Запись электрической активности нейронов Выявленные в интактном мозге трансгенных рыб

Yali Zhao; Nancy L. Wayne

doi:10.3791/50312

Методическая статья

Запись электрической активности нейронов Выявленные в интактном мозге трансгенных рыб

13.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50312

⸱

30 апреля 2013 г.

Yali Zhao¹ , Nancy L. Wayne¹

¹Department of Physiology, University of California, Los Angeles

В этой статье

Краткое содержание

В этом видео мы покажем, как для записи электрической активности отдельных нейронов определены в целом подготовка мозга, который сохраняет сложные нейронные цепи. Мы используем трансгенных рыб, в котором гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) нейронов генетически помечены флуоресцентным белком для идентификации в неповрежденной подготовки мозга.

Аннотация

Понимание физиологии клеток нейронных цепей, которые регулируют сложные поведения значительно повышается при использовании модели системы, в которых эта работа может быть выполнена в интактной подготовка мозга, где нервной системы ЦНС остается неизменным. Мы используем трансгенных рыб, в котором гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) нейронов генетически помечены зеленым флуоресцентным белком для идентификации в неповрежденном мозге. Рыбы имеют несколько популяций ГнРГ нейронов, и их функции зависят от их расположения в мозге и ГнРГ ген, который они выражают ^1. Мы сосредоточили наши демонстрации на GnRH3 нейронов, расположенных в терминале нервов (TN), связанные с использованием обонятельных луковиц интактном мозге трансгенных рыб оризии (рис. 1В и С). Исследования показывают, что оризии TN-GnRH3 нейроны нейромодуляторных, действующего в качестве передатчика информации из внешней среды в центральной нервной системе; тЭй, не играют непосредственную роль в регуляции гипофизарно-половая функция, как это делают известные нейронов гипоталамуса GnRH1 ^{2, 3.} тоником модель спонтанной стрельбы потенциал действия TN-GnRH3 нейронов является внутренним свойством ^4-6, частота которой модулируется визуальные сигналы от сородичей ² и нейропептид kisspeptin 1 ^5. В этом видео, мы используем устойчивую линию трансгенных оризии в которых TN-GnRH3 нейроны экспрессируют трансген, содержащий промотор области Gnrh3 связана с расширенной зеленого флуоресцентного белка ^7, чтобы показать вам, как определить нейроны и следить за их электрической активности всего головного мозга подготовка ^6.

Протокол

1. Рассечение Головной мозг взрослого Оризии

Обезболить взрослого мужчины или женщины (рис. 1А) путем погружения в 5 мл MS-222 (150 мг / л, рН 7,4), подождать пару минут после жабры движения перестали перед обезглавить. Все процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе.
Обезглавить рыба в рыбе солевого раствора при хвостового конца жаберной крышки с ножницами в 60-мм чашку Петри диаметром.
Передача голова рыбы к 35-мм чашку Петри диаметром, наполовину заполненный рыбой солевые и выстроились с Sylgard, которая имеет углубление в его положение и закрепите головку для мозга рассечение. Положение и закрепите головы спинной стороной вверх с насекомых булавками.
Аккуратно вырежьте спинной части черепа по его периметру с тонкими ножницами и осторожно удалить с помощью пинцета, выставляя спинной части мозга в том числе полностью переднюю часть спинного мозга.
Поднимите спинного мозга осторожно тонким кончиком пинцета и отделят двусторонних соединительных нервов с острым концом ножниц: черепно-мозговых нервов, спинномозговых нервов и зрительных нервов на брюшной стороне мозга и обонятельных нервов в передней части мозг.
Поместите полностью расчлененный мозга в свежем чашку Петри с рыбой солевого раствора и тщательно проверить под микроскопом, чтобы обеспечить весь мозг цели (в том числе гипофиза) без каких-либо сокращений или проколов. Повреждение мозга не используются для экспериментов.

