Методическая статья

Лазерная Capture Microdissection обогащенного популяции нейронов или отдельных нейронов для генного анализа выражения после черепно-мозговой травмы

DOI:

10.3791/50308

⸱

10 апреля 2013 г.

 ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы опишем, как использовать лазерные захвата микродиссекции (LCM) для получения обогащенных популяций нейронов гиппокампа или отдельных нейронов из замороженных участков ранения головного мозга крыс для последующего анализа экспрессии генов с использованием количественной ПЦР в реальном времени и / или целого генома микрочипов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Долгосрочные когнитивных инвалидности после ЧМТ связано с травмой вызванной нейродегенерации в гиппокампе, области в медиальной височной доли, что имеет решающее значение для обучения, памяти и исполнительных функций. 1,2 Таким образом, наши исследования сосредоточены на экспрессию генов анализ конкретных нейронов населения в различных субрегионов гиппокампа. Методика лазерного захвата микродиссекции (LCM), введенный в 1996 году Эммерт-Бак и соавт., 3 позволило значительных успехов в экспрессии генов, анализ отдельных клеток и обогащается популяций клеток из разнородных тканей, таких как мозг млекопитающих, который содержит тысячи функциональных типов клеток. 4 мы используем LCM и хорошо организованной крысиной модели черепно-мозговой травмы (ЧМТ), чтобы исследовать молекулярные механизмы, лежащие в основе патогенеза ЧМТ. После жидкость ударных TBI, мозг удаляют в заранее определенные раз после травмы, немедленно замораживали на сухом льду,и подготовлены для секционирования в криостат. Крыса мозг может быть встроен в октябре и секционного сразу или хранить несколько месяцев при температуре -80 ° C до секционирования для лазерных микродиссекции захвата. Кроме того, мы используем LCM для изучения последствий ЧМТ на циркадные ритмы. Для этого мы фиксируем нейроны от супрахиазматического ядра, которые содержат задающий генератор мозга млекопитающих. Здесь мы демонстрируем использование LCM получить одно определены нейронов (ранения и вырождается, фтор-Jade-положительных, или неповрежденной, фтор-Jade-отрицательный) и обогащенного популяции нейронов гиппокампа для последующего анализа экспрессии генов путем ПЦР в реальном времени и / или целого генома микрочипов. Эти LCM с поддержкой исследования показали, что селективная уязвимость анатомически различных регионах гиппокампе крыс нашли свое отражение в различных профили экспрессии генов различных популяций нейронов получены LCM из этих различных регионах. Результаты наших одноклеточных исследований, гдесравнить транскрипционных профилей смерти и прилегающих выживших нейронов гиппокампа, свидетельствуют о существовании реостат выживания клеток, регулирующий гибели клеток и выживаемость после ЧМТ.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ экспрессии генов гетерогенных тканей всегда было проблематично,. Это особенно верно в мозге млекопитающих, который имеет около 5000 различных типов клеток 4 До развитие микродиссекции лазерного захвата (LCM) техники, геномные исследования последствий ЧМТ В естественных условиях были основаны на анализе экспрессии генов в смешанной популяции клеток головного мозга состоит не только из различных типов клеток нейронов, но и в поддержке глиальных клеток и иммуномодулирующим. В результате сложных профилей экспрессии генов, полученных из этих гетерогенных тканей, и зачастую противоречащих друг другу моделей травмы вызванной клеточных сигналов, может быть одним из объяснений неудач в человеческой клинических испытаний терапевтической стратегии доказали свою эффективность в доклинических исследованиях TBI 5.

Для получения четкого понимания травмы вызванной экспрессии генов в уязвимых групп нейронов крысы бедраpocampus, мы приняли техника LCM, впервые сообщил Эммерт-Бак и др. 3. Впоследствии мы изменена и оптимизирована этом микродиссекции технику для эффективного захвата обогащенной популяции нейронов и нейронов одного мРНК профилирования с использованием количественной ПЦР в реальном времени и анализ микрочипов . Для поддержания целостности мРНК в замороженных срезах ткани мозга для геномного анализа, мы модифицировали существующие протоколы для фиксации, окраски и быстрого захвата нейронов из замороженных срезах мозга крыс. Для выявления и изоляции раненых и умирающих нейронов гиппокампа, мы также оптимизировали фтор-Jade техники окрашивания для LCM. Фтор-Джейд не делает различия между апоптоза и некроза клеточную смерть. Таким образом, все типы нейронов вырождающихся может быть обнаружено это пятно. 6,7

