Методическая статья

Создание клей и растворимых Градиенты для работы с изображениями миграции клеток с флуоресцентной микроскопии

DOI:

10.3791/50310

⸱

4 апреля 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Vascular Research and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales, 2School of Chemistry and Australian Centre for Nanomedicine, The University of New South Wales

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Метод для сборки клеем и растворимых градиентов в камере для микроскопии живых исследований миграции клеток описано. Инженерии окружающей среды сочетает в себе обрастания поверхности и клея треки с решением градиенты и, следовательно, позволяет определить относительную важность указания сигналы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки могут чувствовать и мигрировать в сторону более высоких концентраций клей сигналы, такие как гликопротеины внеклеточного матрикса и растворимых сигналы, такие как факторы роста. Здесь мы опишем метод, чтобы создать противоположные градиенты клея и растворимых сигналы в микрофлюидных камеры, которая совместима с изображений живых клеток. Сополимер поли-L-лизин и полиэтиленгликоля (PEG-PLL) используется для пассивации стекла покровные и предотвращения неспецифической адсорбции биомолекул и клеток. Далее, печать микроконтакта или падение пера литографии используется для создания треков стрептавидин на поверхности хроматированная в качестве точки крепления для биотинилированный пептид аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD) в качестве клея кия. Микрофлюидных устройство помещается на модифицированной поверхности и используется для создания градиента клей сигналы (100% РГД до 0% RGD) на стрептавидин треков. Наконец, те же микрофлюидных устройство используется для создания градиента хемоаттрактанта успешноч, как эмбриональная бычья сыворотка (FBS), так как растворимые кия в направлении, противоположном направлению градиента клей сигналы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Режиссер клеточной миграции является фундаментальным свойством многих клеток и является ключевым аспектом многих нормальных физиологических процессах, в том числе эмбрионального развития, защиты от инфекции и заживление ран. Кроме того, миграция клеток и играет важную роль во многих заболеваниях, таких как сосудистые заболевания, метастазирование опухолевых клеток и хронических воспалений 1,2. В то время как классические состояния клеточной миграции - поляризация, выступ расширение, формирование адгезия, сила поколения и задней отвода - как правило, принимается 3,4, выяснение пространственно-временные механизмы, с помощью которых сигнал интеграции координирует была более сложной.

Внеклеточного матрикса (ECM) служит субстратом для адгезии клеток, а через присущих химическим 5 и 6 физических разнообразие, предоставляет направленности сигналы для навигации 7,8. В дополнение к этим клеем сигналы 9, растворимые факторы 10-12 </ SUP>, таких как хемокинов и факторов роста, может вызвать направлены миграцию клеток через хемоаттрактанта рецепторов и их вниз по течению motogenic сигнализации. В настоящее время неизвестно, является ли участие и сигнализации через рецепторы адгезии (т.е. интегринов) или хемоаттрактанта рецепторов, таких как рецептор тирозинкиназы (RTK), являются доминирующими. Также не известно, является ли иерархия рецепторных систем являются специфическими типа клеток.

Онлайн микроскопии клетки дает огромное количество информации, которая не доступна в объеме анализов и могут быть объединены с микрофлюидных устройств для создания градиентов иммобилизованных 13,14 и растворимых сигналов 15 16. Метод, описанный здесь использует ряд простых и установил шаги для модификации поверхности в сочетании с коммерчески доступными микрофлюидных камеры для создания изображений анализа для миграции клеток, которые могут быть легко реализованы в лаборатории клеточной биологии (рис. 1). Собравшиесямикрофлюидных устройство имеет оптические свойства, сравнимые со стеклом 17 и градиенты диффузии молекул стабильны в течение по крайней мере 16 часов. Система может быть использована для эпифлуоресцентной и передовые методы микроскопии. В отличие от других установок хемотаксис 18, эта система подходит для записи медленно мигрируют, прилипшие клетки. Важно отметить, что система является модульной и легко позволяет внедрение альтернативных клея или растворимые сигналы миграции и исследования различных типов клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Пассивация Покровные стекла с PLL-PEG-биотин

Этот шаг предназначен для пассивации поверхности, так что клетки придерживаются и переносить на конкретных регионов на стекло покровное, которые создаются с microcontract печати (шаг 2-3а) или падение пера литографии (Шаг 3b). Для пассивации, сополимер поли-L-лизин (PLL) и полиэтиленгликоля (PEG) используется в которой 20% молекул ПЭГ привиты с биотином (PLL-PEG-биотин).

