Измерение Катионит транспорта по Na, K и H, K-АТФазы<em&gt; Xenopus</em&gt; Ооцитов методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии: Альтернатива радиоизотопных Анализы

Краткое содержание

Мы описываем метод количественной оценки активности K⁺-контртранспортирующих АТФаз P-типа путем гетерологичной экспрессии ферментов в ооцитах Xenopus и измерения поглощения Rb⁺ или Li⁺ отдельными клетками с помощью атомно-абсорбционной спектрофотометрии. Этот метод является чувствительной и безопасной альтернативой экспериментам с радиоизотопным потоком, облегчающей сложные кинетические исследования.

Аннотация

В то время как перенос катионов электрогенным мембранным транспортером Na⁺,K⁺-АТФазой может быть измерен электрофизиологией, электронейтрально действующую желудочную H⁺,K⁺-АТФазу исследовать сложнее. Во многих транспортных анализах используются радиоизотопы для достижения достаточного соотношения сигнал/шум, однако необходимые меры безопасности накладывают строгие ограничения в отношении воздействия на человека или дизайна анализа. Кроме того, транспорт ионов через клеточные мембраны в решающей степени зависит от мембранного потенциала, который не контролируется непосредственно в клеточной культуре или в препаратах протеолипосом. Здесь мы используем выдающуюся чувствительность атомно-абсорбционной спектрофотометрии (ААС) к следовым количествам химических элементов для измерения транспорта Rb⁺ или Li⁺ Na⁺,K⁺- или желудочной H⁺,K⁺-АТФазой в одиночных клетках. Используя ооциты Xenopus в качестве системы экспрессии, мы определяем количество Rb⁺ (Li⁺), транспортируемого в клетки, путем измерения образцов гомогенатов одиночных ооцитов в устройстве AAS, оснащенном печью с поперечно нагреваемым графитовым распылителем (THGA), которое загружается из автосамплера. Поскольку фон неспецифического поглощения Rb⁺ контрольными ооцитами или при применении АТФазоспецифических ингибиторов очень мал, можно реализовать сложные схемы кинетического анализа с использованием большого количества экспериментальных условий одновременно или с высокой точностью сравнить транспортную способность и кинетику сайт-специфически мутировавших транспортеров. Кроме того, поскольку поглощение катионов определяется на отдельных элементах, эксперименты с потоком могут проводиться в сочетании с двухэлектродным зажимом напряжения (TEVC) для достижения точного контроля мембранного потенциала и тока. Это позволило, например, количественно определить стехиометрию транспорта 3Na⁺/2K⁺ Na⁺,K⁺-АТФазы и впервые позволило исследовать зависимость транспорта катионов от напряжения электронейтрально действующей желудочной H⁺,K⁺-АТФазой. В принципе, этот анализ не ограничивается К⁺-транспортирующими мембранными белками, но он может одинаково хорошо работать для изучения активности переносчиков тяжелых или переходных металлов или поглощения химических элементов эндоцитотическими процессами.

