Методическая статья

Ангиогенеза в ишемизированных легких крысы

15.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50217

⸱

8 февраля 2013 г.

 , 
1Johns Hopkins Asthma and Allergy Center, Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University

В этой статье

Краткое содержание

Перфузии легких как системное бронхиальной артерии и легочных артерий. В большинстве патологий легких, это меньше системных сосудистой, который показывает надежную неоваскуляризации. Прекращение легочного кровотока способствует оживленной бронхиальной ангиогенеза. Мы предоставляем хирургические подробности вызывать левой легочной артерии ишемия, которая способствует бронхиальной неоваскуляризации.

Аннотация

Взрослый легких перфузировались как системный бронхиальной артерии и весь венозного возврата, протекающей через легочные артерии. В большинстве патологий легких, это меньше системных сосудистой, который реагирует на необходимость усиления перфузии легкого и показывает надежную неоваскуляризации. Легочной сосудистой ишемии при легочной артерии препятствие было показано, что приводит к быстрой системной артериальной ангиогенеза у человека, а также в нескольких моделях животных. Несмотря на то, гистологические оценки времени течения бронхиальной распространения артерии у крыс, была тщательно описывается Weibel 1, механизмов, ответственных за этим организованного роста новых кровеносных не ясны. Мы предоставляем хирургические подробности вызывать левой легочной артерии ишемия у крыс, что приводит к бронхиальной неоваскуляризации. Количественная оценка степени ангиогенез представляет собой дополнительную проблему в связи с наличием двух сосудистого русла в легких. Методикадля определения функциональных ангиогенеза на основе меченых инъекции микросфер предоставляются.

Введение

Системная ангиогенеза в легких хорошо распознаются. В болезненных состояний, таких как астма 2, интерстициальный легочный фиброз 3, рак 4 и хронической легочной тромбоэмболии 5, системной сосудистой и окружающих в легких разрастается и проникает в легочную паренхиму. Тем не менее, животных моделей для изучения этого дифференциальной активации системной, а не в малом круге кровообращения мало. Возможно, наиболее воспроизводимые модели системной неоваскуляризации в легких у взрослых млекопитающих, это то, что происходит после индукции хронической легочной артерии ишемия. Ответ на левой легочной артерии препятствия в организме человека 5-7, собакам 8, 9 свиней, овец 10, 11 морских свинок, крыс 1, 12, 13, 14 и мышей является быстрое распространение бронхиальной артерии, а также межреберных артерий. Механизмы, ответственные за системными neovasculariзации легких после легочного ишемии в значительной степени неизвестны и не были широко изучены. Время течения бронхиальной ангиогенеза у крыс после левой легочной артерии препятствия были тщательно описаны в гистологической работы Weibel 1. Продолжая эту работу в крысу, наша лаборатория была сосредоточена на обоих факторов роста важно в этом процессе, а также физиологический результат этого сосудистой в легких. Результаты показывают, хемокинов CXC главком-3 повышается в ранние сроки после ишемии и лечение крыс с нейтрализующих антител к CXCR2, рецептор для главком-3, ослабляет ангиогенеза 13. Вновь созданная бронхиальной сосудистую 14 дней после начала ишемии легочной было показано, что ненормальное со значительным увеличением белка проницаемостью 15. Левая функции легких не было нормального показателя снизилось диффузионной способности и уменьшение объема легких 15. Хотя сосудистой может иметь сотрудничествоntributed с сохранением ткани легких при хронических легочных ишемии, кажется, не быть нормальным и может внести свой вклад в устойчивое снижение легочной функции.

Возможно, одним из наиболее любопытных аспектов этой модели связан с пространственным распределением пролиферирующих кровеносных сосудов. Несмотря на высвобождение факторов роста в легочной паренхимы в связи с ишемией, сосудистой происходит в относительно больших вверх по течению бронхиальной артерии. Нормальная бронхиальной артерии возникает небольшое ответвление от аорты и поражает дыхательные пути дерево на киль. Таким образом, механизм, с помощью которого факторы роста вызывают на начальном этапе arteriogenesis не ясно. Мы полагаем, что крысы, с сосудистой анатомии похожи на людей, предоставляет уникальную возможность изучить механизмы, ответственные за системный ангиогенез при легочных ишемии. Хотя полной обструкции левой легочной артерии является редким явлением у человека,увеличилась бронхиальной васкуляризации по-видимому, аналогичным индуцированных у пациентов независимо от места и размера легочной артерии препятствия 16. Таким образом, мы предоставляем подробное описание хирургический подход для лигирования левой легочной артерии у крыс и средства для количественной оценки величины ангиогенеза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все протоколы на крысах были одобрены Университета Джонса Хопкинса уходу и использованию животных комитета и в соответствии с руководящими принципами NIH. Всякий раз, когда это возможно, животное должно быть хирургически нацелен на площади отдельно от хирургической области, чтобы свести к минимуму загрязнение хирургической сайта.

