Методическая статья

Долгосрочные молчание интерсектин-1 в легких мышей по повторной сдачи Конкретные миРНК через катионные липосомы. Оценка нокдаун эффекты электронной микроскопией

10.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50316

⸱

21 июня 2013 г.

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Rush University, 2Pulmonary and Critical Care Department, Rush University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Повторные ретро-орбитальной инъекции катионные комплексы liposomes/siRNA/ITSN-1s у мышей, каждые 72 часа в течение 24 дней, эффективной доставки миРНК дуплекс с микрососудов легких у мышей снижение ITSN-1 мРНК и экспрессию белка на 75%. Этот метод хорошо воспроизводимый в животной модели, не имеет побочных эффектов и позволяет избежать летальных исходов.

Аннотация

Предыдущие исследования показали, что нокдаун ITSN-1S (KD ITSN), эндоцитотический белок, участвующий в регуляции проницаемости сосудов легких и эндотелиальные клетки (ECS) выживание, индуцированного апоптоза, основным препятствием в развитии системы клеточных культур с длительным ITSN-1S торможения 1. Использование катионных липосом в качестве носителей, мы исследовали молчание ITSN-1 гена в легких мышей при системном введении миРНК ориентации ITSN-1 ген (миРНК ITSN). Катионные липосомы обладают рядом преимуществ для доставки миРНК: Допускаются повторные дозировки, неиммуногенные, нетоксичны и легко производить 2. Липосомы производительности и биологической активности зависит от их размера, заряда, липидный состав, стабильность, доза и способ введения 3 Здесь, эффективный и специфический KD ITSN в легких мышей были получены с использованием холестерина и диметил диоктадецил сочетание бромид аммония. Внутривенного введениямиРНК ITSN / катионной липосомы комплексы временно сбил ITSN-1 белка и мРНК в легких мышей на 3 день, который восстановился после еще ​​3 дня. Воспользовавшись тем, что катионные липосомы как безопасного перевозчика, повторяемые, исследование продлен на 24 дней. Таким образом, ретроорбитальной лечения с только что созданной комплексы вводили каждые 3 дня, вызывая устойчивый KD ITSN на протяжении всего исследования 4. Мышь ткани, собранные в нескольких временных точках после миРНК ITSN подвергали электронной микроскопии (ЭМ) анализы, чтобы оценить эффекты хронического KD ITSN, в легких эндотелия. Высокое разрешение изображения EM позволило нам оценить морфологические изменения, вызванные KDITSN в постели легких сосудистого (т.е. разрушение эндотелиального барьера, снижение количества кавеолы ​​и активацию альтернативные пути транспортировки), характеристики необнаруженными с помощью световой микроскопии. Общая этих выводов установленным важноеважную роль ITSN-1 в функции ЭКС и легких гомеостаза, а иллюстрирующие эффективность миРНК-липосомы доставки в естественных условиях.

Введение

Голые миРНК не может проникать через клеточную мембрану электрический заряд, и она легко разрушается ферментами в крови, тканей и клеток. Даже недавно структурных модификаций для улучшения стабильности, миРНК накопление в сайте-мишени после введения чрезвычайно низка и требует эффективного внутриклеточных транспортных средств 5. Катионные липосомы стала безопасной нуклеиновых кислот носителей с потенциалом для передачи больших фрагментов ДНК / РНК в клетки путем инкапсуляции и защиты нуклеиновых кислот из ферментативного расщепления 6. Кроме того, катионные липосомы спонтанно взаимодействуют с ДНК / РНК, тем самым способствуя переноса генов в клетки 2. Совсем недавно липосомы были применены для доставки вакцин и низким молекулярным весом препаратов 7. Липосомальной доставки микроРНК-7, экспрессирующих плазмид преодолевает рецептора эпидермального фактора роста ингибитор тирозинкиназы сопротивление в клетках рака легких 8. При ориентациисосудистого эндотелия, внутривенного введения важно, потому что комплексы вряд ли пересечь барьер эндотелиальных и вытекать из сосудов в ткань и интерстиций 9. По сравнению с другими органами, КЕ из микрососудов легких имеют наибольшее поглощение и жадно интернализации катионной липосомы и ДНК / РНК комплексов, а затем в лимфатических узлах и пейеровых бляшек 9. Внутривенное доставки на моделях грызунов миРНК через ретро-орбитальной или хвостовой вены инъекций было доказано безвредны даже в высоких концентрациях, например, 50 мг / кг 10. В опубликованной литературе состав катионные липосомы отличается на основе липидов разработки и их эквимол рном соотношении 11, 12. Существует широкий спектр потенциальных приложений с использованием катионных липосом для доставки генов в естественных условиях, будь таргетинга down-regulation/over-expression белков, поставка вакцин или противоопухолевой терапии 13-15. Важно помнить,является то, что эффективность ДНК / РНК-клеточное взаимодействие мембраны регулируется форма связи между генерируется комплексов и мембранных липидов. Это предполагает, что пошива липиды состав к целевой сотовой профилей мембрана может быть полезно и в результате высокий уровень трансфекции в конкретном типе клеток 6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Катионные липосомы подготовка

