Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Микрофлюидных основе электротаксис по требованию Количественный анализ

9.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50226

⸱

2 мая 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, McMaster University , 2Department of Mechanical Engineering, McMaster University

В этой статье

Краткое содержание

Полуавтоматические микро-электро-жидкостный способ индукции по требованию локомоция Caenorhabditis Элеганс Описан. Этот метод основан на нейрофизиологических явление червей в ответ на мягкий электрические поля ("электротаксис") внутри микроканалов. Микрофлюидных электротаксис служит быстрый, чувствительный, недорогих и масштабируемых технику для выявления факторов, влияющих на здоровье нейронов.

Аннотация

Нематода Caenorhabditis elegans является универсальным модельным организмом для биомедицинских исследований из-за его сохранения генов и путей, связанных с болезнями, а также простоты выращивания. Сообщалось о нескольких моделях болезни C. elegans, включая нейродегенеративные расстройства, такие как болезнь Паркинсона (БП), которая включает в себя дегенерацию дофаминергических (DA) нейронов 1. Как трансгены, так и нейротоксические химические вещества были использованы для индукции нейродегенерации DA и последующих двигательных дефектов у червей, что позволило исследовать основы нейродегенерации и проводить скрининг нейропротекторных генов и соединений 2,3.

Скрининги у низших эукариот, таких как C. elegans, обеспечивают эффективные и экономичные средства для идентификации соединений и генов, влияющих на нейронную сигнализацию. Обычные сита обычно выполняются вручную и оцениваются путем визуального осмотра; Следовательно, они отнимают много времени и подвержены человеческим ошибкам. Кроме того, большинство из них сосредотачиваются на анализе клеточного уровня, игнорируя локомоцию, которая является особенно важным параметром для двигательных расстройств.

Мы разработали новую микрофлюидную систему скрининга (рис. 1), которая контролирует и количественно оценивает локомоцию C. elegans с помощью стимулов электрического поля внутри микроканалов. Мы показали, что поле постоянного тока (DC) может устойчиво индуцировать локомоцию по требованию к катоду («электротаксис») 4. Изменение полярности поля приводит к тому, что червь также быстро меняет направление своего движения. Мы также показали, что дефекты дофаминергических и других сенсорных нейронов изменяют реакцию на плавание 5. Таким образом, аномалии в нейронной сигнализации могут быть определены с помощью локомоции в качестве считывания. Реакция на движение может быть точно количественно определена с помощью ряда параметров, таких как скорость плавания, частота изгибов тела и время разворота.

Наша работа показала, что электротаксическая реакция меняется с возрастом. В частности, молодые особи реагируют на меньший диапазон электрических полей и двигаются быстрее по сравнению с личинками 4. Эти результаты привели нас к разработке нового микрофлюидного устройства для пассивной сортировки червей по возрасту и фенотипу 6.

Мы также проверили реакцию червей на импульсные электрические поля постоянного тока и переменного тока (AC). Импульсные поля постоянного тока различных рабочих циклов эффективно генерировали электротаксис как у C. elegans, так и у его двоюродного брата C. briggsae 7. В другом эксперименте симметричные поля переменного тока с частотами от 1 Гц до 3 кГц обездвижили червей внутри канала 8.

Реализация электрического поля в микрофлюидной среде позволяет быстро и автоматически выполнять анализ электротакси. Этот подход обещает облегчить высокопроизводительный генетический и химический скрининг факторов, влияющих на функцию и жизнеспособность нейронов.