Введение

Мы хотели разработать чувствительную, безопасную и недорогую альтернативу экспериментам с радиоактивными индикаторами для исследования специфической транспортной активности мембранных белков, транслоцирующих ионы, чтобы обойти ограничения относительно доступа к изотопным лабораториям, требований безопасности или использования дорогостоящих радиоизотопов, которые, как и в случае с литием, могут быть даже недоступны из-за чрезвычайно короткого времени распада. Мы были особенно заинтересованы в определении активности электронейтрально действующей желудочной H⁺,K⁺-АТФазы, поскольку фермент не генерирует ток и поэтому его активность не может быть устранена электрофизиологическими методами. Поскольку Na⁺,K⁺- и H⁺,K⁺-АТФаза транспортируют Rb⁺ так же эффективно, как K⁺ (а также Li⁺), высокая чувствительность метода ААС для рубидия или лития должна способствовать чувствительному детектированию транспортной активности. Атомно-абсорбционные спектрофотометры являются распространенными аналитическими приборами, которые широко распространены в химических лабораториях и должны быть доступны большому количеству заинтересованных ученых. Кроме того, мы хотели воспользоваться преимуществами системы экспрессии ооцитов Xenopus, в которой используются большие одиночные клетки (около 1,0-1,5 мм в диаметре), что позволяет достичь удивительно низкой межклеточной вариабельности уровня экспрессии белка в пределах одной партии. Простой расчет демонстрирует осуществимость анализа AAS: предел обнаружения (характеристическая масса) для рубидия с помощью метода THGA-AAS составляет 10 пг или 1,2·^10-13 моль (Rb: 85,47 г/моль), для лития 5,5 пг или 7,9·^10-13 моль (Li: 6,94 г/моль). При гетерологичной экспрессии Na⁺,K⁺-АТФазы в ооцитах Xenopus могут быть достигнуты токи накачки в 100 нА (что составляет около 6,2·1011 элементарных зарядов в секунду, или 1,03·^10-12 моль ^с-1), что приводит к переносу 6·^10-6 С заряда в течение 1 мин. Поскольку перенос одного результирующего заряда соответствует поглощению двух ионов Rb⁺ (благодаря стехиометрии 3Na⁺/2K⁺), ток 100 нА в течение 1 мин соответствует поглощению 1,2·^10-10 моль Rb⁺. Таким образом, даже при 1000-кратном разведении (гомогенизации ооцита объемом около 1 мкл в 1 мл воды) типичный образец THGA-AAS (20 мкл) содержит 2,4·^10-12 моль Rb⁺ (или 204 пг), что значительно превышает порог обнаружения. Таким образом, даже транспортеры с более чем в 100 раз меньшей транспортной активностью или экспрессией плазматической мембраны могут быть проанализированы с помощью этого метода путем соответствующей регулировки времени потока в эксперименте.

Поскольку скорость откачки чувствительно зависит от температуры (типичные энергии активации для Na⁺,K⁺-АТФазы находятся в диапазоне от 90 кДж/моль до 130 кДж/моль^1-3, что приводит к увеличению скорости вращения примерно на 30% при изменении с 20 °C до 22 °C), необходимо проводить измерения потока при точном контроле температуры (кондиционирование воздуха) с хорошо сбалансированными буферными растворами. Кроме того, ооциты должны быть тщательно отобраны с учетом однородного размера для экспрессии ионного транспортера. С помощью этих мер предосторожности можно регулярно достигать экспериментальных стандартных ошибок менее 10 процентов при использовании примерно 10 клеток в каждом экспериментальном состоянии. Используя эту методику, мы смогли определить, например, кажущееся сродство Rb⁺ транспорта катионов^4-6, влияние вне- и внутриклеточного pH⁷ и влияние мутаций остатков, участвующих в координации катионов во время транспорта^4,8. Преимущество метода заключается в том, что ионные потоки также могут быть определены в сочетании с двухэлектродним напряжением зажима ооцитов, что, с одной стороны, обеспечивает точный контроль мембранного потенциала во время транспортировки, а с другой стороны, позволяет коррелировать ионный поток с мембранным током. Таким образом, удалось верифицировать стехиометрию 3Na⁺/2K⁺ Na⁺,K⁺-АТФазы (см. примерные результаты ниже) и определить зависимость от напряжения катионного транспорта желудочной H⁺/K⁺-АТФазы⁷.

Протокол

1. кДНК-конструкции и экспрессия белков в ооцитах Xenopus

кДНК интересующего мембранного белка следует клонировать в вектор, подходящий для экспрессии в ооцитах Xenopus laevis, такой как pTLN⁹ или pcDNA3.1X¹⁰. Такие оптимизированные векторы содержат 5'- и 3'-нетранслируемые области (UTR) гена β-глобина Xenopus laevis, фланкирующие полилинкер (MCS), последовательность промотора РНК-полимеразы (pTLN: SP6, pcDNA3.1X: T7), расположенную перед 5' UTR, поли-А-хвост в 3'-направлении от MCS для обеспечения стабильности кРНК в клетках, а далее по течению — еще одну последовательность сайтов рестрикции для однократного разрезания эндонуклеазами с целью линеаризации плазмиды для использования в качестве матрицы при транскрипции кРНК in vitro.