Здесь мы описываем протокол, используемый в нашей лаборатории для получения бассейнов отдельных нейронов смерти или выживания, а также валки обогащенного populatiДополнения различных типов клеток нейронов (т.е. СА1-СА3 нейроны для генной анализа экспрессии после ЧМТ). Порядок жидкости мозговой травмы перкуссия производится в нашей лаборатории подробно описаны в Shimamura и соавт., 8 и очень похож на боковой жидкости ударные травмы протокол для мышей, опубликованной в Юпитер по Ольха и др. 9. Поскольку техника имеет LCM Было показано, что минимальное или вообще не влияет на целостность ДНК, РНК и белков в тканях, это отличный инструмент для молекулярного анализа белков и определенных типов клеток.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Хирургические процедуры и жидкости ударных TBI

  1. Все эксперименты на животных, которые впервые одобрен Институциональные уходу и использованию животных комитета Техасского университета медицинской отрасли, Галвестон, Техас и Национального института здоровья Руководство по уходу и использованию лабораторных животных (8-е издание, National Research Council).
  2. Крысы (взрослый мужчина Sprague-Dawley крыс, 400-500 г получен от поставщика Charles Rivers, Портленд, штат Мэн) размещены два раза в клетке и предоставил продовольствие и воду без ограничений объявление в виварии с этим постоянные условия: свет цикл (600 часов до 1800 ч), температуры (21 ° C до 23 ° C) и влажности (40% до 50%) за одну неделю до использования.
  3. Anesthetize крыс с 4% изофлурана, интубировать, и механически вентилируемые (НЭМИ Научно; New England Medical Instruments, Medway, MA) у крыс с 1.5-2.0% изофлурана в кислороде: воздух (70:30) и подготовить их к парасагиттальных жидкости перкуссия травмы, как описано выше. 8, 10
  4. Жертва крыс в соответствующий момент времени после травмы в зависимости от эксперимента. Быстро удалить мозги, немедленно заморозить на сухом льду, и хранят при -80 ° C в 50 мл трубки или немедленно приступить к встроить в октябре для замороженных срезов.