Протокол

1. Фотолитографии для изготовления Master Mold

  1. Купайтесь 3 дюйма кремниевых пластин в ацетоне в течение 30 секунд, а затем метанолом в течение 30 сек. Промыть дН 2 0 воде в течение 5 мин.
  2. Сухой поверхности пластины с пушечным ударом N2. Нагрейте пластину на горячей плите при 140 ° С в течение 2 мин.
  3. Плазменный окисления поверхности кремниевой пластины (1 мин, 50 Вт).
  4. Спин-пальто по поверхности пластины с 3 мл СУ-8 100 фоторезиста (40 сек; 1750 оборотов в минуту).
  5. Предварительно выпекать покрытием пластин на горячей плите при температуре 65 ° С в течение 10 мин, затем нарастить температуру до 95 ° С в течение 2 мин. Поддерживать эту настройку для еще 1 час.
  6. Совместите фотошаблонов содержащих нужный канал дизайна. Expose противостоять 550-600 мДж / см 2 УФ-света (350-400 нм). Photomasks могут быть разработаны в AutoCAD и печатается на прозрачной пленке с высоким разрешение печати.
  7. После выпечки вафельных на горячей плите при температуре 65 ° С в течение 1 мин и 95 ° C в течение 10 мин, наращивает тон температуре, как раньше.
  8. Погрузите вафельные в SU-8 разработчик решений в течение 10-15 мин. Проверьте завершение разработки промывкой изопропанола. Если появляется белый осадок, продолжают развиваться. Мастер форма показана на фиг.2А.

2. Мягкой литографии для изготовления Microchannel

  1. Смешайте 35 мл полидиметилсилоксана (ПДМС) эластомера основание с 3,5 мл PDMS отверждающего агента.
  2. Поместите изготовлены мастер-форма (шаблон вверх), и пустой кремниевой пластины в чашки Петри облицованы алюминиевой фольгой.
  3. Налить 20 мл PDMS форполимеру в блюдо мастер формы и 15 мл во второе блюдо. Устранения воздушных пробок под пластин, слегка нажав на них с одноразовой деревянной аппликатором.
  4. Обложка оба блюда и отложите в течение дня, чтобы вылечить. Кроме того, для более быстрого высыхания удалить пузырьки воздуха из PDMS с помощью вакуумного деаэратора, а затем оставить блюдо на горячей плите при 80 ° С в течение 2HR.
  5. Снимите фольгу и кожица PDMS от пластин.
  6. Используйте Харриса Uni-Core (2,5 мм) пробить жидкости портов доступа на обоих концах канала. Отрежьте канал и пустые PDMS в аналогичных размеров полос.
  7. Загрузите канал, пустой PDMS полосы и стекло (75 × 25 мм 2) в плазме окислитель, вероятно, находится в чистом помещении. Подвергать воздействию кислородной плазмы в течение 40 с при 40 Вт.
  8. Палка часть канала и стекло с противоположных сторон заготовки полосы. Выделить в течение 2 часов для завершения связи.
  9. Поместите сборку на горячей плите при температуре 120 ° C. Прикрепите пластиковые трубы (внутренний диаметр 1/32 ", наружным диаметром 3/32"), каждая не менее 6 дюймов длиной, с пробитыми резервуаров использованием PDMS форполимеру. Прикрепите жидкостный пластиковый разъем на одну или обе трубы, чтобы шприц привязанности, или использовать имеющиеся в продаже арматуры.
  10. Разрешить PDMS обеспечении трубки, чтобы вылечить. Вставьте 3 "длиной 22 калибра изолированной медной проволоки в EACч водохранилища, между входе в трубу и канал, и безопасную форполимеру PDMS. Готовое изделие показано на фиг.2В.