Чтобы отличить активность сверхэкспрессированной человеческой Na⁺/K⁺-АТФазы (α₂-субъединица + β₁-субъединица) от эндогенной Na⁺/K⁺-АТФазы ооцитов, были введены мутации Q116R и N127D для получения ouabain-резистентного белка с IC50 в миллимолярном диапазоне¹¹. В случае H⁺/K⁺-АТФазы измерения потоков проводились с использованием мутанта S806C α-субъединицы H⁺/K⁺-АТФазы, поскольку потоки Rb⁺ коррелировали с кинетическими данными экспериментов по флуоресцентному вольт-клемпированию (VCF). Метод VCF (https://www.jove.com/video/2627/ examining-the-conformational-dynamics-of-membrane-proteins-in-situ-with-site-directed-fluo rescence-labeling)¹² основан на сайт-специфическом присоединении флуорофора к стратегически введенному остатку цистеина, который регистрирует конформационные изменения фермента.

2. Линеаризация и очистка матрицы ДНК

1. Для линеаризации матрицы ДНК проведите рестрикцию 3 μg плазмидной ДНК в реакционной смеси объемом 50 μl, добавив 5 μl 10-кратного буфера, соответствующего рестриктазе, и 10 U рестриктазы; инкубируйте в течение 1 ч при 37 °C.
2. Очистите линеаризованную ДНК с помощью набора High-Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science). Сначала добавьте 350 μl связывающего буфера (содержащего гуанидин-изотиоцианат) в пробирку с продуктом рестрикции. После этого этапа очистки линеаризованная матрица ДНК приобретает статус «RNA grade» (подходит для работы с РНК), так как гуанидин-изотиоцианат является эффективным денатуратором белков и разрушает, в частности, РНКазы, которые часто становятся загрязнителем в молекулярно-биологических лабораториях.
3. Установите спин-колонки в коллекторные пробирки, нанесите на колонку раствор ДНК из этапа 2, центрифугируйте при 13,000 x g в течение 30 сек и слейте фильтрат.
4. Добавьте в колонку 500 μl промывочного буфера. Центрифугируйте 1 мин при 13,000 x g и слейте фильтрат.
5. Добавьте в колонку 200 μl промывочного буфера. Центрифугируйте 1 мин при 13,000 x g для полного высушивания колонки.
6. Перенесите спин-колонку в чистую пробирку Eppendorf объемом 1.5 ml и добавьте в колонку 50 μl воды, свободной от нуклеаз (Ambion Product # AM9937). Элюируйте путем центрифугирования в течение 1 мин на максимальной скорости.
7. После элюции сконцентрируйте раствор, содержащий ДНК, примерно до 15 μl. Этот этап обеспечивает получение концентрации 0.5 μg линеаризованной ДНК в 3 μl, что является рекомендуемым значением для последующей реакции транскрипции цРНК in vitro.

3. Синтез кРНК in vitro

1. Выберите подходящий набор mMessage mMachine Kit (Ambion Product #1340, #1344) в соответствии с последовательностью промотора в плазмиде (SP6, T7). В общий объем реакции 10 μl добавьте 3 μl линеаризованной ДНК, полученной на предыдущем этапе, и 1 μl транскрипционного буфера к предварительно распределенным по пробиркам аликвотам смеси NTP-кэп по 5 μl. Предварительное распределение смеси NTP-кэп необходимо для того, чтобы избежать частых циклов замораживания-оттаивания, которые могут привести к деградации нуклеозидтрифосфатов. В завершение добавьте 1 μl соответствующей РНК-полимеразы, коротко перемешайте и отцентрифугируйте реакционную смесь.
2. Инкубируйте реакционную смесь от 1 до 2 ч при 37 °C. Время инкубации не должно превышать 2 ч, так как это может привести к снижению выхода или качества кРНК.
3. Добавьте 15 μl ледяного 3 M раствора LiCl из набора, 15 μl холодной воды, свободной от нуклеаз, коротко перемешайте (не используйте вортекс), коротко центрифугируйте образец при 11,000 x g в течение 10 сек и храните при -20 °C не менее 30 мин для осаждения кРНК.
4. Предварительно охладите центрифугу до 4 °C и после осаждения центрифугируйте образец в течение не менее 15 мин при 13,000 x g.
5. Осторожно и полностью удалите супернатант с светло-коричневого осадка на дне пробирки и добавьте 150 μl 70% этанола для РНК, охлажденного до -20 °C. Центрифугируйте при 4 °C в течение 5 мин при 13,000 x g.
6. Полностью удалите супернатант, коротко (1-2 мин) высушите оставшийся осадок кРНК в центрифужном испарителе (например, Eppendorf Concentrator модель 5301) при комнатной температуре.
7. Растворите осадок в 12 μl холодной воды, свободной от нуклеаз. ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Все последующие этапы следует проводить, храня образец кРНК на льду.
8. Определите концентрацию кРНК с помощью спектрофотометра (например, Eppendorf BioPhotometer).
9. Проверьте целостность кРНК методом электрофореза в агарозном геле. ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Эта перекрестная проверка необходима, так как даже частично деградированная РНК дает ненулевое поглощение в УФ-диапазоне. Для электрофореза кРНК используйте тщательно очищенную электрофоретическую камеру, заново заполненную буфером TAE, и свежеприготовленный 1% агарозный гель. При подозрении на загрязнение электрофоретической камеры или буфера РНКазами заполните камеру 0,1 M HCl на 1 ч для очистки и приготовьте буфер TAE с использованием воды, свободной от нуклеаз.
10. Храните кРНК при -20 °C до использования. кРНК может храниться при -20 °C не менее одного года.