  1. Автоклав чистую круглодонную колбу, которые будут использоваться для подготовки lipososmes.
  2. Подготовка исходных растворов:
    1. - Растворить 200 мг диметил диоктадецил бромид (Doab) в 10 мл хлороформа с помощью небольшой стеклянной бутылки.
    2. - Растворить 200 мг холестерина в 10 мл хлороформа с помощью небольшой стеклянной бутылки.
    3. - Подготовка и автоклав для стерилизации 5% глюкозы в 100 мл РНК / ДНК-азы бесплатно дистиллированной воды.
  3. Промойте круглодонную колбу хлороформом. Добавить 5-10 мл в колбу, вихря, и оставьте на несколько минут. Держите колбу, покрытую алюминиевой фольгой во все времена. Слейте хлороформа из колбы.
  4. Получения липосом:
    1. - Добавить 315 мкл исходного раствора Doab в круглодонную колбу.
    2. - Добавить 200 мкл раствора холестерина в колбу.
    3. - Добавить 9.5 мл хлороформа в колбуй смешать вихрем.
  5. Установка роторном испарителе при 37 ° С, 100 оборотов в минуту (RPM) или более (100-120 оборотов в минуту). Роторном испарителе должен быть подключен к воде вакуумный насос управления с всасывающей трубкой правильно установлены.
  6. Подключите бак аргоном и роторного испарителя.
  7. Прикрепить колбу роторного испарителя и корректировать оптимальные настройки перед опусканием его в водяной бане. Откройте первый клапан для аргона полностью, повернув его против часовой стрелки. Всегда открывать и закрывать этот клапан в первую очередь. Второй клапан регулирует давление аргона дует в колбу. Давление должно быть всегда нежным.
  8. Опустите роторный испаритель в ванну с водой, достаточно для колбы прикоснуться к воде, не будучи полностью погружен и включите скорость.
  9. Подождите, пока все испаряется хлороформ, около 10 мин. Тогда остановите машину.
  10. Выключите скорость роторного испарителя и клапаны аргона бака. Теперь колбы должны быть удалены.
  11. Добавить 2 мл 5%-й глюкозыэлектронной колбу, чтобы растворить липиды.
  12. Царапины дне колбы тщательно с использованием 1 мл пипетки, чтобы растворить все липиды. После расчесывания, удалите оставшиеся жир с 1 мл наконечник в колбе, при необходимости, со второй чаевые.
  13. Инкубируют полученного раствора в 42 ° С на водяной бане, медленно вортексе (15 оборотов в минуту) в колбе.
  14. Заполните ультразвуковой ванне с холодной водой. Разрушать ультразвуком решение, по крайней мере 20-30 минут в колбе, поднял и нижний едва касаясь воды.
  15. Нагревают колбу на водяной бане в роторном испарителе в течение 20 мин при 42 ° С, при нулевой скорости, с круглым дном, погруженных в воду, на этот раз.
  16. Фильтр липосом через 0,47 мкм, а затем 0,22 микронные фильтры шприца.
  17. С помощью небольшой экструдер, фильтр липосом через 50 нм мембраны для создания гомогенной популяции однослойных липосомных везикул.
  18. Передача липосом в пробирку Эппендорф и поместить его на льду.

2. Подготовьте липосомы: миРНК ITSN-1 Комплексы

  1. Ресуспендируют на цели мышь миРНК ITSN миРНК в буфере, содержащем 20 мМ HEPES и 150 мМ хлорида натрия, рН 7,4, до конечной концентрации 2 мкг / мкл. Держите его на льду перед смешиванием.
  2. Подготовьте липосомы: комплексы миРНК ITSN в соотношении 8 нмоль липосомы: 2 мкг РНК (или 400 нмоль липосомы: 100 мкг миРНК ITSN). В настоящем исследовании мы добавили 50 мкл миРНК ITSN от маточного раствора (50 мкм) до 100 мкл свежеприготовленного липосомы использованием РНК / ДНК-азы бесплатно Эппендорф трубки. Следует отметить, что концентрация миРНК ITSN очень важно, поскольку максимум 150 мкл смеси может быть двусторонней и ретро-орбитальной впрыском в мыши в одно время.
  3. Смесь необходимо хранить на льду в ожидании вводят мышам.

