Интегрированный чип микрофлюидных термопластичных была разработана для использования в качестве молекулярной диагностики. Чип выполняет выделения нуклеиновых кислот, обратной транскриптазы, и ПЦР. Методы изготовления и запуска чипа описаны.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Микрофлюидных Изготовление Чип и метод для выявления гриппа
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Быстрая и эффективная диагностика играет важную роль в борьбе с инфекционными заболеваниями, позволяя пациенту эффективное управление и лечения. Здесь мы представляем интегрированное микрофлюидных термопластичных чип с возможностью усиливать вируса гриппа А в больной носоглотки (NP) тампоны и аспирации. При загрузке образца пациента, микрофлюидных устройство последовательно выполняет на кристалле лизиса клеток, РНК очистки и концентрирования шаги в твердофазной экстракции (SPE), обратной транскрипции (RT) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) в RT-PCR камер, соответственно. Конечные точки обнаружение осуществляется с помощью внешней памяти Bioanalyzer (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния). Для периферийных устройств, мы использовали один насос шприца ездить реагентов и образцов, в то время как два тонких нагреватели фильма были использованы в качестве источников тепла для РТ и ПЦР-камер. Чип предназначен для однослойных и подходит для высоких производственных пропускной способности для уменьшения fabricatiпо времени и стоимости. Микрофлюидный чип обеспечивает платформу для анализа широкого спектра вирусов и бактерий, ограничивается только изменениями в дизайне реагента, необходимого для обнаружения новых патогенов интерес.
Введение
Миллионы смертей были зарегистрированы в течение трех пандемий гриппа 20-го века 1. Кроме того, самые последние пандемии гриппа была объявлена Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) 2 в 2009 году, и по состоянию на 1 августа 2010 года, 18 449 смертей были зарегистрированы ВОЗ 3. Эта пандемия вновь продемонстрировали высокое бремя инфекционных заболеваний, а также необходимость быстрого и точного обнаружения гриппа для быстрого подтверждения заболевания, соответствующего реагирования общественного здравоохранения и эффективное лечение 4.
Есть несколько методов, широко используется для диа....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Чип изготовление 12
- Сделайте две мемориальные доски из Zeonex гранулы 690R: распространять 8-9 граммов Zeonex гранулы равномерно в центре металлической пластины, разогрейте на нагретом прессе при 198 ° C в течение 5 мин, а затем применить давление медленно до 2500 фунтов на квадратный дюйм в течение еще 5 мин. Чтобы выполнить этот шаг, мы использовали пресс Carver горячей.
- Барельеф микрофлюидных канала в мемориальная доска с эпоксидной плесени. Подробная информация о форме изготовления изложены в другом месте 12 (канал дизайна в рис. 2б): положить одну доску на эпоксидной плесени; разогрейте их на нагрето....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Типичный результат показан на рисунке 3 для гриппа инфицированных носоглотки образца стирки. В связи с различным количеством вируса гриппа в каждый образец пациента, конечная концентрация продукта ПЦР будет меняться. Хороший результат должен иметь низкий уровень шума, два пика лестницы (35 и 10380 б.п.) и один пик продукта на продукт предназначен размере (107 б.п.) для положительных образцов. В то время как продукт пик теоретически должна отсутствовать отрицательные контроли, мы сделали наблюдать .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Метод диагностики, представленные здесь продемонстрировали способность интегрированной микрофлюидных пластиковых чипов для усиления гриппа РНК из образцов пациентов с высокой специфичностью и низкий предел обнаружения 13 Мы разработали этот чип для потенциальной точкой ухода тестирования.: (А) температуры и жидкостный управления были упрощены, (б) чип является низкая стоимость и подходят для высокой пропускной способности, используя изготовления литьем под давлением, и (с) чип является одноразовым и предназна.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявили, нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано Национальным институтом здоровья (NIH), грант R01 EB008268.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название Реагенты / Материал | Компания | Номер по каталогу | |
| 1-додеканол | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | 443816-500G | |
| 2,2-диметокси-2-фенилацетофенон | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | 196118-50G | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния | G2943CA | |
| 2-пропанол | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | 19516 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | 239852-50G | |
| BSA | Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA | A7979-50ML | |
| Бутилметакрилат | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | 235865-100 мл | |
| Перевозчик РНК | Qiagen, Valencia, CA | 1017647 | |
| Циклогексанол | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | 105899-1L | |
| Этанол | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | E7023 | |
| Этилен диметакрилата | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | 335861 | |
| Диметакрилата Этиленгликоль | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | 335 681-100мл | |
| Стеклянный шприц 250 мкл | Гамильтон, Reno, NV | 81127 | |
| Гуанидин тиоцианат | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | 50981 | |
| Высокая чувствительность Kit ДНК | Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния | 5067-4626 | |
| Горячий пресс | Карвер, Wabash, IN | 4386 | |
| JB Weld Эпоксиды | МакМастер-Caр-р, Элмхерст | 7605A11 | |
| Luer-Lok шприцы | BD-медицинская, Franklin Lakes, NJ | 309628 | |
| Хлорид магния | Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA | AB-0359 | |
| Метанол | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | 494437 | |
| Метилметакрилат | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | M55909 | |
| Nanoport | Upchurch Научные | N-333-01 | |
| Место Nanoport | Upchurch Научные | F-120x | |
| Нуклеазы свободной воды | Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA | PR-P1193 | |
| OneStep RT-PCR наборы | Qiagen, Valencia, CA | 210210 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | 41009 | |
| Источник питания | VWR, Radnor, PA | 300В | |
| РНКазы в гостях | Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури | 83931-250ML | |
| RNASecure | Applied Biosystems, Foster City, CA | AM7005 | |
| Silica микросфер | Polysciences, Warrington, PA | 24324-15 | |
| Шприц насос | Harvard Apparatus, Holliston, MA | HA2000P/10 | |
| Теплопроводящие лента | McMaster-Carr, Элмхерст | 6838A11 | |
| Термопара | Omega Engineering, Stamford, CT | 5SRTC-TT-J-40-36 | |
| Тонкопленочных нагревателей | Minco, Minneapolis, MN | HK5166R529L12A | |
| Ультрафиолетовые Crosslinker | UPV, Upland, CA | CL-1000 | |
| Zeonex | Zeon Chemicals, Луисвилл, Кентукки | 690R |
Ссылки
- Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
- WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
- WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