4. Получение материала яичников самок Xenopus laevis путем частичной овариэктомии

Данный протокол был одобрен соответствующим государственным органом (Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin, Сенат Берлина, Германия).

1. Не кормите лягушку как минимум за 12 hr до операции, чтобы предотвратить рвоту.
2. Приготовьте раствор, растворив 2 g местного анестетика трикаина (MS-222) в 1 L воды с доведением pH до 7.0 с помощью 5 mM HEPES-буфера. ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: При работе с MS-222 всегда используйте нитриловые перчатки и готовьте раствор в вытяжном шкафу.
3. Погрузите лягушку в раствор трикаина (макс. 10 min) до тех пор, пока у животного не исчезнут рефлексы выпрямления. Чтобы проверить отсутствие реакции, попробуйте перевернуть лягушку на спину в руках и проследите за наличием защитных движений.
4. Извлеките лягушку из раствора трикаина вручную и промойте животное холодной водопроводной водой для удаления анестетика.
5. Поместите лягушку спиной на слой льда, покрытый влажным бумажным полотенцем, чтобы избежать повреждения кожи лягушки при прямом контакте со льдом. Кожа животного должна оставаться влажной на протяжении всей операции во избежание пересыхания. Размещение на льду продлевает время действия анестезии.
6. Сделайте небольшим острым хирургическим ножницами разрез в брюшной полости (длиной 8-10 mm) либо слева, либо справа от средней линии тела лягушки. ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить боковую линию. Последующие операции следует проводить поочередно с разных сторон для обеспечения полноценного восстановления тканей подлежащего яичника. Обычно необходимо проколоть три слоя тканей (наружную кожу, тонкий слой белой соединительной ткани — фасцию — и мышечный слой).
7. После вскрытия брюшной полости захватите части долей яичника тупым пинцетом и осторожно вытяните их наружу. В качестве ориентира, путем иссечения удалите около 3-5 cm ткани яичника. В случае повреждения мелких кровеносных сосудов и кровотечения прижмите место повреждения стерильным пластиковым стержнем или охладите его льдом до остановки кровотечения.
8. Хирургически зашейте разрез, используя прерывистый шов нитью 4.0 Ethicon Vicryl (Johnson & Johnson #V633H). Для наложения швов используйте хирургические инструменты и завяжите два или три отдельных узла вдоль разреза. ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Важно, чтобы каждый узел стягивал все три слоя тканей за один шаг.
9. После операции поместите лягушку в слегка наклоненный таз с водой (30 L), содержащий ровно столько воды, чтобы покрыть дно, при этом ноздри животного должны находиться выше уровня воды для обеспечения дыхания. В период пробуждения (около 1-2 hr) накройте животное влажным бумажным полотенцем, чтобы избежать пересыхания чувствительной кожи.
10. Когда животное снова станет активным, наполните таз водой и держите лягушку отдельно от других животных в течение 3-4 дней для мониторинга восстановления и заживления раны.
11. После операции воздержитесь от проведения последующих операций с лягушкой в течение как минимум 3 месяцев, чтобы обеспечить полное восстановление животного и тканей его яичников. В качестве ориентира, на каждой лягушке можно провести максимум 6-8 операций.

