Method Article

Спецификация конечного мозга глутаматергической нейронов из стволовых клеток человека плюрипотентных

DOI:

10.3791/50321

⸱

April 14th, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, The University of Connecticut Health Center, 2Department of Genetics and Developmental Biology, The University of Connecticut Health Center, 3Stem Cell Institute, The University of Connecticut Health Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта процедура дает конечного мозга нейронов, проходя через контрольно-пропускные пункты, аналогичные тем, которые наблюдались во время развития человеческого потенциала. Ячейки могут спонтанно дифференцироваться, подвергаются воздействию факторов, которые толкают их к нейронной линии, изолированы, и высевали на покровные, чтобы обеспечить дифференциацию терминала и созревания.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь, поэтапная процедура для эффективной генерации конечного мозга глутаматергической нейронов от человека плюрипотентных стволовых клеток (ЭСК) было описано. Дифференциация процесс инициируется нарушение человеческих ЭСК в сгустки которые округлить до образуют агрегаты, когда клетки помещают в суспензию культуры. Агрегаты затем выращиваются в чЭСК среды от 1-4 дней, чтобы обеспечить спонтанной дифференцировки. За это время клетки имеют потенциал, чтобы стать любой из трех зародышевых листков. С 5-8 дней, клетки помещаются в нейронной среде индукции, чтобы подтолкнуть их в нервные линии. Около 8-й день, клетки позволили прикрепить на 6-луночные планшеты и дифференцироваться во время которого нейроэпителиальных формы клеток. Эти нейроэпителиальных клетки могут быть выделены на 17-й день. Клетки могут быть как нейросферы, пока они не будут готовы к высевали на покровные. Использование щелочной среде без caudalizing факторов, нейроэпителиальных клетки specifieD на конечного мозга предшественников, которые затем могут быть дифференцированы в дальнейшем спинного конечного мозга предшественников и глутаматергической нейронов эффективно. В целом, наша система предоставляет инструмент для создания человека глутаматергической нейронов для исследователей к изучению развития этих нейронов и болезни, которые затрагивают их интересы.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Человека плюрипотентных стволовых клеток (ЭСК), в том числе и человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), обладают способностью генерировать каждый тип клеток в организме, в том числе нейронов 1-3. Направленной дифференцировки нейронов различных подтипов из человеческих ЭСК является ключом для применения этих клеток в регенеративной медицине. Поколения функциональных нейронов подтипы в процессе развития представляет собой сложный процесс, включающий индукции нейронной линии, спецификации региональных предшественников по ростро-каудальной оси и дифференциация постмитотические типов нейронов из о....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Поколение человека агрегаты плюрипотентных стволовых Cell (D1-D4)

  1. Человека плюрипотентных стволовых клеток культивируют на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) фидеров в присутствии чЭСК среде с добавлением основного фактора роста фибробластов (шФРФ, 4 нг / мл). Через 5-7 дней в культуре, когда колонии большой, но все еще недифференцированных, они готовы к следующему шагу.
  2. Фермент решение должно быть сначала подготовлены. В 50 мл трубки, распустить диспазы (или коллагеназы) в дозе 1 мг / мл в DMEM/F12 среды. Так как эти решения смешивать лучше всего, когда нагревается, поместить в пробирку среды и фермента в 37 ° С водяной бане в течение 1....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь, протокол различать человеческие ЭСК в глутаматергической нейронов конечного мозга через несколько важных шагов: формирование агрегатов PSC, индукция нейроэпителиальных клеток, генерации конечного мозга предшественников, и терминальной дифференцировки этих предшественников нейронов в конечного мозга (рис. 1) имеет были описаны. Эта система является надежной и эффективной генерации конечного мозга предшественников и глутаматергической нейронов. В качестве примера (рис. 2), без доба.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Есть несколько важных шагов в нейронных процессов дифференциации. Важно, чтобы убедиться, что человеческие ЭСК являются плюрипотентными, потому что в противном случае клетки уже могут быть смещены в сторону становится не-нейрональных линии. Это может быть подтверждено путем окрашивания человеческих ЭСК с антителами против маркеров плюрипотентности, таких как Oct4, Sox2, Nanog, и TRA-1-60 1-3. Если человек ЭСК не придаем очень хорошо после пассажей них, ROCK ингибитора (Y27632) могут быть добавлены, чтобы помо.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Ю. Sasai за щедрое предоставление FOXG1 антител. Эта работа была поддержана Коннектикут исследований стволовых клеток грантов (08-SCB-UCHC- 022 и 11-SCB24) и спастический фонда параплегия.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Модифицированная орлиная среда Dulbecco со смесью питательных веществ F12 (DMEM/F12)Gibco11330-032
Заменитель сывороткиGibco10828-028
L-глутамин (200 мМ)Gibco25030
Заменимые аминокислотыGibco1140-050
2-Mercapt– танол (14,3 M)SigmaM-7522
Нейробазальная средаGibco21103-049
N2Gibco17502-048
B27Gibco12587-010
ГепаринSigmaH3149
Поли-L-орнитина гидробромид (полиорнитин)Sigma116K5103
Ламинин (человек)SigmaL-6274
Ламинин (мышь)Invitrogen23017-015
FBSGemini100-106
Бычий сывороточный альбумин (BSA)SigmaA-7906
DispaseGibco17105-041
КоллагеназаInvitrogen17104-019
AccutaseInnovative Cell ТехнологииAT104
ROCK ИнгибиторStemgent04-0012
SB431542Stemgent04-0010
ДорсоморфинStemgent04-0024
Фактор роста фибробластов 2 (FGF2, bFGF)Invitrogen13256-029
Ингибитор трипсинаGibco17075
0,1% желатинаАнтитело MilliporeES-006-B
Foxg1Д-р И. Сасаи
Антитело Hoxb4 (1:50)Исследования развития Гибридома БанкI12
Pax6 антитело (1:5000)Исследования развития Гибридома БанкPAX6
Nkx2.1 антитело (1:200)Антитело ChemiconMAB5460
Tbr1 (1:2000)ChemiconAB9616
антитело vGLUT1 (1:100)Синаптические системы135302
нейротрофический фактор мозга (BDNF)PrepoTech Inc.450-02
Глиальный нейротрофический фактор (GDNF)PrepoTech Inc.450-10
Инсулиновый фактор роста 1 (IGF1)PrepoTech Inc.100-11
Cyclic AMP (cAMP)SigmaD-0260
Sonic hedgehog (SHH)R& D1845-SH
50 мл тубыBecton Dickinson (BD)352098
15 мл тубыBD352097
6 луночных планшетовBD353046
24 луночных пластиныBD353047
колбы T25 (необработанные)BD353009
колбы T75 (необработанные)BD353133
Покровные стеклаChemiglass Life Sciences1760-012
6 см чашки ПетриBD353004
9'' стеклянные пипеткиFisher13-678-20D
Steriflip фильтры (0,22 μ M)Фильтры MilliporeSCGP00525
Stericup 1 000 мл (0,22 μ M)Millipore SCGPU10RE
(Observer A1)ZeissR2625
(Hera Cell 150)Колпак биобезопасности Thermo Electron Corporation
(Sterilgard III Advance)Центрифуга компании Baker
(5702 R)Eppendorf
Фазово-контрастный микроскоп Инкубатор для углекислого газа

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Telencephalic Glutamatergic NeuronsHuman Pluripotent Stem CellsNeural Induction MediumNeuroepithelial CellsNeurosphere FormationGlutamatergic Neuron DifferentiationFoxG1 ExpressionTBR1 MarkerVGLUT1 ExpressionImmunostaining Analysis

Related Articles