3. Мышь ретроорбитальной вену (внутреннего угла глазницы)

jove_content "> Все мыши Эксперименты были одобрены и осуществлялась в соответствии с руководящими принципами Rush University Институциональные уходу и использованию животных комитета.

  1. Обезболить мыши с помощью интраперитонеальной инъекции 50 мг / кг веса тела кетамина и 5 мг / кг массы тела ксилазина (коммерчески доступные смеси). В зависимости от веса и возраста животного, регулировать анестетики объем и концентрации. Мыши, используемые в исследовании мышей CD1 мышей-самцов, в возрасте 6-8 недель и весом около 25 граммов. Шприцы туберкулин 1 мл типа с иглой.
  2. Удерживайте мышь уши одной рукой и переверните мышь вниз на сторону, чтобы выставить внутреннего угла глаза. Цель медиальнее складка semilunaris; не прикасайтесь к глазному яблоку.
  3. Подход слезный гребень из глаза проведение шприц, содержащий смесь при углом 45 градусов по всем трем осям.
  4. Медленно введите смеси и пусть мышь, чтобы восстановить с вводят стороной вверх. Если большое жидкостькапли форм на месте вставки иглы, втянуть иглу, всасывание обратно капли в шприц и повторите попытку. Повторные инъекции лучше всего делать путем чередования глаз, чтобы идеально восстановления. Если не уверены, эта методика может быть проверена путем инъекции синего красителя (50 мкл, 0,5% кристаллическим фиолетовым в метаноле) и подвергая легких мышей наблюдать синий сосудистой сети.
  5. Мышей в этом исследовании вводили каждый 3-й день в течение 3 недель без смертельных исходов или побочных эффектов.

4. Мышь перфузии легкого и сбора ткани для биохимических исследований

  1. Установите перистальтический насос работать на 1,5 мл / мин.
  2. Подготовьте установка: вентилятор, операционный стол, инструменты, стерильные ватные тампоны, ватные палочки, струны, мензурки, дистиллированная вода, сбалансированный солевой Хэнка, Tracer.
  3. Обезболить мыши путем внутрибрюшинной инъекции анестезирующего смесь (100 мг / кг веса тела кетамина и 10 мг / кг массы тела ксилазин).
  4. На уровне шеи, удалите слюнных желез и подвергать трахеи.
  5. Начните с лапаротомии, акциз диафрагмы, и следовать с торакотомии, обнажая легких и сердца.
  6. Удалить тимуса.
  7. С помощью световой микроскопии для большей точности, катетеризации легочной артерии.
  8. У трахеостомии и интубации мыши с помощью трахеостомы. Установить вентилятор для со скоростью 150 ударов / мин и рабочим объемом 150 мкл.
  9. Как выход, откройте левое предсердие.
  10. Заливать сосудистой легких у мышей свободный крови в течение 5 мин с использованием перистальтического насоса и раствор Хэнка нагревают при 37 ° С.
  11. Заливать изотопу (8 нм золотых альбумин 16) еще в течение 10 мин при той же скорости потока.
  12. Промойте несвязанных Tracer на 5 мин перфузии легкого раствор Хэнка.
  13. Последующие с на месте фиксации легких на 10 мин перфузии 4% (вес / объем) формальдегида, 2,5% глутарового альдегида и 1% дубильной кислоты в 0,1 ТРУБЫбуфером, рН 7,2.
  14. Соберите легких, удалите чрезмерное ткани, нарезать небольшими блоками (3/3 мм), и поместить их в с меченым сцинтилляционный флакон с 2 мл смеси фиксатором.

Мыши истекает полностью под наркозом во время процедуры.

5. Мышь легких обработки ткани для ЭМ

  1. Подготовка исходных растворов: 1% Palade OsO 4, ацетат веронала и Келленбергером буфера.
    1. - 1%-Палада OsO 4 буфер содержит 1 мл уксусной кислоты веронала акции, 1,25 мл 4% OsO 4, 1 мл 0,1 N соляной кислотой и дистиллированной водой до 5 мл конечного объема.
    2. - Ацетат веронала маточный раствор получают растворением 1,15 г ацетата натрия andydrous и 2,94 г барбитал в 100 мл дистиллированной воды.
    3. -Келленбергер раствор содержит 2 мл ацетатного веронала акции, 2,8 мл 0,1 N соляной кислоты, 0,05 г ацетата уранила и 5,1 млдистиллированной воды, рН 6.
  2. Промыть легких блоков в 0,1 М натрий-какодилатном буфере, рН 7,4, кратко 3 раза.
  3. Закрепить образцов в 4% (вес / объем) формальдегида, 2,5% глутарового альдегида в 0,1 ТРУБЫ буфера, рН 7,2, в течение 1 ч при комнатной температуре.
  4. Постфиксных с 1%-Palade осмия в течение 1 часа в капюшоне, на льду, в темноте.
  5. Полоскание один раз буфером Келленбергер.
  6. Образцы инкубируют в Келленбергер буфера в течение 2 ч в течение ночи при комнатной температуре.
  7. Полоскание один раз в 50%-ном этаноле.
  8. Высушить с серии градуированных этанола, 5 мин / каждая: 70%, 95%, затем 2 х 15 мин 100% этанола.
  9. Переключить на 100% оксида пропилена, 2 х 15 мин.
  10. Удалить пропиленоксида и добавляют смесь 50% пропиленоксида и 50% Epon 812, инкубировать в течение ночи, вращение на колесе, при комнатной температуре.
  11. На следующее утро, удалить смесью и добавить свежие Epon 812, по крайней мере в течение 4-5 часов на колесе.
  12. Использование удвоилось конические формы, наполненныеполовину пути со свежими 100% Epon 812, добавьте выбранные образцы и поместите их к краям.
  13. Перемещение формы для инкубатор при 60 ° C, и пусть они вылечить в течение 48-72 часов.
  14. После полимеризации отправить блоков быть тонким (60-70 нм) секционного.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

ITSN-1 белка и мРНК наблюдали в нескольких временных точках после доставки миРНК ITSN методом вестерн-блоттинга и обычных и количественной ПЦР, как в 4. ITSN-1 белка и мРНК в миРНК ITSN обработанных легких мышей были приблизительно на 75% ниже со ссылкой на управление во время непрерывной нокдаун ITSN-1 в течение 21 дней. Без ITSN-1S, Динамин-2, основным взаимодействующим партнером ITSN-1 и главных действующих лиц в отряде кавеол из мембраны плазма не эффективно на работу в эндоцитотичес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Основываясь на предыдущих исследованиях, опубликованных другими 9 и 1, нам, 18 мы разработали эту методику для долгосрочного сбить из ITSN-1S в естественных условиях повторных внутривенного введения (каждые 72 ч, в течение 24 дней подряд) специфических миРНК / липосомы комплексов. Этот экспериментальный подход является эффективной, можно безопасно использовать и несколько раз, и она может быть легко расширена для изучения участия ген, кодирующий любой интерес белка в эндотелии легких и лег...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения R01HL089462 Гранты для SP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Диметилдиоктадецилбромид аммония (DOAB)Sigma-AldrichD2779
LiposoFast стабилизатор (мини-экструдер)Avestin Inc.LF-STB
Поликарбонатная мембрана, диаметр 19 мм, пора 50 нмAvestin Inc.LFM-50
ХолестеринSigma-AldrichC-8667
ХлороформMallinckrodt Chemicals4432-04
Сбалансированные соли ХэнкаSigma-AldrichH1387
Круглодонная колбаFisher ScientificFHB-275-030X
Мышиная миРНКITSN - на мишень Dharmacon/ ThermoScientificJ-046912-11
Перистальтический насосIsmatecREGLO-CDF цифровой с головкой
ВентиляторHugo Sachs ElectronikNA
BarbitalSigma-AldrichB-0500
Uranyl ацетатEM Sciences22400
Epon812EM SciencesСнят с производства производителем
Оксид пропиленаEM Sciences20400
Встраиваемые формыEM Sciences69923-05
Дубильная кислотаEM Sciences21710
8 нм индикаторПолучено в лаборатории как in16
Comments
Оснащен 2 Avestin 1 мл газонепроницаемые шприцы (кат. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Модифицированная миРНК, in vivo
Часть корпорации IDEX.
D-79232 март, Германия
Заменено на Embed812, кат. # 14120
насоса RHOO золотого альбумина

Ссылки

  1. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells. J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).
  2. Uddin, S. Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems. Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).
  3. Barenholz, Y., et al. Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes. J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).
  4. Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium. Biochem. Res. Int.. (2012), 672705(2012).
  5. Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress. BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).
  6. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. Eur. Biophys. J. , (2012).
  7. Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone. Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).
  8. Rai, K., et al. Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells. Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).
  9. McLean, J. W., et al. Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice. Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).
  10. Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. (432), 173-178 (2004).
  11. Barenholz, Y. Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil. J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).
  12. Zamboni, W. C. Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents. Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).
  13. Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice. Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).
  14. Martino, S., et al. Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells. J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260(2009).
  15. Zhang, G., et al. A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy. Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).
  16. Predescu, D., Palade, G. E. Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium. Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).
  17. Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis. Neuron. (43), 193-205 (2004).
  18. Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Intersectin 1ssiRNA

Похожие статьи