5. Ферментативное выделение отдельных ооцитов

1. Разрежьте материал яичников ножницами на мелкие части и перенесите ткань в раствор Рингера для ооцитов без Ca²⁺ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES, pH 7.4), содержащий коллагеназу (20 mg/ml, тип 1A из Clostridium hystolyticum, Sigma #C9891) и ингибитор трипсина (10 mg/ml, тип III-O из куриного белка, Sigma #T2011).
2. Осторожно встряхивайте раствор для переваривания в течение 2.5 hr при 18 °C. После этого контролируйте ход переваривания с интервалом в 15 min до тех пор, пока большинство ооцитов не отделятся от фолликулярной ткани.
3. Несколько раз промойте ооциты в пробирке Falcon объемом 50 ml с использованием раствора Рингера для ооцитов без Ca²⁺, пока раствор не очистится от остатков ткани.
4. Храните ооциты в растворе Рингера для ооцитов с Ca²⁺ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES, pH 7.4), содержащем гентамицин (50 μg/ml), при 18 °C.

6. Инъекция цРНК

1. Для экспрессии Na⁺,K⁺- или H⁺,K⁺-АТФазы введите в ооциты 50 nl раствора кРНК, содержащего 25 ng кРНК α-субъединицы и 5 ng кРНК β-субъединицы, используя электрический инъектор Nanoject II (Drummond Scientific Inc.) с гематокритными трубками 3,5" (Drummond #3 000-203-G/X). ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Количество мРНК может варьироваться в зависимости от целевого белка и может потребовать корректировки для достижения максимальной экспрессии, определяемой с помощью вестерн-блоттинга.
2. Для каждого условия потока (например, при определенной концентрации Rb⁺) проведите инъекции в 18–22 ооцита. Из них 50% будут анализироваться в условиях «+поток» (например, при данной концентрации Rb⁺), а 50% — в условиях «-поток» (например, при выбранной концентрации Rb⁺ и добавлении специфического ингибитора фермента в насыщающей концентрации, такого как 10 mM ouabain для Na⁺,K⁺-АТФазы или 10 μM SCH28080 при pH 5.5 для H⁺,K⁺-АТФазы)).
3. После инъекции перенесите ооциты по отдельности в 96-луночные планшеты, наполовину заполненные раствором Рингера для ооцитов, содержащим Ca²⁺ и 50 μg/ml гентамицина, при 18 °C.
4. Закройте 96-луночный планшет Parafilm для предотвращения избыточного испарения.
5. Инкубируйте ооциты в течение 2–7 дней (в зависимости от исследуемого белка) при 18 °C. Если требуется хранение ооцитов более 3 дней, рекомендуется заменять инкубационный буфер в микролунках каждые 3 дня.
6. Для каждого набора данных по потоку (например, при эксперименте по титрованию [Rb⁺]) следует проанализировать около 10 контрольных ооцитов, в которые не вводили кРНК (или вводили 50 nl воды, свободной от нуклеаз), в условиях «+поток» и «-поток». Таким образом, инкубируйте достаточное количество контрольных клеток аналогично ооцитам с введенной кРНК перед анализом потока.

Предварительная обработка ооцитов, экспрессирующих гетерологичную АТФазу

Процедура загрузки Na⁺

Для функциональных измерений Na⁺/K⁺-АТФазы важно повысить внутриклеточную концентрацию Na⁺¹³ следующим образом:

1. Перенесите ооциты в буфер для загрузки Na⁺ (110 mM NaCl, 2.5 mM Na-цитрата, 2.5 mM MOPS, 2.5 mM TRIS, pH 7.4) на 45 мин на льду.
2. Для последующего восстановления инкубируйте ооциты в буфере после загрузки «PLB» (100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 5 mM BaCl₂, 5 mM NiCl₂, 2.5 mM MOPS, 2.5 mM TRIS, pH 7.4) не менее 30 мин на льду.
3. Храните ооциты в PLB на льду до использования.

