последних лет показали, что взрослые люди имеют функциональные BAT 4-8 и, следовательно, манипуляции BAT у людей может быть потенциальным терапевтическим вмешательством в борьбе против ожирения и связанных с ним заболеваний.

jove_content "> Текущие данные показывают, что два вида бурых адипоцитов существуют у грызунов;« классических »или« уже существующих "коричневый жир развивается во внутриутробном этапе и образует посвященный коричневые жировые депо в межлопаточной области и других периферических тканях с другой стороны. , "индуцибельной" формы бурого жира (так называемый Brite или бежевый клеток) развивается в течение послеродового сцене и появляется перемежаются в белой жировой ткани. двух видов бурых адипоцитов также разделяются по разным развитием происхождение. то время как ранее существовавшие коричневый адипоцитов возникают из myoblastsic типа Myf5 прекурсоров, индуцируемый Brite / бежевый клетки перемежаются в WAT возникают из не-Myf5 линии 9,10. Кроме того, регуляторные пути этого типа клеток, вероятно, будет отличаться от Myf5 полученных коричневый адипоциты 11. развития бежевый клеток (например, "Браунинг" белый жир) может быть активирован в ответ на хроническое воздействие холодного иβ3-адренорецепторов-агонисты или агонисты PPAR-гамма у взрослых 12-14. Бежевый / Brite клеток, вероятно, будут перспективные терапевтические мишени для манипуляции общий энергетический баланс и потенциально может стать частью лечения ожирения и, следовательно, важно понять точные молекулярные механизмы и сигнальные пути, с помощью которых сигналами окружающей среды контролируют развитие бежевый клеток.

Чтобы понять молекулярный контроль поджаривания белого жира, в пробирке эксперименты лучше всего подходит в качестве дифференциации преадипоциты проходит довольно асинхронно, и трудно обнаружить клетки на месте 15. Хотя исследования по развитию адипоцитов до сих пор были выполнены в основном на клеточных линиях, таких как 3T3-L1, 3T3-F442A или HIB1, эти клеточные линии, по всей видимости, имеют молекулярную подпись бежевый клеток. С другой стороны, первичные адипоцитов изолированы от подкожного WAT, скорее всего, повторять процессорыс подрумянивания жира белого в камере автономно. Здесь мы предлагаем протокола для эффективной изоляции стромальных-сосудистой фракции из жировой ткани и вызывая потемнение жира белых в ответ на PPAR-агонистов. Розиглитазона было показано, что особенно эффективным посредником потемнения в этих клетках. Как ранее предложил 16, эта система сотовой связи может использоваться, чтобы служить надежной системы сотовой связи для изучения развития бежевый / Brite клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка пищеварения Средний

Сделайте 5 мл на 5 мышей на ткани (примерно 1 мл / 1 г жировой ткани).

  1. Взвешивание в пищеварении ферменты:
    - Collaginase D: 1,5 Ед / мл (1108874103, 1 г, Roche, 70334223)
    - Диспазы II: 2,4 Ед / мл (04942078001, 0980 мг / Лио, Roche, 11466200)
  2. Добавить 25 мл PBS и хорошо перемешать для растворения
  3. Добавить CaCl 2 незадолго до переваривания ткани в конечной концентрации 10 мМ

2. Проанализируйте жировой ткани мышей

  1. Препарирование должно проводиться осторожно, и сразу же после мышей (6-8 недель) приносятся в жертву. Работа стерильные с этанолом распыляется на мышь мех перед его открытием. Поместить ткань непосредственно в чистом PBS, отдельные межлопаточной BAT и подкожной паховых WAT.
  2. Для межлопаточной BAT: у мышей, размещенные в задней стороной вверх, разрезают вдоль спины и всю дорогу до шеи. Коричневыйжировой ткани можно найти прямо под кожу между лопатками (межлопаточной). BAT можно рассматривать как две лопасти, форме бабочки. Тонкий слой белого жира покрытие BAT должны быть тщательно удалены.
  3. Для подкожного WAT (паховые WAT): снимите кожу. Паховая WAT находится непосредственно под кожей с обеих сторон, начиная чуть ли не на спину и собираются вместе, внутренней стороне бедер и вниз в сторону яичка.

3. Вырезать и дайджест жировой ткани

  1. Быстро удаляет все загрязнения, как волосы, скелетные мышцы и соединительную ткань от ткани разделов.
  2. Сухой ткани быстро на бумаге, чтобы не разбавлять рассечение среды с PBS и разместить его на сухую пластину.
  3. Добавить пищеварения среды (добавлено CaCl 2 до пищеварение) и пропустить через мясорубку ткани на мелкие кусочки. Перемешать очень хорошо с помощью пипетки вверх и вниз с 5 мл пипетки. Передача фарш тканей в 50 мл пробирки с остальными пищеварения мedium, перемешать еще больше с помощью пипетки вверх и вниз.
  4. Digest в 37 ° C при постоянном перемешивании при 150 оборотов в минуту в течение 40-50 мин. Проверять каждые 10-15 минут, чтобы убедиться, пищеварение идет хорошо, и для предотвращения чрезмерного пищеварения.

Примечание: Правильное пищеварение и среднего времени важны. Ткань должна быть хорошо усваивается, но избыток пищеварения может привести к повреждению клеток.

4. Фильтр клеточной суспензии

  1. Остановить пищеварения, добавив 5 мл полной среды (DMEM/F12, содержащий 10% FPS и P / S). Клетки должны быть почти полностью однородным. Тщательно перемешать с помощью пипетки.
  2. Центрифуга при 700 х г в течение 10 мин.
  3. SVF теперь можно увидеть, как коричневатый осадок на дне пробирки. Аспирируйте жирных зрелых адипоцитов слой и большая часть жидкости слой - сохранить осадок и растворяют его в 10 мл полной среды. Все хорошо перемешать.
  4. Поместите ячейки фильтра (50-70 мкм в диаметре) на новый 50 мл трубки и фильтрации суспензии клеток.

5. Плита клетки

  1. Передача клеточной суспензии в 15 мл трубки и центрифуги при 700 х г в течение 10 мин.
  2. Аспирируйте среднего и вновь приостановить гранул в 10 мл полной среды. Внесите и хорошо перемешать.
  3. Оцените, во сколько пластин не требуется. Это может варьироваться и зависит от размера гранул. Общее правило состоит в 2 из 10 см плиты из 5 мышей на паховых WAT и одного 10 см пластина для BAT.
  4. Пластина клеток на блюдах коллагена покрытием (R & D) в полной среде
  5. 1-2 ч после посева клеток, аспират среды, промыть PBS в два раза и добавляют свежую среду. Этот шаг важен, так как это может удалять эффект красных кровяных клеток, иммунных клеток и других загрязнений.

6. Дифференцировать клетки

  1. Сделать обслуживания и индукция среды.

Техническое обслуживание среде

Полной среде с добавлением:

ных "> Инсулин, окончательное конц. 5 мкг / мл (5 мг / мл акции, *** 100 мкл уксусной кислоты в 10 мл H 2 O для подготовки подкисленной водой рН 2,5. растворяться инсулина в подкисленной воде. магазина складе -20 ° C)

3,3 ',5-трийод-L-тиронина (T3), конечная концентрация. 1 нМ (10 мкМ акции, *** растворяются T3 в 1N NaOH и добавляют среде, чтобы сделать 10 мкМ акций. Sigma кошки # T-2877)

Хранить при температуре 4 ° С, хорошо в течение одной недели

Индукционная среде

Техническое обслуживание среде, содержащей следующие соединения:

Индометацин, конечная концентрация. 125 мкМ (0,125 M складе в этаноле, Sigma кошки # I-7378). Индометацин должна быть нагрета до 60 ° C, чтобы быть распущен.

Дексаметазон, конечная концентрация. 2 мкг / мл (2 мг / мл носок в этаноле, Sigma Cat # D-1756)
3-изобутил-1-метилксантина (IBMX), конечная концентрация. 0,5 мм (0,25 M складе в ДМСО, Sigma кошки # I-5879)
Розиглитазон, конечная концентрация. 0,5 мкМ(10 мМ в ДМСО, Sigma Cat # R-2408)

Примечание: Убедитесь, свежие индукционной среде каждый раз.

  1. Расти первичных адипоцитов до 95-97% слияния в полной среде (приток, но не слишком упаковке)
  2. Изменение регулярных полной среде с индукцией среда (день 0)
  3. После 48 часов (день 2), изменение средних и обслуживание среды с росиглитазоном (0,5 мкм)
  4. После дополнительных 48 часов (день 4), изменения в свежую среду, обеспечение розиглитазон (1 мкМ) в течение еще 2-3 дней. 6-7 дней после добавления индукции среды, клетки полностью дифференцированы в зрелых жировых клеток и заполнены капель масла. Капли появится около 3-4 дней после индукции.

Примечание: Изменение средних каждые 2-3 дня, пока клетки полностью дифференцирована.

Клетки теперь могут быть собраны и экспрессию мРНК UCP1 и Кетег коричневого адипоцитов-специфических генов можно измерить с помощью QRT-PCR. Вестерн-блот будет использоваться для обнаружения белков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Браунинг первичных адипоцитов можно получить, измерив экспрессию мРНК UCP1 и других бурого жира или конкретной селективной генов QRT-PCR. Представленные на рисунке 1 данных генной экспрессии в паховой WAT-производных первичных адипоцитов. Клетки индуцировать дифференцировку в присутствии двух различных доз розиглитазона на 50 нм и 500 нм, соответственно. Подмножество клеток обрабатывают форсколина при 10 мкМ в течение 4 ч до сбора урожая. Это приведет к циклической АМФ (цАМФ) в клетках и активи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы представляем надежные системы сотовой связи для изучения развития бежевый / Brite клеток в первичной культуре адипоцитов у мышей. По сравнению с несколькими доступными увековечили клеточных линий, эта система, вероятно, обладают повышенной отношение к потемнению белый жир в естественных условиях.

Хотя изучение этих первичных адипоцитов дает некоторые преимущества, существуют и некоторые ограничения и проблемы, которые важно учитывать. Во-первых, эта система сильно зависит о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Харуя Оно, Kosaku Шинода, Louis Sharp, Эми Tomoda, и Лорен Ruiz для обсуждения, техническую помощь и помощь в редактировании по рукописи. Эта работа была поддержана грантами NIH (DK087853), с Программой Прорыв биомедицинских исследований и от Asubio Фарм Инк Скула была поддержана доля стипендии PhD из Университета Копенгагена и ЕС FP7 проекта Diabat (ЗДОРОВЬЕ-F2 -2011-278373), чтобы Лиза Мэдсен и Карстен Кристиансен. Мы также признаем, DERC центр гранта (NIH P30 DK063720).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реагент
Collaginase D Roche 11088874103
Диспазы II Roche 04942078001
CaCl 2
DMEM среде Рыбак 10017-CV С 2,5 г / л, глюкоза и L-глютамин без пирувата натрия
Инсулин
T3 (3,3 ',5-трийод-L-тиронина) Сигма T-2877
Индометацин Сигма I-7378
Дексаметазон Сигма D-1756
IBMX Сигма I-5879
Розиглитазон Сигма R-2408
Оборудование
Коллаген покрытием блюд BD 354450 10 пластин см
70 мкм фильтр BD Falcon 352350 Сотовый фильтр, 70 мкм нейлон 1/ea

Ссылки

  1. Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects. American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).
  2. Rothwell, N. J., Stock, M. J. Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat. The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A(1979).
  3. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  4. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).
  5. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).
  6. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).
  7. Zingaretti, M. C., et al. The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).
  8. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
  9. Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454, 961-967 (2008).
  10. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).
  11. Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat. Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).
  12. Klingenspor, M. Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis. Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).
  13. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).
  14. Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).
  15. Hansen, J. B., Kristiansen, K. Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation. The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).
  16. Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).
  17. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).
  18. Cinti, S. Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).
  19. Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).
  20. Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).
  21. Rong, J. X., et al. Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone. Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).
  22. Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).
  23. Sell, H., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).
  24. Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice. Diabetes. 49, 759-767 (2000).
  25. Vernochet, C., et al. C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists. Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).
  26. Tai, T. A., et al. Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).
  27. Sugii, S., et al. PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

UCP1RT PCRRO

Похожие статьи