3. Эксперимент электротаксис

  1. Поместите микроканальным на сцене (желательно XY-подвижные) микроскопа с установленным на камеру, подключенную к монитору (рис. 1).
  2. Подключите блок питания или выходе усилителя провода к микроканальным в электродах. Простой источник питания постоянного тока достаточно, если только сигнал постоянного тока желательна, но усилитель подключен к функции генератора позволяет применять импульсного постоянного и переменного тока сигналы.
  3. Прикрепить микроканальным в выходной трубки одноразового шприца. Погрузите устье впускной трубы в M9 физиологическом буфере и осторожно стремятся жидкости в канал, если отрицательное давление внутри шприца (либо вручную, либо с использованием шприца). Когда входной и выходной труб и заполненных М9, отсоединить шприц еПЗУ трубки. Уровня как трубы на ту же высоту, чтобы предотвратить поток с гидростатическим приводом.
  4. Применение напряжения постоянного тока в канал и гарантировать, что сопротивление (R = V / I) составляет около 0,6 МОм (при 50 мм, шириной 0,3 мм и ~ 0,1 мм в глубину микроканала).
  5. Если вы согласны с целостности канала, выполните указанные выше действия для загрузки червей разбавленной суспензии в канал.
  6. Отсоедините шприц и гидростатическим манипулировать потоком, регулируя относительную высоту трубы. Используйте этот метод, чтобы поместить червя в центре канала, а затем лежали обе трубы плоские на той же высоте.
  7. Установка блока питания к соответствующим напряжение: 4-12 В / см для животных L3 этап, 4-10 В / см в течение L4S и 2-4 В / см для молодых взрослых. Активируйте электрический сигнал и Подождите около 1 минуты до контакта для червя, чтобы акклиматизироваться к полю. Червь должны начать движение по направлению к катоду. Когда минута прошла, использовать камеру, чтобы начать запись.
  8. Для переменного и импульсногог DC экспериментах максимальный реагировать электрическое поле может быть принята сверху и частоту и рабочий цикл сигнал может быть модулирован в соответствии с пожеланиями 7, 8.
  9. Когда эксперимент закончен, удаления всей жидкости (и черви) из канала, промойте его дН 2 0, и оставить устройство на горячей плите при 125 ° С, чтобы высохнуть.
  10. Извлечение данных из двигательного видеозаписей вручную с помощью NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) или пользовательские MATLAB на основе червя отслеживания.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Представитель видео электротаксис дикого типа молодых взрослых нематод и его положение и скорость выхода из программы слежения червь приведены в дополнительном Video 1 и на фиг.3. Программное обеспечение анализа движения сама не распознает направление пол рность пол, а время изменения полярности, а, скорее, эта информация должна быть получена от источника видеосигнала. Это может быть сделано с помощью аудио или визуального сигнала в видео или записывать экспериментальных условиях и мани...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Воспользовавшись тем, что поведенческий феномен впервые описан Габель и коллег и здания на работу диэлектрофореза манипуляции Чжуан 11,12 и коллеги, наши микрожидкостной основе анализа электротаксис обеспечивает простой, надежный и чувствительный метод для исследования активности нейронов в червей использующих движение выход. Анализ движения параметров позволяет количественное сравнение между различными генотипами. Точность изготовления и микроканальным применении электрического поля вместе обеспечивают как к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Микрожидкостных анализа электротаксис технология была подана на патент в Соединенных Штатах Америки и Канаде.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады, Канада Исследование программы кафедр, Канадский институт исследований в области здравоохранения, и Онтарио министерство исследований и инноваций через их раннего премии Исследователи Программы финансовой поддержки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АцетонCALEDON Labs1200-1-30
МетанолCALEDON Labs6700-1-30
ИзопропанолCALEDON Labs8600-1-40
SU-8Microchem Corp.Y131273СУ-8 100
СУ-8 РазработчикMicrochem Corp.
92x16 мм Чашка ПетриSarstedt82.1473.001
Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеров DowCorningСодержит эластомерную основу и отвердитель
Функция генератораTektronix Inc.Модель AFG3022B
усилителяTrek Inc.Модель 2210-CE
Шприцевой насосHarvard Apparatus70-4506Model 11 ELITE
Горячая плитаFisher Scientific11675916QМодель HP131725Q
Y020100

Ссылки

  1. Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
  2. Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
  3. Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
  4. Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
  5. Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , Submitted (2013).
  6. Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
  7. Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116(2011).
  8. Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702(2010).
  9. van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027(2008).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
  12. Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
  13. Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5(2005).
  14. Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -M. D. i, Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637(2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

C elegansPDMS
Микрофлюидных основе электротаксис по требованию Количественный анализ
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.