7. Предварительное блокирование эндогенной Na⁺,K⁺-АТФазы

ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Поскольку ооциты Xenopus экспрессируют эндогенную Na⁺,K⁺-АТФазу, перед экспериментами по потоку Rb⁺ важно заблокировать этот эндогенный насос следующим образом:

1. Теперь необходимо заблокировать эндогенную Na⁺,K⁺-АТФазу, инкубируя ооциты в буфере для стадии после загрузки (Post Loading Buffer), содержащем 100 μM ouabain, в течение 15 мин при комнатной температуре.

8. Электрофизиология

1. Изготовьте микроэлектроды путем вытягивания боросиликатных капилляров (GB150F-8P, Science Products GmbH) с помощью двухступенчатого вытягивателя микропипеток (Model PC-10, Narishige).
2. Заполните стеклянные электроды с тыльной стороны 3 M KCl. Для экспериментов с использованием двухэлектродного вольтамперного зажима (TEVC) с H⁺,K⁺-АТФазой рекомендуется вместо этого использовать 3M NaCl, что обеспечивает более стабильную запись тока. Установите пипетку над проволокой Ag/AgCl в держателях микроэлектродов установки TEVC.
3. Поместите в регистрирующую камеру (Warner Instr., model RC-10), предварительно заполненную измерительным буфером (например, PLB с 10 μM ouabain для Na⁺,K⁺-АТФазы), стеклянные микроэлектроды и два агаровых мостика (они должны быть изготовлены из NaCl/агара вместо обычно используемого KCl/агара), которые соединяют референтные электроды Ag/AgCl с раствором в камере.
4. Переведите усилитель вольтамперного зажима (Turbo TEC-10CX, NPI Electronics, Tamm, Germany) в режим «OFF».
5. Отдельно проверьте сопротивление каждого стеклянного электрода (оба должны находиться в диапазоне 0.5-2 MΩ).
6. Проверьте смещающие потенциалы электрода напряжения и электрода тока на соответствующем дисплее усилителя TEVC. В случае отклонения от нуля отрегулируйте смещение с помощью соответствующих регуляторов смещения усилителя.
7. Поместите ооцит в центр камеры и аккуратно проколите мембрану электродом тока и электродом напряжения.
8. Проверьте показания потенциала на усилителе. Значение потенциала электрода напряжения теперь соответствует значению потенциала покоя клетки.
9. Переключите усилитель в режим VC (voltage-clamp — вольтамперный зажим).
10. С помощью программного обеспечения pCLAMP (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) зафиксируйте мембранный потенциал клетки на заданном уровне. Это может быть либо значение ранее измеренного потенциала покоя (для записи в условиях нулевого мембранного тока), либо любое желаемое тестовое значение потенциала. Обратите внимание на амплитуду и стабильность тока утечки (в отсутствие K⁺/Rb⁺/Li⁺), который, согласно общему правилу, не должен превышать -200 nA при -30 mV.
11. Проводите перфузию ооцита в течение определенного времени (например, 3 мин для Na⁺,K⁺-АТФазы) раствором, содержащим Rb⁺ (для достижения максимального тока используйте насыщающие концентрации, определенные при измерении потоков в условиях без зажима), и регистрируйте ток помпы с помощью ПО pCLAMP в режиме непрерывной записи. Убедитесь, что поглощение Rb⁺ полностью прекратилось, проведя последующую перфузию клетки раствором без Rb⁺ в течение 30 сек.
    1. Остановите эксперимент с двухэлектродным вольтамперным зажимом, извлеките ооцит из регистрирующей камеры и перейдите к этапу промывки 4 раздела «Эксперименты по поглощению Rb⁺» для анализа поглощения Rb⁺ методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии.
12. Выполните вычитание тока смещения и рассчитайте временной интеграл тока помпы с помощью программы Clampfit из пакета pCLAMP.

9. Измерение поглощения Rb⁺

1. Отрежьте и оплавьте желтый наконечник дозатора объемом 200 μl до диаметра около 2 mm. Использование таких наконечников обеспечивает минимальный перенос раствора при перемещении ооцитов между чашками для инкубации или промывки. Кратковременно оплавьте кончик наконечника пламенем карманной зажигалки. Этот этап полировки предотвращает повреждение ооцитов.
2. Для каждого ооцита, подлежащего измерению, подготовьте пробирку Eppendorf объемом 1.5 ml, наполненную 1 ml воды Millipore. Подготовьте три чашки Петри с промывочным буфером, не содержащим Rb⁺ (например, PLB), и одну с водой Millipore.
3. Одновременно перенесите пять преинкубированных ооцитов в чашку Петри диаметром 3.5 cm, наполненную буфером для потока Rb⁺ (концентрации Rb⁺ от 0 до 15 mM), и инкубируйте в течение 3 min (для Na⁺,K⁺-ATPase) или 15 min (для H⁺,K⁺-ATPase) при контролируемой температуре (например, 21 °C в помещении с кондиционером или на нагревательной плитке).
4. Одновременно перенесите ооциты в первую чашку с промывочным буфером, не содержащим Rb⁺ (в случае Na⁺,K⁺-ATPase можно использовать PLB). Необходимо, чтобы отклонения между временами инкубации составляли менее 5 sec. Осторожно промойте.
5. Переместите ооциты во вторую и третью чашки с промывочным буфером, не содержащим Rb⁺, осторожно промойте.
6. Перенесите ооциты в чашку с водой Millipore, осторожно промойте.
7. Перенесите каждый ооцит индивидуально в одну из подготовленных пробирок Eppendorf, наполненных 1 ml воды Millipore.
8. Гомогенизируйте ооцит путем многократного пипетирования вверх-вниз наконечником дозатора объемом 200 μl до достижения однородной мутности раствора.

10. Подготовка AAnalyst 800 с использованием системы печи THGA

1. Откройте вентиль подачи необходимого инертного газа (аргона) и установите соответствующую лампу с полым катодом (одноэлементные ЛПК для Li⁺ или Rb⁺; Photron, Мельбурн, Австралия) в любой свободный разъем.
2. Запустите управляющее программное обеспечение WinLab32 (Perkin Elmer) и включите соответствующую лампу с полым катодом. Лампы с полым катодом Perkin Elmer Lumina распознаются автоматически и отображаются в списке выбора. Несовместимые лампы с полым катодом необходимо вводить вручную.
3. Дайте лампам прогреться в течение примерно 10-15 мин для достижения равновесного состояния.
4. С помощью визуального осмотра убедитесь в исправности трубки THGA (трубка графитового атомизатора с поперечным нагревом, Perkin Elmer, #B3000641). Печи THGA следует заменять каждые 300 измерений (средний срок службы, указанный производителем), однако они могут выдержать и большее количество образцов.
5. Выберите метод «THGA furnace» в WinLab32.
6. Подготовьте не менее пяти калибровочных образцов с концентрациями Rb⁺/Li⁺ от 10 до 50 μg/L (например, путем соответствующего разбавления раствора 1 M RbCl или LiCl) и одну холостую пробу, содержащую только воду Millipore. Примечание: соли должны быть максимально доступной чистоты («puriss.» или из имеющихся в продаже калибровочных стандартов для ААС).
7. Выберите подходящий файл инициализации (так называемый «файл метода», который содержит ссылку на параметры калибровки и загружает настройки прибора, например, длину волны детектирования ААС; длины волн для Rb⁺ и Li⁺ составляют 780 nm и 670.8 nm соответственно), затем введите позиции и концентрации калибровочных образцов. Для этого выберите соответствующий автосамплер (лоток для образцов с 88 или 148 позициями отбора для устройства AAnalyst 800).
8. Снимите калибровочную кривую.
9. Теперь перенесите каждый гомогенат ооцитов в отдельные полипропиленовые кюветы для образцов объемом 1.2 ml (Perkin Elmer, #B0510397) и поместите эти пробирки в лоток автосамплера.
10. Создайте файл с информацией об образцах для идентификации проб в позициях автосамплера, затем установите объем пробы 20 μl и запустите прибор.
11. После завершения серии измерений (или при визуальном контроле каждый час для длинных серий образцов) проверьте, нет ли проб, в которых измеренное количество Rb⁺ превышает максимум калибровочной кривой. В таком случае соответствующим образом разбавьте эти образцы и измерьте их повторно.

11. Примечания по измерению большого количества образцов (более 50)

• Для работы прибора в течение ночи рекомендуется заполнить резервуар автосамплера водой Millipore, чтобы предотвратить испарение гомогенатов в пробирках.
• Рекомендуется помещать через каждые 20 образцов пробирку с 2% HNO₃, чтобы предотвратить засорение инжекционного капилляра автосамплера.

Рекомендуемый температурный протокол ТГС-ААС для рубидия

Шаг	Температура (°C)	Время разгона (сек)	Время выдержки (сек)	Поток газа аргона (мл/мин)
Сушка 1	110	1	20	250
Сушка 2	130	5	30	250
Пиролиз	300-600	10	20	250
Атомизация	1700-1800	0	5	0
Очистка	2400	1	2	250

Рекомендуемый температурный протокол THGA-AAS для определения лития

Шаг	Температура (°C)	Время нарастания (сек)	Время выдержки (сек)	Расход газа аргона (мл/мин)
Сушка 1	110	1	30	250
Сухая обработка 2	130	15	30	250
Пиролиз	900	10	20	250
Атомизация	2200	0	5	0
Очистка	2450	1	3	250

Анализ данных

1. Для каждого условия измерения рассчитайте среднее поглощение Rb⁺. Спектрофотометр AAS выдает значения в μg/L, которые необходимо перевести в pmol/oocyte/min.
2. Для кинетического анализа (определения кажущихся значений KM) вычтите фоновое поглощение Rb⁺, определенное на контрольных неинъекционных ооцитах из той же партии при данной концентрации RbCl.
3. Постройте график в программном обеспечении Origin, применив к данным аппроксимацию по функции Хилла или Михаэлиса-Ментен . В этих уравнениях [S] — концентрация субстрата, nH — коэффициент Хилла, а K_0.5 — концентрация субстрата, необходимая для достижения половины максимальной активации.

Результаты

Количественное определение поглощения Rb⁺ K⁺- (или Rb⁺)-контртранспортерными P-типа АТФазами, экспрессируемыми с помощью AAS в системе экспрессии ооцитов Xenopus, позволяет достоверно определять кинетические параметры фермента.

Определение стехиометрии транспорта Na⁺/K⁺-АТФазы

Для электрогенной Na⁺/K⁺-АТФазы потоки Rb⁺ могут быть определены в экспериментах с использованием ...

Обсуждение

Описанный метод измерения количества Rb⁺ (или Li⁺), поглощенного отдельными ооцитами Xenopus , экспрессирующими Na⁺,K⁺- или H⁺,K⁺-АТФазу, оказался универсальным, гибким и точным методом определения кинетических или термодинамических параметров транспорта катион-контртранспортных АТФаз^{P-типа 1,4,5,7,8}. Он является безопасной и надежной альтернативой радиоактивным индикаторным потокам и позволяет решать большой объем экспериментальных зад...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
4.0 Ethicon Vicryl шовный материал	Johnson Johnson	V633H
Коллагеназа типа 1A от Clostridium hystolyticum	Sigma Aldrich	C9891
High-Pure PCR Product Purification Kit	Roche Applied Science	11732676001
Нуклеаза вода	Ambion	AM9937
mMessage mMachine Kit SP6/ T7	Ambion	1340, 1344
Октагидрат Уабаина	Sigma Aldrich	O3125
Трикаин (этил3-аминобензоат, метансульфонатная соль)	Sigma Aldrich	A5040
Ингибитор трипсина типа III-O из белка куриного яйца	Sigma Aldrich	T2011
SCH28080	Sigma Aldrich	S4443
AAnalyst 800	Perkin Elmer	0993-5256
WinLab32TM	Perkin Elmer
BioPhotometer	Eppendorf	6131 000.012
Боросиликатные капилляры	Научные продукты	GB150F-8P
Гематокритные трубки 3,5	"Drummond Scientific	3 000-203-G/X
Полая катодная лампа Литиевый	фотрон	P929LL
Лампа с полым катодом Рубидиевый	фотрон	P945
Съемник микропипеток	Narishige	Model PC-10
Камера записи ооцитов RC-10	Warner Instr.	W4 64-0306
Насос впрыска Nanoject II	Drummond Scientific	3-000-204
программное обеспечение pCLAMP	Молекулярные устройства
Чашка для образцов полипропилена (1,2 мл)	Perkin Elmer	B0510397
Speedvac - концентратор модель 5301	Eppendorf	5301 000.210
THGA Tube	Perkin Elmer	B3000641
Усилитель Turbo TEC-10CX	NPI Electronics	TEC-10CX