  1. Для очистки стекла покровные (18 мм х 18 мм), погрузить их в стойке на 100% этанола и установите решетку на ультразвуковую ванну в течение 30 минут. Протрите стекло покровные в воздухе или под струей азота.
  2. Далее, разрушать ультразвуком покровные стекла в течение 30 мин в 1 М NaOH. После этого промойте поверхность стекла тщательно погружения стойку в стакан наполнен 1,5 л Milli-Q H 2 O. Повторите процесс промывки три раза свежих Milli-Q H 2 O каждый раз. Протрите стекло покровные вдуховке при температуре 60 ° C.
  3. Место половине чистое стекло покровные индивидуально во влажной камере, которая состоит из 24-луночный планшет частично заполненный H 2 O. Оставьте 15 мкл PLL-PEG-биотин (1 мг / мл) в PBS на каждый стакан покровное. Возьмите другую половину оставшейся чистой покровные стекла и тщательно сэндвич-PEG решение. Оставьте покровные в течение 1 ч во влажной камере. Вставьте зажатой покровные мягко далеко друг от друга, не поцарапав PEG-покрытием и промойте их Milli-Q H 2 O. Вода должна легко соскальзывать на PEG-лечение сторону. Если необходимо, воздушно-сухого стекла покровные на бумажном полотенце с обработанной поверхностью вверх. Храните стекло покровные в вакуум-эксикаторе до дальнейшего использования.

2. Изготовление штампов для микроконтактной печати

Дается описание двух процессов треков картины стрептавидин на хроматированная покровные стекла. Первое, микрофонrocontact печати, как правило, требует изготовления мастер кремния, из которого штамп PDMS брошен. В нашем случае, рисунок на штамп PDMS на 100 мкм всей линии, расположенные на 290 мкм от центра до центра с функцией высотой 25 мкм. Ниже мы кратко опишем, как изготовить подходящую мастер кремния (шаг 2.1-2.3) и штамп PDMS (шаг 2,4). Тем не менее, существует несколько протоколов для микроконтактной печати описаны в литературе 19-23, которые подходят для печати белка моделей на стекло покровные. Мастера также может быть выполнена на заказ и приобрести из коммерческих источников.

  1. Во-первых, очистить кремниевой пластины (4 "в диаметре) путем инкубации ее в пираньи решение (3:1 V: серной кислоты и 30% перекиси водорода). Течение 20 минут промойте пластины тщательно 10 раз MilliQ H 2 O. Сухие пластины в духовке при 150 ° CO / N.
  2. Промойте чистой и сухой кремниевой пластины со 100% ацетоном, а затем 100% изопропилового спирта. Следующийспин-пальто 2 мл GM1070 SU-8 фоторезиста (Gersteltec Sarl) на пластине при 3100 оборотов в минуту в течение 40 секунд, чтобы создать толщиной 25 мкм слоя. Затем образец запеченные на горячей плите при температуре 65 ° С в течение 5 мин, а затем еще в течение 5 мин при 95 ° C.
  3. Expose SU-8 фоторезиста к УФ-светом в течение 60 секунд при фотошаблонов с желаемой картины (например, с помощью Quintel Q6000 маски Aligner) и повторить процесс выпечки описаны в п. 2.2. Затем образец разработан погружение подложки в SU-8 разработчик (Gersteltec Sarl) в течение 4 мин, промывают в 100% изопропилового спирта и сушат в токе азота. Площадь SU-8 фоторезиста, который не подвергается воздействию УФ света, таким образом, удалить, создать обратную картину штамп PDMS.
  4. Следующим шагом является приведение штамп PDMS от мастера кремния. Во-первых, тщательно смешать 1 часть (в / в) от отвердителя с 10 частями из эластомера форполимера (Sylgard 184). Для удаления пузырьков воздуха, дегазации смеси в эксикаторе прикреплены к вакуумной линиив течение 1 часа. Затем залить эластомера PDMS на кремнии мастер внутри чашки Петри около 1 см в высоту и вылечить мастера и PDMS смесь в духовке при температуре 70 ° С в течение 1 часа. Наконец, штамп PDMS удаляется от мастера кремния и нарезанные по размеру.

3. Стрептавидин Создание массивов или клей Cues на Пассивированная Покровные стекла

После пассивирующего покровные стекла, белка модели печатаются с микроконтактной печати (шаг 3а) или падение пера литографии (Шаг 3b). В нашем случае, стрептавидин печатаются в виде линий, которые образуют основу для градиентов RGD (Шаг 4). Такая же процедура также может быть использована для печати матричные белки для создания клея моделей.

Альтернативный метод микроконтактной печати для структурирования биомолекул на поверхности является падение пера литографии. В падению пера литографии, консольные используется для передачи небольших объемов раствора на поверхность. Размер консолями, VВязкость раствора, времени контакта кантилевера на поверхность, гидрофобность поверхности и влажности в камере печати определить размер печатной возможности. Преимуществом этого метода является то, что различные модели могут быть распечатаны для каждого эксперимента, так как нет необходимости в изготовлении мастеров и штампов. Недостатком является то, что она занимает больше времени, чтобы распечатать данный шаблон, и что падение пера литографии требуется специалист инструментов, которые не могут быть доступны во многих лабораториях. Литография падение пера инструмент, который мы использовали, был NanoeNabler от Bioforce Нанонауки. Здесь мы печатали маленьких точек, которые были <10 мкм в диаметре, на которые мы использовали SPT10 консолей.

3а. Микроконтактной печати (μCP) Техника

  1. Чтобы очистить и сделать штамп PDMS более гидрофильными, лечить узорные стороны штампов PDMS в УФ и озона (например, УФ-Procleaner озона из Bioforce Нанонауки) в течение 1,5 часов. Кроме того, использование плазменногоочиститель для более короткое время для этой же цели. Этот процесс создает окисленные PDMS поверхность 24, которая улучшает процесс печати.
  2. Сразу после того, озон или плазменной обработки, месте и распространить 10 мкл стрептавидина (1 мг / мл в PBS) на марках PDMS и оставить на 1 час во влажной камере (например, частично заполненный 6-луночный планшет, см. Шаг 1,3) . Если треки должны быть видны под флуоресцентным микроскопом, использовать стрептавидин, что сопряжено с флуорофором, таких как стрептавидин-AlexaFluor350.
  3. Удалите излишки стрептавидин от штампа с бумагой и сухой воздух штамп в течение примерно 1 мин. Слегка нажмите на штамп на PLL-PEG-биотин-покровного стекла с покрытием.
  4. Если флуоресцентные стрептавидин был использован в шаге 3.a2, изучить образец, используя при эпифлуоресцентной микроскопом. Хранить печатных поверхностях в эксикаторе.

3b. Dip Pen Литография

  1. Во-первых, смешать 1 часть 1 мг / мл стрептавидин или STREptavidin-AlexaFluor350 с 10 частей глицерина (V / V) и загружаете 5 мкл смеси на консоли. Затем начинается процесс печати, как описано в руководстве по эксплуатации литографии инструмент пера падение. Чтобы уменьшить размер пятна около 5 мкм, регулировать скорость печати, обратитесь время кантилевера на поверхность или вертикальное расстояние от кантилевера на поверхность. В примере, приведенном на рисунке 2, в точках были напечатаны в соответствии с строк и столбцов разделения установлен в 10-15 мкм. Это расстояние является достаточным для предотвращения точек от слияния друг с другом, но позволяет просматривать несколько точек в одном поле зрения с самых настройках микроскопа.
  2. Хранить печатных поверхностях в эксикаторе.

4. Создание клей Градиенты на стрептавидин-модель поверхности

Мы создали клей градиенты биотин-RGD на стекло покровные, которые покрыты стрептавидина (рис. 3) или соntain стрептавидин узоры на хроматированная покровные стекла (рис. 5). Для создания градиента поверхности, мы использовали имеющийся в продаже микрофлюидных устройство (так называемые липкие-Slide Хемотаксис 3D от Ibidi), что создает устойчивый градиент решения путем пассивной диффузии. Чтобы успешно конкурировать на стрептавидин сайты связывания, мы использовали две противоположные градиенты биотин-RGD и биотина, который не был конъюгированных с RGD (см. Рисунок 1).

  1. Придерживайтесь покрытой стрептавидином покровные или-узорчатого стекла на липкой стороне липкой Презентация Хемотаксис 3D-устройства. Чтобы убедиться, что нет утечки в течение нескольких часов, по краям устройства запечатаны тонким слоем вазелина и нагревали со вторым слоем смеси из 1 части вазелина и 1 части парафина (м / м).
  2. Заполните канал устройства с 6 мкл PBS в канале. Затем залейте двумя резервуарами с 70 мкл 0,03 мкг / мкл биотин-4-флуоресцеина в PBS и 70-мU; л 0,03 мкг / мкл биотин-RGD в PBS, соответственно. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в темноте в течение 1 часа.
  3. Снимите биотин решениях и тщательно промыть поверхность, а еще привязаны к микрофлюидных устройство дважды с PBS. Отметить направление градиента клея и, если необходимо, храните устройство заполнено PBS при 4 ° С в течение но убедитесь, что устройство не высыхает. При необходимости проанализировать клей градиент с флуоресцентным микроскопом.

5. Маркировка Клетки с флуорофоры для живых клеток

Клетки помечены флуоресцентными красителями, которые помогают клетке отслеживания под флуоресцентным микроскопом. Общие зонды флуоресцентных маркеров органелл, таких Syto 64 Red, который называет клеточного ядра. Для этого клетки сначала три раза промывают PBS, затем инкубировали с 1 мкМ Syto 64 красных в культуральной среде в течение 45 минут и, наконец, промывали еще три раза с PBS. Пожалуйста, обратите внимание, что клетки не должно бытьхраниться в PBS в течение длительного периода времени.

Альтернативные красители для сотового слежения, CellTracker серии, которые окрашивают цитоплазму и сохраняется во время миграции и деление клеток. Трансфекции клеток с флуоресцентным белком слияния особенно полезна для записи субклеточном распределении интерес белка во время миграции. Тем не менее, флуоресцентные белки обычно фото-отбеливатель быстрее, чем органические красители, так что долгосрочных наблюдений может оказаться невозможным.

6. Загрузка Клетки с Растворимые Gradient в устройство Microfluidics

  1. Граф флуоресцентно меченых клеток и разделилась на две трубы из равного числа клеток. Вымойте и ресуспендируют одна трубка клеток с носителя, содержащего хемоаттрактанта, таких как изменение Eagle низкий уровень глюкозы в Дульбекко Medium (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Вымойте и ресуспендируют другие трубки клетки в средах без хемоаттрактанта, т.е. DMEM с 0% FBS. Конечная концентрацияклеток в каждой пробирке должна быть 5 х 10 5 клеток / мл.
  2. Удалите все решения от микрофлюидных устройства (начиная с шага 4,3) и поместить его на предметный столик микроскопа (см. Шаг 7). Загрузите 70 мкл клеток (5 × 10 5 клеток / мл в 0% FBS DMEM) в одном резервуаре и 70 мкл клеток HeLa (5 х 10 5 клеток / мл в 10% FBS DMEM) в другой. Свободно разместить ленты на водохранилищах, чтобы избежать испарения. Если клетки на поверхности предварительно инкубировали до визуализации, желательно, что клетки будут загружены в устройство в питательной среде без градиента. Устройство помещается на столик микроскопа и средств массовой информации заменили градиентных сред DMEM т.е. без FBS в одном резервуаре и DMEM с 10% FBS в другой.

7. Изображений живых клеток и анализ данных

  1. Включите микроскопа (Nikon Ti-E) и согреться этапе по крайней мере, 1 ч до начала эксперимента.
  2. Убедитесь, что канал микрofluidic устройство находится в поле зрения и клетки находятся в фокусе. Выберите изображение приобретение параметров, таких как воздействие раза и флуоресцентных фильтров, последовательность изображений из светлого поля и флуоресценции, которая фиксирует клетки и композиции, а также моменты времени и длительности записи (например, каждые 15 минут в течение 16 часов).
  3. Анализ данных с соответствующими программного обеспечения, таких как ImageJ Руководство слежения или Ibidi хемотаксиса и миграции Tool.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы понять, как клетки интеграции миграционных сигналов 25, мы разработали метод изображений клеток с флуоресцентной микроскопии, которые мигрируют в окружающую среду с конкурирующими клея и растворимых градиентов (рис. 1). Клей треков, которые содержали флуоресцентные стрептавидином и биотинилированным RGD были созданы с микроконтакта печатных дорожек и падение пера литографии (рис. 2). Успешная печать микроконтакта указывается профиль линии интенсивности флуоресценции чер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе, мы использовали имеющийся в продаже микрофлюидных устройства (липкие-Slide Хемотаксис 3D от Ibidi) для изучения последствий химически модифицированной поверхности и хемоаттрактанта градиентов на миграцию клеток. Это микрофлюидных установка не требует потока, потому что градиент устанавливается путем диффузии по длине канала. Это важно, поскольку поток может повлиять дифференциально медленно мигрируют клетки, такие как фибробласты, образующие стабильные фокальные адгезии и быстро мигрирующих ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У нас нет никаких коммерческих интересов раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы признают, финансирование из Австралийского исследовательского совета и национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии, а также хотел бы поблагодарить Австралийский Национальный фонд для изготовления SU-8 мастер для микроконтакта печати. SHN при поддержке Министерства высшего образования Малайзии и Universiti Sains Малайзии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Одежда для окрашивания покровного стеклаThomas Scientific8542 E40Стеллаж для покровного стекла
ПечьBinderED 53 series
Силиконовая пластинаSilicon Quest708-007Бор легированный < 100> , диаметр 4 дюйма, 500 мкм; m, односторонне полированный
GM1070 SU-8 фоторезистGersteltec Sarl
SU-8 проявительGersteltec Sarl
Sylgard 184 отвердительDow Corning
Sylgard 184 преполимер эластомераDow Corning
PLL-PEG-биотин (20%)SuSos AGPLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-биотин (20%)1 мг/ мл в PBS
ФлуоресцеинSigma469551 мМ в PBS
Streptavidin-AlexaFluor350InvitrogenS-112491 мг/мл в PBS
Biotin-4-флуоресцеинInvitrogenB-13700,03 g/μ л в PBS
Биотин-РГДGenScriptSC12080,03 мг/мл в PBS
Syto 64 RedInvitrogenS-113461 μ M in PBS
Липкое горное стекло хемотаксис 3DIbidi80328
200 μ l Greiner желтый скошенный наконечникGreiner Bio-One739261
вазелиномSigma16415
Парафин, mp 55-57 ° CSigma327204
Nano eNabler 10 μ m кантилевер BioForceSPT-S-C-10s
Image J программное обеспечениеНационального института здравоохраненияrsbweb.nih.gov/ij/download.html
Manual Tracking pluginFabrice Cordeliè resrsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Chemotaxis and Migration ToolIbidi GmbHwww.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pulsipher, A., Yousaf, M. N. Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration. Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).
  2. Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).
  3. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  4. Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. Environmental sensing through focal adhesions. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).
  5. Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).
  6. Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
  7. Geiger, B., Yamada, K. M. Molecular architecture and function of matrix adhesions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).
  8. Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e, Gooding, J. J., Gaus, K. How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration. Journal of Oncology. 2010, 363106(2010).
  9. Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate. Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).
  10. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
  11. Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128(2011).
  12. Chung, B. G., et al. A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology. J. Vis. Exp. (7), e271(2007).
  13. Rhoads, D. S., Guan, J. L. Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules. Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).
  14. Park, J., et al. Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel. Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).
  15. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).
  17. Frequently Asked Questions (FAQ) :: ibidi [Internet]. , ibidi GmbH. Available from: http://www.ibidi.com/service/faq.html (2010).
  18. Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. Assays for eukaryotic cell chemotaxis. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).
  19. Thery, M., Piel, M. Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol. Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255(2009).
  20. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065(2008).
  21. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).
  22. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).
  23. Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration. Biomicrofluidics. 5, 13412(2011).
  24. Hillborg, H., et al. Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques. Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).
  25. Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins. Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).
  26. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).
  27. Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Schönbein, G. W. The leukocyte response to fluid. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).
  28. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).
  29. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).
  30. Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of dip-pen nanolithography. Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).
  31. Wouters, D., Schubert, U. S. Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices. Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).
  32. Xia, N., et al. Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation. FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).
  33. Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Adhesive GradientSoluble GradientMicrofluidic ChamberPLL PEG PassivationMicrocontact PrintingDip Pen LithographyStreptavidin PatterningBiotinylated RGDFBS GradientLive Cell Imaging

Похожие статьи