2. Секционирование и окрашивание мозга крыс

  1. Мозговая ткань, которая не используется сразу можно хранить при температуре -80 ° C на срок до одного месяца, если хранится при постоянной температуре. Мозги, которые замораживали при -80 ° C, а затем оттаивали до -20 ° C для резки, а затем повторно заморожены не уступает качеству РНК после второго оттаивания. Как только мозг размораживают, установленный в октябре и разрезом, слайды должны быть окрашены в течение 24 ч и используются для LCM в течение 30 минут до одного часа окрашивания. Это позволит обеспечить хорошее качество РНК. После LCM, захваченных клеток на колпачки LCM могут быть сохранены в буфере для лизиса при температуре -80 ° С в течение одной недели, но РНК должны быть изолированы своевременно обеспечить самое высокое качество.
  2. До срезов мозга, протрите криостат с RNase-Zap и очистить щетки с EtOH (заменить одноразовые лезвия между мозгом).
  3. Получить мозга в 50 мл трубки из морозильной камере -80 ° C; поместить его в криостат при температуре -22 ° С и оттаивание в трубке в течение примерно 10 мин. Удалить мозга от трубы и место на сцене на марлю, брюшной стороной вверх.
  4. Используя лезвие бритвы, нарезать мозги, чтобы удалить заднюю часть мозга просто ростральнее мозжечка и передняя часть на перекрест зрительных нервов. Заполните cryomold с октября монтажа среды (Tissue Tek), и поместить мозг в форму с передней стороной вниз. Разрешить ткани мозга заморозить в монтажную среду, пока не побелеет (около 10 мин).
  5. Замораживание образцов диска (Tissue Tek) на мозг с октября Удалить мозг от плесени. Вставьте мозга в образце голову и затянуть винты.
  6. Вставьте DisposaBLE, низкий профиль лезвия (Fisher Scientific) в держатель ножа и затянуть рычаг вниз.
  7. Начало нарезка мозга на 20 мкм для удаления внешнего слоя октября После гиппокампа регионе будет достигнут, установить микрон диск 10. Сбор корональной серийных срезах путем размещения предметное стекло или плюс стекло на срез ткани (Fisher Scientific). Слайды сохраняются при температуре -20 ° C в РНКазы окрашивание срезов стойку до завершения.
  8. Чтобы удалить все РНКазы из посуды, где срезы ткани обрабатываются, протереть все окрашивание контейнеров и окончил цилиндров с Eliminase (Fisher Scientific) и промыть в воде Milli Q. Подготовить все решения с РНКазы свободной воды и фильтрации крезиловый фиолетовый (Sigma-Aldrich) и фтор-Jade (Histo-Chem) пятно с 0,2 мкм до использования.
  9. Оттепель срезов головного мозга при комнатной температуре в течение 30 секунд и зафиксировать в 75% этанола (1 мин).
  10. Для LCM одного поврежденных нейронов после фиксации, промывки слайды в РНКазы свободной воды (1 мин), Контрастирующая окраска с 1% крезиловый фиолетовый (15-20 сек), промыть в РНКазы водой (2 × 30 сек), пятна с фтор-Jade (4 мин), промыть в РНКазы водой (3 × 1 мин), обезвоживают с 95% этанола из РНКазы свободной воды (30 сек), 100% этанола (30 сек), и ксилола (2 × 3 мин).
  11. Для НОК ряды нейронов после фиксации, промывки слайды в РНКазы свободной воды (1 мин), пятно с 1% крезиловый фиолетовый (1 мин), промыть в РНКазы воды (3 × 1 мин), обезвоживают с 95% ETOH (2 × 30 сек), 100% этанола (2 × 30 сек), и ксилола (2 × 3 мин).
  12. Воздух сухой всех разделах в вытяжном шкафу в течение 15 мин до LCM. Слайды могут быть сохранены, стороны раздела вверх, в режиме слайд-окна выстроились с осушителем, если они должны быть переведены из комнаты в комнату. Тем не менее, оптимальные результаты получаются, если LCM выполняется сразу же после разделов сухие. LCM должны быть ограничены от 30 мин до 1 часа. В следующем разделе мы рассмотрим сначала, как захватить непрерывной ряды клеток, которые еаsiest освоить для тех, кто учится эту технику. Тогда мы расскажем, как именно захват отдельных нейронов. В нашей процедуре, мы отождествляем умирают нейроны их сродства к фтор-Jade-маркер нейронов вырождается. Фтор-Jade-негативные клетки, как предполагается, будет сохранившихся нейронов.

3. Лазерная Capture Microdissection (LCM)