2. Монтаж мозг в записи камеры

Поместите небольшую каплю цианоакрилат или другие быстродействующие клей с помощью иглы в центр записи камеры и распространение клей около 1 см ^2.
Быстрый перенос мозга и приклейте ее вниз в вентральной стороной вверх положении.
Добавить 1 мл солевого рыбу так, чтобы она заполнила записи камеры и охватывает мозг. Постоянно заливатьмозга с газировкой солевой рыбу со скоростью не менее 200 мкл / мин.
Использование тонким кончиком осторожно удалить пинцетом мозговые оболочки по поверхности области записи головного мозга.

3. Электрофизиологии

Свободные записи патча действия стрельбе потенциальную
1. Стекло микроэлектродах (6-10 МОм) строятся из боросиликатного стекла пипетки (1B150F-4, инструменты Всемирного Precision) с использованием электрода съемник (например Саттер Р-87), и обратно заполненные свободную патч записи решения на полпути электрода.
2. Использование вертикального флуоресцентный микроскоп с охлаждением прибора с зарядовой связью (ПЗС) камеры, найти GFP-экспрессирующих TN-GnRH3 нейронов через 10x (рис. 1В), то погружение в воду 40x цели (рис. 1в). Они расположены на или вблизи вентральной поверхности обонятельных луковиц, просто впереди конечного мозга.
3. Переключитесь на видеомонитор, который предоставляетизображений в реальном времени с микроскопом, чтобы найти TN-GnRH3 нейрон кластер (рис. 1в).
4. Поместите микроэлектрода в ванну так, чтобы кончик электрода выше целевого нейрона. Применение постоянного небольшое положительное давление в микроэлектрода так, что она не засоряются и осторожно подходить к целевой нейрона с кончиком электрода.
5. Проверять и контролировать сопротивление электрода в фиксации потенциала режиме с помощью программного обеспечения и усилителем AxoGraph Axoclamp 200B Axograph с программным обеспечением (Axon Instruments). Когда вы можете видеть на мониторе, что кончик электрода на поверхности нейронов и от AxoGraph дисплей, что сопротивление изменяется незначительно, отпустите положительным давлением и нанесите небольшое отрицательное давление, если это необходимо, чтобы сделать низкое сопротивление уплотнения на нейрона (<100 МОм).
6. Переключить на текущий зажим режиме и записывать напряжение мембраны непрерывно без тока, настройка масштабанапряжения и скорости записи, если это необходимо. Данные, собранные и проанализированные Powerlab программное обеспечение (ADInstruments Inc.)
7. Запись базовой электрической активности в нормальном солевом растворе рыбы в течение примерно 5 мин до процедуры (рис. 2А). Ванна перфузии наркотиков, гормонов, пептидов и др. добавлены рыбы солевой продолжается со скоростью 200 мкл / мин с последующим периодом выведения в нормальном солевом рыбы ^{5, 6, 11.}
Запись всего клетки мембранного потенциала
Целой клетки патч зажим электрофизиологии процедура та же, что и внеклеточный свободную патч записи процедуру, описанную выше, на этапах 3.1.1 - 3.1.4. Тогда процедур отклоняются соответственно:
1. Проверять и контролировать сопротивление электрода в фиксации потенциала режиме. Когда вы можете видеть на мониторе, что кончик электрода на поверхности нейронов и от осциллографа, что сопротивление изменяется незначительно, отпустите положительнымдавлением и нанесите немного отрицательным давлением, чтобы сделать высокое сопротивление уплотнения на нейрон (~ 3 гига Ω). Нежный всасывания ртом к разрыву мембраны исправленная, вы увидите, внезапное падение сопротивление примерно до 120-250 МОм.
2. Переключить на текущий зажим режиме и записывать напряжение мембраны непрерывно без тока, регулируя масштаб напряжения и скорости записи, если это необходимо.
3. Запись базовой электрической активности в нормальном солевом растворе рыбы в течение примерно 5 мин до процедуры, как описано выше в 3.1.7 (фиг. 2В).