1. Анестезии / анальгезии

  1. Место крыс (Sprague Dawley крыс-самцов, 125-150 г; Harlan, Indianapolis, IN) в индукционной камере переплетаются с 3% изофлурана.
  2. Место под наркозом крыса по хирургии плате прилагается к носовым обтекателем и вентилятор с 3% изофлурана анестезии. Используйте стерильную технику для всех процедур. Пелерина крысы для обеспечения стерильной операционной поле.

2. Интубация

  1. Остановите придатков в положении лежа на спине с помощью хирургического ленты.
  2. Удалить крысы из носового конуса, расширять язык с мягким пинцетом.
  3. Используйте 14 калибра intracath с притупленной Stilet металла в качестве руководства. Слайд позади, чтобыngue, в трахею.
  4. Удалите металлические Stilet оставляя белого пластика intracath в трахею. Убедитесь, что крыса дышит и воздуха, протекающего через трубку.
  5. Заменить носового конуса с прямым адаптером для катетера, подключить крысы вентилятор (90 вдохов / мин, 8 мл / кг дыхательного объема; грызунов Вентилятор модели 683, Harvard Apparatus, Holliston, штат Массачусетс).
  6. Применить Puralube (Butler Schein, Дублин, Огайо) ветеринарные мази на глаза.

3. Торакотомия

  1. Место крысы правой стороной вниз, обездвижить придатков использованием хирургической лентой.
  2. Бритье левой части грудной клетки стороне.
  3. Удалить лишнюю шерсть с небольшой вакуум.
  4. Сделать стерильные поля протирки спиртом следует повидон-йод swabstick (Dynarex Corporation, Orangebur, Нью-Йорк). Повторите эту процедуру еще два раза (всего три скрабы).
  5. Сделайте поперечный разрез стерильными ножницами рассекает или стерильным скальпелем в центре поля.
  6. Blunt рассекают через лАйерс ткани и жира до ребра (последний слой тонкий мембрана, покрывающая ребра).
  7. Граф ребра, чтобы определить 3-го межреберья.
  8. Использование стерильного 45 ° Грефе щипцы, тупые сделать разрез между 3-м и 4-го ребра.
  9. Вставьте ребра сепараторов, осторожно потяните создания открытых недействительным с полной визуализацией легких, место ленту на швы, чтобы держать открытыми.

4. Левая легочная артерия Лигирование

  1. При 90 ° щипцы Грефе, переместить левого легкого назад с правой рукой.
  2. Использование Дюмон шаблон № 5 прямые щипцы, захватить левой легочной артерии и дыхательных путей с левой рукой. Левая легочная артерия будет лежать на верхней части дыхательных путей. Убедитесь, что щипцы прямо перпендикулярно столу. Кроме того, он является наиболее эффективным, чтобы поднять левую легочную артерию / левый бронх mainstem на самом дистальном положении (ближе к паренхиме). Нажмите вентиляционных левого легкого в сторону с этой левой рукой маневра.
  3. Использовать Дюмонобразец # 5 45 ° изогнутый пинцет для разделения левой легочной артерии от левого бронха mainstem в своих естественных границ. Это разделение линия появляется тонкая и белая между двумя отдельными структурами.
  4. Отделить непосредственно под артерией, минуя судна; плавно скользить щипцы советы скрепленных по разделению.
  5. Продолжайте, пока кончики щипцов были явно отделены левой легочной артерии и левый бронх mainstem. Лишь небольшая точка наконечник должен быть полностью до конца. Если в крови могут быть визуализированы на кончике пинцета, то это не в полной мере до конца и перевязки не должна быть предпринята. Как только сквозь пространство, левую легочную артерию будет лежать на кривой щипцов. Удерживать в таком положении.
  6. Осторожно освободить прямо тупым пинцетом сцепление (левая рука) и захватить кусок нарезанные шва (~ 2-3 дюймов; полипропилена шов размером 6-0; Myco медицинская, Cary, NC).
  7. Откройте изогнутые щипцы прижимая левую легочную артерию и гРаб шва. Осторожно потяните шва в пространстве между левой легочной артерии и левого бронха mainstem в движении вверх по отношению к кривой щипцов.
  8. Привяжите окклюзии левой легочной с квадратным узлом, тщательно СНиП оставшуюся часть шва.
  9. Закрыть ребра тупыми щипцами провести ребром и шов в два раза с полипропиленом (синяя мононити) размером 4-0 прикреплены к 19 мм, 3/8 окружности Режущая игла (Myco медицинская, Cary, NC) в кровоостанавливающего, будьте осторожны, чтобы не шва кожи (только ребра).
  10. Завершить свободный квадратный узел, раздувать легкие, место на положительное давление в конце выдоха (PEEP; 2-5 смН 2 O), перерастянутой легких, то безопасный узел плотно, и сделать еще один полный узел, прежде чем отрезая оставшуюся часть шва. Удалить из PEEP и визуализировать течение 30 секунд для того, чтобы легкие не разрушается. Нанесите 5 капель Bupivicaine (APP Pharmaceuticals, Schaumbur, IL).
  11. Закрыть кожи, создав ткань клеем на рану и нажмите кожи вместе с помощью обратно анг хлопка аппликатор. Дайте Bupivicaine (2,0 мг / кг подкожно) в месте разреза затем каждые 8 ​​ч в течение 24 часов или до тех пор пока животное возобновляет нормальную деятельность. Как подкожный слой в этой области очень тонкая, это не легко сшить самостоятельно. Когда ткань наносится клей, и кожа, выдвинутые вместе, она также закрывает подкожный слой.
  12. Отключить изофлуран газа, но продолжает проветрить крыс в течение 1-2 мин на воздухе комнаты до добровольного возвращения движения. Отключите трахеи трубки от вентилятора и убедиться, что крыса дышит спонтанно перед его удалением.
  13. Протрите Puralube от глаз с ватным тампоном и контроль за передвижением и восстановления. Inject бупренорфина гидрохлорида (0,05 мг / кг внутрибрюшинно, Батлер Schein, Дублин OH). Продолжить поставку обезболивающее каждые 12 ч в течение 48 ч после операции.