НОК ряды обогащенного популяции нейронов гиппокампа

  1. LCM осуществляется с помощью микроскопа PixCell IIe с инфракрасным лазерным диодом (Life Technologies).
  2. Отрегулируйте центр джойстика в вертикальное положение. Повернуть и зафиксировать 4X цель на месте.
  3. Поместите слайд в центре столик микроскопа и вручную настроить до области гиппокампа в представлении. Используйте грубую и точную настройку фокуса привести изображение в фокусе.
  4. Активируйте вакуум патрона, нажав на кнопку вакуума на контроллере. Повернуть и зафиксировать 10X цель в плтуз. Фокус снова с грубой и тонкой настройки.
  5. Загрузите CapSure Макро LCM колпачки (Life Technologies) в модуле CapSure кассеты и положение крышки в положение линии нагрузки. Поверните руку Cap размещение и положение вокруг крышки. Поднимите руку Cap Размещение удалить CapSure крышку с кассеты модуля.
  6. Поверните руку Cap размещения на слайде и опустите руки вниз, на слайде, это будет поместить крышку на слайде. Настройка точной фокусировки и перемещения джойстика, чтобы проверить, если клетки находятся внутри черного круга на крышке. Все ячейки захваты должны быть внутри этого черного круга.
  7. Установите параметры лазера. Во-первых, нажмите кнопку лазерного включить кнопку на контроллере. Пятно лазерного целеуказателя будет видно, как розовые точки в поле зрения на монитор компьютера.
  8. Установить размер пятна лазера на небольшие (7,5 мкм) для фокусировки лазерного и регулировать мощность и длительность до 65 - 75 МВт, на 1.0-2.0 мс, сколько необходимо для оптимального захвата клетки.
  9. Для тэго лазера, использовать джойстик для перемещения лазерного пятна в районе, где нет клеток, чтобы забрать. Огонь лазера на большой палец выключатель. Используйте джойстик для перемещения лазерного пятна от расплавленного полимера место и проверить, если видимых темное кольцо окружает открытое место, где лазер был уволен.
  10. Для захвата клетки, использовать джойстик для перемещения лазерного пятна на площади клетки для захвата. Огонь лазера на большой палец выключатель. Переместите джойстик во время стрельбы лазера захватить большую площадь клетки. Когда лазер выстрелил он тает термопластичной полимерной пленкой на крышке к поверхности клетки-мишени. Полимера поглощает лазерное излучение, таким образом, не изменяя РНК, ДНК или белка обеспечения целостности образца для будущих молекулярно приложений.
  11. После стрельбы все клетки интерес, поднять руку Cap размещения. Захваченные клетки будут отделяться от среза ткани и придерживаться CapSure крышкой. Остальные ткани и пропавших без вести клеток будет отношениюible в поле зрения. Клетки на крышку можно также рассматривать, создав крышку на пустой части слайда.
  12. Поднимите руку Cap размещения и вращать его в Cap выгрузки станции. Нижняя крышка на станцию ​​и вращать рукой Cap Размещение обратно в прежнее положение.
  13. Вставьте CapSure инструмент вставки по платформе и на крышке. Поднимите инструмент с платформы. Крышка будет оставаться прилагается. Прикоснувшись к заглушка на CapSure чистую площадку для очистки от нежелательных тканей.
  14. Поместите крышку в 0,5 мл РНКазы трубку, заполненную 100 мкл буфера для лизиса получена из RNAqueous Micro-Изоляция Kit. Сразу вихрь крышкой в ​​течение 30 секунд, чтобы лизировать клетки. Инкубируйте образцы при 42 ° С в течение 30 мин и заморозить при температуре -80 ° C до выделения РНК.

LCM одного FJ + нейронов в гиппокампе

  1. Для съемки отдельных клеток, загрузить CapSure HS LCM колпачки в модуль CapSure кассеты и positiна крышку в положение линии нагрузки. Поверните руку Cap размещения и расположить ее вокруг крышки. Поднимите руку Cap Размещение удалить CapSure крышку с кассеты модуля.
  2. Установить размер пятна лазера на небольшие (7,5 мкм) для фокусировки лазерного и регулировать мощность лазера и продолжительность до 65 -75 мВт 0,45 до 0,50 мс для оптимального захвата клеткой отдельных клеток.
  3. Поверните руку Cap размещения на слайде и опустите руки вниз, к слайду. Это позволит разместить крышку на слайде. Capsure HS крышка сидит поверхность поднимается от образца во время LCM.
  4. Используйте джойстик для перемещения лазерной более одного FJ + клеток. Все клетки захватили должны быть внутри маленького черного кольца на колпачке. Огонь лазера на большой палец выключатель.
  5. Когда все клетки в пределах черной области круга были уволены с лазерным, поднимите руку Cap размещения. Захваченные клетки будут отделяться от среза ткани и придерживаться CapSure HS крышкой.
  6. Поместите еще один слайд на микролимитахсправиться сцене и собирать FJ + клеток, пока крышка HS является полным. Поместите крышку в 0,5 мл РНКазы трубки, заполненной 40-50 мкл буфера для лизиса. Сразу вихрь крышкой в ​​течение 30 секунд, чтобы лизировать клетки. Инкубируйте образцы при 42 ° С в течение 30 мин и заморозить при температуре -80 ° C до выделения РНК.

