Селективный розыска слуховых волокон в Птичий Эмбриональные Vestibulocochlear нервов

Michelle R. Allen-Sharpley; Michelle Tjia; Karina S. Cramer

doi:10.3791/50305

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Селективный розыска слуховых волокон в Птичий Эмбриональные Vestibulocochlear нервов

8.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50305

⸱

18 марта 2013 г.

Michelle R. Allen-Sharpley¹ , Michelle Tjia¹ , Karina S. Cramer¹

¹Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы опишем технику микродиссекции последующим флуоресцентным красителем инъекции в акустическом ганглий рано куриных эмбрионов для селективного отслеживания слуховых волокон аксонов в нервной и заднего мозга.

Аннотация

Эмбриональных птенец широко используется модель для изучения периферической и центральной проекции ганглиозных клеток. В слуховая система, избирательное маркировки слуховой аксонов в VIII в черепных нервов будет способствовать изучению центральной развитие цепи слуховых. Этот подход является сложной задачей, так как несколько органов чувств, внутреннего уха вклад в нерв ^VIII-1. Кроме того, маркеры, которые надежно различать слуховые по сравнению с вестибулярным группы аксонов в птичьем нерв VIII в до сих пор не определены. Слуховые и вестибулярные пути не могут быть выделены функционально ранних эмбрионов, как сенсорно-вызванных ответов нет до схемы формируются. Централизованное проектирование VIII в аксонов нерва были прослежены в некоторых исследованиях, но и слуховые аксона маркировки сопровождается маркировки с другими компонентами нерв VIII в ^2,3. Здесь мы опишем метод трассировки антероградной от акустического ганглий выборочно Лабел слуховой аксонов в развивающихся VIII в нерв. Во-первых, после частичного рассечения передней головной область 8-дневного куриного эмбриона кислородом погружен в искусственную спинномозговой жидкости, канал улитки определяется анатомические ориентиры. Далее, тонкой стеклянной пипетки вытащил позиционируется придать небольшое количество родамина декстрана аминов в канал и прилегающие глубокие области, где акустические ганглиозных клеток находятся. В течение тридцати минут после инъекции, слуховые аксонов прослеживается централизованно в заднем мозге и в дальнейшем могут быть визуализированы после гистологического препарата. Этот метод представляет собой полезный инструмент для развития исследований периферию центрального формирования цепи слуховых.

Протокол

1. Подготовьте следующие инструменты Dissection и реагенты

Искусственные цереброспинальной жидкости (ACSF, 130 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 1,2 мМ KH ₂ PO _4, 20 мМ NaHCO _3, 3 мМ HEPES, 10 мМ глюкозы, 2 мМ CaCl _2, 1,3 мМ MgSO ₄₎ непрерывно переплетаются с 95% O _2/5% CO ₂ при комнатной температуре. Для инфузий, заполнить на 2/3 500 мл с широким горлом Nalgene банку с отверстием в крышке. Танк будет прикреплен на трубы со стеклянным стволовых барботер, который проникает в ACSF через отверстие в крышке банки. Отрегулируйте давление для получения постоянного потока пузырьков, которые достигают около 1/3 жидкости, но не сильный достаточно, чтобы вызвать брызги через край. Погрузитесь 5 мл стеклянных флаконах (до 6) в банку Nalgene отделить отдельные образцы друг от друга и от турбулентности потока газа. ACSF должны быть кислородом в течение 20 мин до любой ткани инкубации.
Малый блюдо рассечение силиконовые (35 мм х 10мм Петри покрытием использованием Sylgard Elastomere Kit) с двумя рассечение контакты помещаются в небольшой шестиугольный полистирола (47 мм внизу) весит лодка.
Два прекрасных наконечником щипцы, один изогнутый кончик пинцетом, 50 мл стакан и контейнера для отходов тканей.
Вытащил стекла микропипетки (1,2 OD / 0,9 ID) сломаны примерно 20-50 мкм открытие на кончике и наполнен родамина декстрана аминов (RDA, MW = 3000, Invitrogen) в 6,25% раствора с 0,4% Тритон Х-100 в PBS . Прикрепить тонкой трубки к picospritzer и стабилизации к микроманипулятора.

2. Micro-рассечение, чтобы Показать Базилярная РарШа на ^4,5 E8

С изогнутым пинцетом, вырезать E8 эмбрион чуть ниже ствола мозга, размещение голову прямо на силиконовым покрытием рассечение блюдо весом в лодку.
Использование рассечение контакты, положение головы с брюшной стороны, так что ухо на стороне интересов слегка видно, голова слегка наклонена сверху и указывая 10-30 градусов от сеГюнтер (рис. 2A). Немедленно обеспечить головой с контактами. Если двусторонних трассировка желании центре головы в 0 градусов, или полный вид снизу так с обеих сторон могут быть доступны. Аналогично, для левостороннего инъекции, обеспечить головы при температуре от -10 до -30 градусов от центра, чтобы левая сторона доступна.
С помощью 50 мл стакан, передавать 30 мл кислородом ACSF в блюдо, полностью погружаясь в ткани.
Аккуратно понять и очистить вниз нижнюю челюсть с помощью тонкой наконечником щипцы, затем снимите нижнее веко на стороне интересов.
Снимите ткань вышележащих сосудистых, в том числе оставшихся неба и глотки. Эти мягкие ткани должна отслаиваться выявления гладкой поверхности развивается хрящевой череп с отличительными позвоночных артерий на его поверхности. К этому моменту, характерные белые otoconial масса должна быть видна.
Осторожно рассекают кожу вокруг внешнего слухового прохода, хрящей нижнечелюстного сустава, а также среднего уха, оставляя внер ухо нетронутыми. Используйте пинцет, чтобы аккуратно срезать этих хрящевых структур.
Удалить позвоночных артерий и объединению крови с использованием нежного радикальные движения с тонкой советы щипцов. Кровь может заслонить вид и коагуляции может подключить открытие инъекции пипетки.
Улитки с соседними сенсорного эпителия (базилярная сосочка) и акустической ганглий лежит прямо под хрящевой череп ⁶ и могут быть представлены в виде удлиненных пальцев, как проекция простирается от внутреннего уха снизу, с дистальной-самых наконечник (вершина) рядом с передней срединной линии ^5. Там может быть небольшим скоплением крови (красные) от вскрытия и / или отолитовой кальцификаты (белый) на вершине улитки (рис. 2В), которые могут помочь в визуализации. На вершине находится лагенарной макулы, сенсорные патч считается вестибулярной функции ^7,8.

3. Селективный маркировки CN VIII слуховые волокна

Место инъекции пипетки вблизи зародыша на поверхности канала улитки и основной сосочек региона.
Медленно опустите микропипетки на первый прокол черепа. Это ЧЕРЕПНАЯ тоньше, чем окружающие районы и требует меньше усилий, чтобы проникнуть. Микропипетки должны теперь находиться внутри канала улитки. Дополнительно: небольшая инъекция трассировки красителя может быть сделано здесь, чтобы помочь в визуализации базилярной сосочка.
Без перестановки микропипетки, продолжать снижение, пока это только нарушение глубокой границы канала улитки (рис. 1). Выполнять инъекции здесь и повторять в различных регионах вдоль базилярной сосочков (рис. 2в, 2г), за исключением самого проксимального кончика, где вестибулярный лагены находится. С picospritzer установлен в пределах 10-30 фунтов на квадратный дюйм, несколько инъекции делаются. Объем вводимой жидкости красителя меняется, и зависит от степени желаемого маркировки. Каждая инъекция должна привести к флуоресцентным красителем-лабелед месте примерно в 200 - 400 мкм в диаметре (рис. 2D).
После инъекции завершен, использование щипцов, чтобы секут пример выше ствола мозга и использовать передачу пипетки поместить хвостовой части в небольшую банку в контейнер ACSF постоянно перфузии с 95% O _2/5% CO _2.
Для каждого эмбриона, позволяющие 20-30 мин для переноса красителя, в зависимости от расстояния Центральное справочное лучшего.
Удалить ткани и подготовиться к гистологических срезов. В примере, показанном здесь, ткань погружают в 4% параформальдегида (в 1X PBS) в течение ночи, 30% сахарозы (в 1X PBS) в течение ночи.

4. Counterstaining и анализ

Counterstaining полезно, чтобы помочь ориентироваться наблюдателя анатомического расположения, а также выявление конкретных регионах, представляющих интерес. Эффективное контрастирующая в этом препарате нейрофиламентов иммунного (рис. 1, 3B, 3E), которые сильно LАбельс аксонов и позволяет демаркации аксонов путей в ЦНС.
Анализ должен быть выполнен во всем помечены региона, а прогнозы могут расширить несколько сотен микрон или более по rostrocaudal оси. Некоторые примеры основных анализов: таргетинга количество ошибок, сроков и / или изменения в проекции расхождения моделей. RDA-меченых аксонов визуализируются в периферической и центральной нервной системы с высоким разрешением (рис. 3А, 3D).