5. Левой сонной артерии катетеризации

Чтобы оценить масштабы бронхиальной perfusионных ишемические левого легкого в нужное время очка после перевязки левой легочной артерии, вводят меченый микросфер через левую сонную артерию в дуге аорты. Подготовка крыс, как указано выше 1-2.

  1. Разрежьте вдоль средней линии шеи, тупая препарировать, чтобы показать трахеи и левой сонной артерии (сайт микросферы для инъекций).
  2. Вставьте катетер наполнены гепарином солевой раствор, тупой кончик трубы PE20 (Becton Dickinson, Sparks MD) в емкости, соединенной с иглой 25 г, 4-ходовой кран, 1 мл шприца.
  3. Место бутылку микросферы (15 мкм малиновый полистирола флуоресцентные микросферы, 1 х 10 6 сфер / мл; Invitrogen, Юджин, Орегон) в воде ультразвуком в течение 30 сек.
  4. Убрать бутылки, вихревые и составляет 0,5 мл (500.000 микросферы) в 1 мл стеклянный шприц Гамильтон (Hamilton компании, Рино, штат Невада) через 20 игл г.
  5. Прикрепить Гамильтон шприц 4-ходовой кран и настаивать микросфер с шприцевой насос (скорость: 500 мкл / мин; Genie Plus, Kent Scientific, Torringtна, CT).
  6. Удалить Гамильтон шприц и флеш аппарата с 1 мл солевого heparized при 500 мкл / мин.
  7. Выполнение полного торакотомии груди и обескровить крыс путем разделения нижней полой вены.
  8. Удалить левого легкого и других тканей интерес.
  9. Для извлечения микросфер из ткани, взять всю левого легкого у крыс после обескровливания и поместить его в 2М КОН (4-6 мл). Место в 55 ° С водяной бане и оставить на ночь для ткани пищеварения. Добавить Tween 80 (0,25%) мыть шарики, вихрь (10 сек) и центрифуги (2.000 оборотов в минуту; 20 ° С в течение 10 мин). Удалить супернатант, добавить 2-этоксиэтилацетат (1 мл), вихревые и дать постоять 1 час. Vortex подвески и центрифуги (2.000 оборотов в минуту; (20 ° C в течение 10 мин) Снять 2-этоксиэтилацетат водный слой, содержащий флуоресценции, место в кювет и меру использования Hitachi F-2500 спектрофотометр флуоресценция (возбуждение 612/emission 618. , Digilab, Holliston, MA).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Сосудистые В ролях: Результаты воздействия левой легочной артерии ишемия у крыс представлены на рисунке 1. Показана метакрилата актерский состав бронхиальных сосудов и обширных кровоснабжение левого дерева дыхательных путей через 28 дней после LPAL. Чтобы получить этот бросок, системная сосудистая вводили метакрилата смеси (красный), ретроградный в нисходящую аорту и трахею канюли и вводят с белой основе кремния материал. Это сосудистых литых предоставляет замечательную визуализацию бронхиальной ангиоге...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Левая легочная артерия перевязки во всех испытанных видов приводит к надежной системной неоваскуляризации ишемическая легких. Мы представили сведения о хирургическом подходе в крысиной модели. Наши результаты, полученные сосудистой литье, гистопатологии, а в маркировке естественных условиях показали, что бронхиальных артерий размножаться и заливать легочной паренхимы. Таким образом, механизмы бронхиальной ангиогенеза может быть изучена на животных моделях, что параллельно человеческое состояние хрониче...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Мы признаем работы д-ра Adlah Сикар, MD в оказании помощи литья из легких. Эта работа была осуществлена ​​за счет NHLBI, HL088005.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реагенты: Компания
бупренорфин гидрохлорид, Puralube Батлер Schein
bupivicaine APP Pharmaceuticals
Повидон-йод swabstick Dynarex корпорации
полипропилен шов размером 6-0, 3/8 окружности Режущая игла Myco Медицинский
PE20 труб Becton Dickinson
15 мкм малиновый флуоросфер полистирола Invitrogen
Гамильтон 1 мл стеклянный шприц Компания Hamilton
Оборудование:
Genie Plus шприцевой насос Kent Научные
Флуоресцентный спектрофотометр Digilab
Грызун Вентилятор модели 683 Harvard Apparatus
Таблица 1. Таблица специфических реагентов и оборудования.