4. Всего выделения РНК из образцов LCM (Этот раздел как раз и будет описано в видео презентации)

  1. Всего РНК из клеток выделяют с помощью RNAqueous-Micro Kit (Ambion) следующие протоколы производителя. Все реагенты и моющих растворов представлены в данном комплекте. Предварительно мокрой микро-фильтр-картридж, добавляя 30 мкл буфера для лизиса решение фильтр. Через 5 мин, центрифугируют фильтр в течение 30 секунд при 10000 г.
  2. Добавить 3 мкл LCM добавка к образцу лизат, пипетки для смешивания и центрифуги.
  3. Добавить 52 мкл 100% этанола (1/2 объема) к образцу лизатов; пипетки перемешать, и передать лизат с фильтромстолбца.
  4. Центрифуга фильтр столбцов при 10000 г в течение 1 мин для связывания РНК к колонке. Если существует несколько матчей за один образец, спина каждого лизата через те же колонки отдельно.
  5. Завершите процедуру выделения РНК, как описано в RNAqueous Micro комплект.
  6. Выполните ДНКазы лечения и аз инактивации LCM образцов РНК, как описано в комплекте, передает РНК РНКазы трубы и хранить при температуре -80 ° C.

5. РНК и количественной Downstream приложений

Оценка качества РНК и количественной осуществляется с Agilent Bioanalyzer с использованием реагентов от Pico Kit (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния), следуя протоколу производителя.

  1. Всего РНК анализировали на Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies). Программное обеспечение вычисляет концентрацию и целостности образца РНК путем присвоения Количество РНК Integrity (RIN) к каждому образцу, начиная FROM 1 до 10. 1-5 указывает деградировали РНК и 7-10 указывает на хорошее качество РНК.
  2. Неискаженный нетронутыми РНК будет использоваться для ПЦР в реальном времени, отдельные анализы Taqman или RT2 массивов профилировщик использованием Sybr-зеленой химии. РНК также может быть использована для анализа мРНК микрочипов и анализа микроРНК микрочипов.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В нашем первом исследовании LCM, мы смогли показать, что функционально различных субрегионов (CA1 и CA3) в гиппокампе крыс есть профили экспрессии генов, которые отражают их уязвимость к TBI. 8 Рисунок 1A-1C показывает лазерный захват пирамидальных нейронов гиппокампа (CA1- CA3), зубчатая извилина нейронов и нейронов SCN до, и после LCM. Чистая захватов пирамидальные, гранул или SCN нейроны, соответственно, показаны на макро колпачки. Рис. 2A-2B иллюстрирует умирает, фтор-Jade положительные пирамидальных нейронов и выжить, фтор-Jade отрицательные пирамидальных нейронов до и после LCM. Чистый захват смерти или выживания нейронов показано просмотра захваченных клеток на колпачки LCM.

После LCM, общей РНК могут быть использованы для разнообразных молекулярных исследований, в том числе количественного ПЦР в реальном времени анализ экспрессии генов использованием TaqMan или SYBR зеленой химии (рис. 3А), малый FOCUСЭД ПЦР массивов с SYBR зеленого зондов (рис. 3В) или весь геном микрочипов исследований (рис. 3).

figure-results-1
Рисунок 1. Лазерная захвата микродиссекции ряды определены клеточных популяций из мозга крысы. Frozen 10 мкм корональных участки мозга крыс зафиксированы в этаноле, окрашивали Ниссля пятна (крезиловый фиолетовый) и подготовлена ​​для LCM. Показаны фотографии гиппокампа крысы и супрахиазматическое ядра до и после LCM и захваченные клетки визуализируется на макро колпачки. А. пирамидальные нейроны от CA1-CA3 подполей в гиппокампе крыс. B. зернистых клеток гиппокампа в зубчатой ​​извилине. С. Двусторонние супрахиазматическое ядер, расположенных по обе стороны от третьего желудочкаи расположенный над зрительных нервов. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

figure-results-2
Рисунок 2. Лазерная захвата микродиссекции отдельных нейронов гиппокампа крысы. Показаны А. Вырождающиеся, фтор-Jade-положительным (окрашенный) гиппокампа СА3 нейроны и B. выживания, фтор-Jade-отрицательных (неокрашенных) CA3 нейронов до и после LCM. Захваченные клетки визуализируется. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

figure-results-3 Рисунок 3. Анализ экспрессии генов от общего числа РНК, выделенной из лазерного захватили нейронов. А. Количественная ПЦР в реальном времени данные суточного экспрессии гена часов в SCN. В. Тепловая экспрессии генов в смерти и выживания нейронов гиппокампа показывает выражение апоптоз генов, связанных с использованием ПЦР сосредоточены массивы . C. Agilent целого генома микрочипов анализа экспрессии генов в гиппокампе СА1-СА3 нейроны крыс, которые получили фиктивный травма, ЧМТ или ЧМТ плюс рекомбинантный адено-связанный вирус миРНК предназначен для нокдаун экспрессии генов, индуцированных травмы головного мозга (нейронов оксида азота синтазы и глутатионпероксидазы-1). Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта техника LCM позволило нам сделать значительный прогресс в понимании молекулярных механизмов ЧМТ. 8,10,11,12,13 Мы были первыми исследователями, чтобы использовать эту технику, чтобы продемонстрировать, что различные субрегионов гиппокампе крыс есть профили экспрессии генов, которые коррелирует с их избирательной уязвимости к травме. Наши исследования показали, что мы можем количественно экспрессию гена, по КПЦР, из всего лишь 10 лазерных захваченных клеток и что мы могли бы выполнить генома анализ микрочипов, как от нескольких до 600 захваченных клеток. LCM будет ценным инструментом для проведения аналогичных исследований в других регионах мозга, которые, как известно, участвуют в разнообразных неврологических и нервно-психических расстройств. Например, исследования с использованием LCM бы пролить свет на патогенез болезни Паркинсона в допаминовых нейронов черной субстанции, 14 и помогали генома профилирования исследования прилежащего ядра, которая участвует в награду схемах замешаны в сubstance злоупотреблением расстройства 15.

Нейронные неоднородности отражается на уровне генома 16 и может способствовать отсутствие успеха экспериментальных методов лечения ЧМТ в клинических испытаниях. Таким образом, нашей целью является использовать эту технику, чтобы исследовать критические элементы, влияющие выживаемость нейронов после ЧМТ. Наши последние генома профилирования исследования смерти и смежных сохранившихся нейронов гиппокампа после ЧМТ предположить, что сотовые реостат, что отражает соотношение уровней экспрессии выживаемости клеток с генами гибели клеток регулирует клеточную судьбу после ЧМТ. Эти продолжающиеся исследования будут способствовать разработке и развитию фармакотерапевтических стратегий, которые могут положительно повлиять на реостат выживаемость клеток. Кроме того, мы в настоящее время используют LCM для отслеживания и мониторинга последствий потенциальных терапевтических лекарств в нейронах гиппокампа после ЧМТ. Таким образом, наши исследования показывают, что данный осторожны РНКазы способы обработки и некоторыемодификации существующих протоколов, можно получить высокое качество образцов РНК из LCM для точного количественного анализа экспрессии генов.

Однако есть несколько подводных камней, связанных с LCM техники. Например, сбор только нервные клетки без каких-либо загрязнений микроглии может быть почти невозможным. В пирамидальная слоя клеток гиппокампа было подсчитано, что 95% клеток нейронов с 90% этого населения будет пирамидальных клеток и 10% интернейроны, оставив небольшой процент глиальных и других типов клеток. 8,17, 18 В наших исследованиях мы используем фтор-нефрита флуоресцентным красителем, что конкретно называет только поврежденных нейронов в мозговой ткани. Различные пятна, что является маркером для GFAP необходимо будет пятно микроглии 19. Сбор только фтор-нефрита окрашенных одного нейрона органов обеспечивает более однородной популяции нейронов. Другая распространенная проблема, которая может потребовать устранения неполадок является то, что кругом нетт определено, когда лазер выстрелил. Если это происходит, необходимо проверить лазерных установок и регулировать мощность и длительность по мере необходимости. Также важно, чтобы убедиться, что крышка расположена квартира на ткани и установлен правильно в руку. Ссылаясь на LCM технической эксплуатации или обратиться в службу технической поддержки иногда будет необходимо. После LCM и РНК изоляции, качество РНК всегда должна быть оценена с помощью bioanalyzer до любого анализа экспрессии генов.

Есть несколько типов инструментов лазерного захвата в настоящее время на рынке, включая лазерную резку (Life Technologies, Leica Microsystems) и лазерный катапультирования (Zeiss) инструменты. Наши LCM система хорошо работает для захвата небольшого количества клеток. Другие высокой пропускной способностью и более автоматизированные системы могут быть более подходящими для получения большего числа клеток для геномных и, в частности протеомных анализа. Действительно, LCM с помощью этих автоматизированных систем имеет большой потенциал для анализа пр.otein выражение в определенных клетках или обогащенной популяции клеток 20. Кроме того, НОК может облегчить анализ экспрессии генов в клетках immunolabeled, 21 позволяющий исследовать экспрессию генов в определенных типах клеток независимо от сложности в самых разнородных тканей. Таким образом, LCM является отличным инструментом для современных молекулярных исследований одного или обогащенной популяции клеток.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют никакого конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансируется за счет R01 NS052532 (для HLH), Moody фонда и отделения анестезиологии. Мы благодарим Лори Bolding, Кристин Courteau Батлера и Перри Кристи за их помощь в редактировании, и Кристи Perry для компоновки и выпуска превосходной все рисунки, таблицы и иллюстрации.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микроскоп лазерного захвата PixCell IIeLife Technologies (Arcturus)
Биоанализатор Agilent 2100Agilent Technologies
RNAqueous Micro- KitLife Technologies (Ambion)AM1931
Agilent 6000 Pico KitAgilent Technologies5067-1513
Capsure LCM capsПрикладные биосистемыLCM0211/LCM0214
Фтор-НефритГисто-Хим Инк.
Крезил Фиолетовый АцетатСигма-олдричC5042-10G
Ксилол (Гистологический класс)Fisher ScientificX3P-1GAL
Этанол 200 пруф (Гистологический класс)Аптечные
наконечники для пипеток UTMB без РНКазы барьерные наконечники для пипетокFisher Scientific2123635, 212364, 212361, 21-236-2A
система лазерного захвата Arcturus (Life Technologies)
Zeiss Laser Microdissection Семейство PALM
Leica Microsystems
#1FJ

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E. The medial temporal lobe. Annual Review of Neuroscience. 27, 279-306 (2004).
  2. Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev. Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
  3. Emmert-Buck, M. R., Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  4. Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
  5. Schouten, J. W. Neuroprotection in traumatic brain injury: a complex struggle against the biology of nature. Curr. Opin. Crit. Care. 13 (2), 134-142 (2007).
  6. Schmued, L. C., Albertson, C., Slikker, W. Fluoro-Jade: a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration. Brain Research. 751 (1), 37-46 (1997).
  7. Ye, X., Carp, R. I., Schmued, L. C., Scallet, A. C. Fluoro-Jade and silver methods: application to the neuropathology of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy. Brain Res. Brain Res. Protoc. 8 (2), 104-112 (2001).
  8. Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol. Brain Res. 17 (1), 47-61 (2004).
  9. Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063(2011).
  10. Shimamura, M., Garcia, J. M., et al. Analysis of long-term gene expression in neurons of the hippocampal subfields following traumatic brain injury in rats. Neuroscience. 131 (1), 87-97 (2005).
  11. Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp. Gerontol. 41 (11), 1201-125 (2006).
  12. Hellmich, H. L., Garcia, J. M., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
  13. Rojo, D. R., Prough, D. S., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS One. 6 (8), e2311(2011).
  14. Elstner, M., Morris, C. M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
  15. Chen, H., Liu, Z., et al. Genome-Wide Gene Expression Profiling of Nucleus Accumbens Neurons Projecting to Ventral Pallidum Using both Microarray and Transcriptome Sequencing. Front. Neurosci. 5, 98(2011).
  16. Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  17. Amaral, D. G., Ishizuka, N., Claiborne, B. Neurons, numbers and the hippocampal network. Prog. Brain Res. 83, 1-11 (1990).
  18. Zeng, Y. C., Bongrani, S., et al. Effect of long-term treatment with L-deprenyl on the age-dependent microanatomical changes in the rat hippocampus. Mech. Ageing Dev. 79 (2-3), 169-185 (1995).
  19. Schmued, L. C., Hopkins, K. J. Fluoro-Jade: novel fluorochromes for detecting toxicant-induced neuronal degeneration. Toxicol. Pathol. 28 (1), 91-99 (2000).
  20. Banks, R. E., Dunn, M. J., et al. The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis-- preliminary findings. Electrophoresis. 20 (4-5), 689-700 (1999).
  21. Fend, F., Emmert-Buck, M. R., et al. Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis. Am. J. Pathol. 154 (1), 61-66 (1999).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

OCT

Похожие статьи