Ссылки

  1. Weibel, E. R. Early stages in the development of collateral circulation to the lung in the rat. Circulation Research. 8, 353-376 (1960).
  2. Li, X., Wilson, J. W. Increased vascularity of the bronchial mucosa in mild asthma. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156, 229-233 (1997).
  3. Turner-Warwick, M. Precapillary systemic-pulmonary anastomoses. Thorax. 18, 225-237 (1963).
  4. Muller, K. M., Meyer-Schwickerath, M. Bronchial arteries in various stages of bronchogenic carcinoma. Pathol. Res. Pract. 163, 34-46 (1978).
  5. Remy-Jardin, M., Duhamel, A., et al. Systemic Collateral Supply in Patients with Chronic Thromboembolic and Primary Pulmonary Hypertension: Assessment with Multi-Detector Row Helical CT Angiography. Radiology. , 274-281 (2005).
  6. Karsner, H., Ghoreyeb, A. Studies in infarction: The circulation in experimental pulmonary embolism. J. Exp. Med. 18, 507-522 (1913).
  7. Endrys, J., Hayat, N., et al. Comparison of bronchopulmonary collaterals and collateral blood flow in patients with chronic thromboembolic and primary pulmonary hypertension. Heart. 78, 171-176 (1997).
  8. Virchow, V. Uber die Standpunkte in den Wissenschaftlichen Medizin. Virchow Archiv. 1, 1-19 Forthcoming.
  9. Fadel, E., Mazmanian, G. M., et al. Lung reperfusion injury after chronic or acute unilateral pulmonary artery occlusion. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157, 1294-1230 (1998).
  10. Charan, N. B., Carvalho, P. Angiogenesis in bronchial circulatory system after unilateral pulmonary artery obstruction. J. Appl. Physiol. 82, 284-291 (1997).
  11. Shi, W., Hu, F., et al. Altered reactivity of pulmonary vessels in postobstructive pulmonary vasculopathy. J. Appl. Physiol. 88, 17-25 (2000).
  12. Shi, W., Giaid, A., et al. Increased reactivity to endothelin of pulmonary arteries in long-term post-obstructive pulmonary vasculopathy in rats. Pulm. Pharmacol. Ther. 11, 189-196 (1998).
  13. Sukkar, A., Jenkins, J., et al. Inhibition of CXCR2 Attenuates Bronchial Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung. J. Appl. Physiol. 104, 1470-1475 (2008).
  14. Mitzner, W., Lee, W., et al. Angiogenesis in the mouse lung. Am. J. Pathol. 157, 93-101 (2000).
  15. Wagner, E. M., Jenkins, J., et al. Lung and vascular function during chronic severe pulmonary ischemia. J. Appl. Physiol. 110, 538-544 (2011).
  16. Remy-Jardin, M., Bouaziz, N., et al. Bronchial and nonbronchial systemic arteries at multi-detector row CT angiography: comparison with conventional angiography. Radiology. 233, 741-749 (2004).
  17. Baluk, P., Tammela, T., et al. Pathogenesis of persistent lymphatic vessel hyperplasia in chronic airway inflammation. J. Clin. Invest. 115, 247-257 (2005).
  18. Bailey, S. R., Boustany, S., et al. Airway vascular reactivity and vascularisation in human chronic airway disease. Pulm. Pharmacol. Ther. 22, 417-425 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи