Формирование человеческого эпителия простаты с использованием тканевых Рекомбинация грызунов мочеполовой Мезенхима Синус и стволовых клеток человека

Краткое содержание

Разгадать ранних молекулярных механизмов, лежащих в основе рака простаты посвящения, новые и инновационные модели человеческих систем и подходов крайне необходимы. Потенциал предварительного простаты мезенхимы урогенитального синуса (UGSM), чтобы побудить население плюрипотентных стволовых клеток для формирования человеческого эпителия простаты является мощным инструментом в экспериментальном исследовании простаты.

Аннотация

Прогресс в исследовании рака простаты строго ограничена наличием человеческого происхождения и гормонов наивные модели систем, которые ограничивают нашу способность понимать генетических и молекулярных событий, лежащих в основе заболевания простаты посвящения. К разработке более эффективных систем моделью для изучения человеческих простаты канцерогенеза, мы и другие воспользовались уникальной Pro-индуктивные простаты потенциал эмбриональных грызунов стромы простаты, называемая мезенхимы урогенитального синуса (UGSM). При рекомбинации с определенными плюрипотентных клеточных популяций, таких как эмбриональные стволовые клетки, UGSM индуцирует образование нормальной человеческой предстательной железы эпителия в тестостерон-зависимым образом. Такая система человека модель может быть использован для исследования и экспериментально проверить способность кандидата гены рака простаты восприимчивость ускоренными темпами по сравнению с типичными исследования трансгенных грызуна. Поскольку человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) могут быть генетически модифицированные культуры в Усинг индуцируемой экспрессии гена или миРНК нокдауна векторов до ткани рекомбинации, такая модель облегчает тестирование функциональных последствий генов или их комбинации генов, которые, как полагают, способствуют или предотвращения канцерогенеза.

Методика выделения чистых популяций UGSM клетки, однако, является сложной задачей и зачастую требует обучения кто-то с предыдущим опытом, чтобы лично учить. Кроме того, прививка клеточных смесей под почечную капсулу с ослабленным иммунитетом хозяина может быть технически сложным. Здесь мы опишем и проиллюстрируем соответствующего уровня изоляции UGSM из эмбрионов грызунов и почечной капсулы имплантации тканей смесями, чтобы сформировать человека эпителия простаты. Такой подход, на современном этапе, в естественных условиях требуется ксенотрансплантации эмбриональных стволовых клеток; будущих приложений потенциально может включать в пробирке образование железы или использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток населения (ИПСК).

Введение

Существует огромная потребность в более человеческих систем модели рака простаты. В частности, соответствующие системы человека модели нормальным, доброкачественных простаты тканей, которые могут быть генетически манипулировать, чтобы непосредственно различить роль специфических генов в инициации рака предстательной железы, было бы невероятно информативным. Появление геномной эры выявила многочисленные гены, которые могут играть определенную роль в формировании рака. Отсутствие экспериментальных систем организма человека модели, однако, значительно ограничивает наши возможности функционального тестирования и характеризуют кандидата простаты генов предрасположенности к раку. Идеальная модель системы будет способствовать быстрому и более быстрому функциональный анализ генов предрасположенности к раку в сочетании с соответствующими трансгенной системы модели грызунов. Кроме того, такие системы человека модель позволит молекулярной характеристики сигнальных механизмов простаты канцерогенеза в направлении открытия и проверки новых методов лечения, чтобыпредотвратить рак простаты формирования.

Эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) способны образовывать ткани предстательной железы человека в качестве ксенотрансплантатов. В 2006 Taylor и соавт. Сообщили, что ЭСК могут быть вызваны, чтобы сформировать предстательной железы эпителия в естественных условиях при повторном сочетании с грызунами урогенитального синуса мезенхимы (UGSM) в течение периода времени 8-12 недель. ¹ Эти исследования были основаны на предыдущей работе Кунья лаборатории показали, что грызуны эмбриональных UGSM предстательной железы может способствовать дифференциации стволовых клеток и эмбриональных эпителиальных клеточных популяций в естественных условиях. ^2,3 простаты развивается из эмбриональных зачатков называется урогенитального синуса (ПХГ), а до 17-й день эмбрионального (мышь E17 ; E18 день у крыс) ПХГ могут быть удалены и физически разделены на эпителий (UGSE) и мезенхимы (UGSM) ⁴ Этот подход ткани рекомбинации значительно расширил наше понимание развития простаты и канцерогенеза, частности.LY фактора роста и гормональных сигнальных путей и молекулярные связи между простаты стромы и эпителия. ^5-8 Этот метод предполагает экс сочетание естественных условиях из стволовых UGSM или эпителиальные клетки из того же или различных видов и этих сотовых / рекомбинантами ткань имплантируют и выращивали и ксенотрансплантата мыши в хосте. ^4,9 После периода в естественных условиях роста, имплантат содержит простаты эпителиальных железистых структур встроенных в стромальной ткани. Далее окрашивание может быть проведена для определения того, такие структуры, которые действительно предстательной железы и человеческого происхождения. ^10,11

Протокол

Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями, содержащимися в руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья. Протокол был одобрен Чикагского университета Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC, номера протоколов 72066 и 72231). Все операции проводили под наркозом, и все усилия были предприняты для уменьшения страданий. Эмбриональных стволовых клеток человека линии WA01 (H1; NIH-регистрации # 0043) был приобретен у WiCell (Мэдисон, Висконсин) и культивируют с использованием фидер-независимое протокола с использованием средств массовой информации mTeSR1 (Stem Cell Технологии; Ванкувере, Британская Колумбия). ЭС клетки были использованы в течение десяти проходов оттаивания.

1. Выделение урогенитального синуса от мыши или крысы Эмбрионы

1. Усыпить временном беременных мышей (17,5 дня) или крысы (день 18,5) в виде ингаляций СО ₂ в течение 5 мин. Смерть подтверждено прекращение жизненно важных функций у крыс. Затем разбейте его шею гуманно. Rв эвтаназии в этой точке. Спрей 70% этанола для стерилизации кожи живота и бока. Разрежьте кожу живота и мышечные слои, а затем вырезать матку, отделить эмбрионов крыс от амниотической и перерезал пуповину. Перенесите эмбрионы в 50 мл Сокол трубки, содержащей сбалансированный солевой раствор ледяной Хэнка (HBSS) и держать на льду. Плоды подвергаются эвтаназии путем обезглавливания с хирургическими ножницами.
2. Наведите эмбриона в 100 мм чашки Петри. Пополам эмбриона с ножницами на уровне пупка (рис. 1А). Удалить желудка и тонкой кишки. Выявить яичников у женщин и яички эмбриона в мужской эмбрион (рис. 1В и 1С). (Яичники расположены в хвостовой полюсами почек. Яички находятся примерно на уровне мочевого пузыря). На данном этапе развития, UGSM изолированы от мужских и женских эмбрионов способны индуцировать предстательной железы эпителиальные линии в присутствии хозяинатестостерон. ⁴ После этой точки развития время, однако, предстательной железы начинают формироваться бутоны в UGSM и выделения чистых UGSM является весьма сложной задачей. ⁴
3. Под микроскопом рассечение, разрезать брюшную стенку в средней линии с ножницами Vannas подвергать мочевого пузыря и задней стенки брюшной полости. Бесплатный верхних половых путей от привязанностей (в мужских эмбрионов, вырезать мочеточника, вольфова проток и проток Мюллеровых, в женских эмбрионов, вырезать и мочеточника Мюллеровых канал). Освободите мочевой пузырь из пуповины. Вырезать лобковой костью и прямо отдельно от передней стенки урогенитального синуса щипцами Дюмон тонкий кончик. И, наконец, отделить заднюю стенку урогенитального синуса из прямой кишки. Cut урогенитального синуса с мочевым пузырем на нижнем конце (из мочеиспускательного канала) и хранить урогенитального синуса целиком (с мочевым пузырем) в охлажденном льдом HBSS.

2. Разделение урогенитального синуса Мезенхима

1. Удалить мочевого пузыря из урогенитального синуса под микроскопом рассечение (рис. 1D).
2. Передача урогенитального синуса, чтобы трубки сокола, содержащий 1% трипсина в Кальций (Са ^{2 +)} и магния (Mg ^{2 +)} бесплатно HBSS. Поместите пробирку в холодильнике при температуре 4 ° С в течение 75 мин.
3. Удалить трипсина и нейтрализовать трипсином с 10% фетальной сыворотки Bovin (FBS) в среде DMEM/F12.
4. Тщательно дразнить липкий мезенхимальных рукав из эпителиальных трубки с иглой или Dumont тонкий кончик пинцетом (поддержании эпителиальных трубки нетронутыми уменьшает вероятность загрязнения эпителиальные клетки мезенхимы, что может привести к грызун желез формирования вместе с стволовых клеток, полученных человека железистого эпителия) (рис. 1D). ¹²
5. Передача UGSM в новую пробирку Фалькон содержащей среде DMEM/F12 + 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина (пенициллина / стрептомицина, 0,5 мг / мл) + 1% заменимых аминокислот (NEAA) плюс 1 нМ R1881. PlAce трубки в инкубаторе при температуре 37 ° C с 5% CO ₂ в течение ночи.
6. Центрифуга ткани при 200g и отбросить супернатант. Промыть фосфатом солевой буфер (PBS) (не беспокоить ткани гранул).
7. Добавить 0,2% коллагеназы (в DMEM/F12), чтобы повторно приостанавливать ткани. Выдержите в 37 ° C с нежным качалки в течение 1 часа.
8. Энергично вихревой переваривание тканей три раза, пока она не станет однородной одноклеточные смеси и добавить среде DMEM/F12 + 10% FBS и 1% P / S + 1% NEAA + 1 нМ R1881 для нейтрализации коллагеназы.
9. Центрифуга при 200 мкг, а затем вымыть путем повторного приостановления UGSM клеток в HBSS, и повторить три раза, чтобы полностью промыть UGSM. Наконец приостановить мезенхимальных клеток в DMEM/F12 и подсчета клеток с использованием гемоцитометра или устройства подсчета клеток.
10. Диссоциируют ЭСК клетки, культивируемые использование без фидерного слоя протокол с mTeSR1 СМИ (клеточных технологий; Ванкувере, Британская Колумбия), используя Accutase пищеварения (Millipore, Billerica, MA). Вымойте ЭСК клеткиво время логарифмической фазы их роста в теплой DMEM/F12 среды, затем добавляют теплый раствор 1x Accutase, и инкубируют при 37 ° С в течение 15-20 мин, пока отдельные клетки не будут равномерно отделены от колоний. Добавить равное количество 1x определены ингибитор трипсина (Invitrogen; Grand Island, NY), чтобы нейтрализовать Accutase и осторожно пипетку вверх и вниз, чтобы смешивать и разбить скопления клеток. Пипетка клеток в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 3 минут при 200g и повторно приостанавливать осадок клеток в DMEM/F12 информации. Центрифуга трубки в течение 3 мин при 200g снова и удаления супернатанта, а затем повторно суспендировать в холодной HBSS или DMEM/F12 на желаемом объеме.
11. Добавить ЭС клеток с соотношением 1:2,5 ВВ / мезенхимальных клеток. ³ Это будет клеточного состава 1E ⁵ UGSM клеток с 4E ⁴ ЭСК на 10 мл инъекций (одна крыса UGS обычно дает около 2E ⁶ мезенхимальных клеток). Центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин и затем отбросить супернатант. Повторное приостановить с 75% Матригель (BD Biosciences,Сан - Хосе, Калифорния, смешивают с 25%-ным холодным HBSS простота обращения) и поместите трубку на льду к югу от почечной капсулы инъекции.

3. Трансплантация тканей рекомбинантной Под капсулу почки

1. Подготовить стерильный хирургический участок.
2. Обезболить мужчины бестимусной голых мышей с кетамином / ксилазина IP, использование свежей смесью содержащей 1:01:08 соотношение кетамина: ксилазина: физиологический раствор. Дозирование будет 100 мг / кг кетамина и 2,5 мг / кг Ксилазин. Животные реагируют на ноги щепотку должны быть полностью под в течение 20-30 мин.
3. Хирургической подготовки мыши после бритья место операции (если не использованием голых мышей), очищающие с тремя переменного салфетки 70% спирта с последующим бетадин раствора и применение хирургической простыни.
4. Положить глаз влагу мазью (Altalube глазная мазь) в глаза мыши, чтобы предотвратить высыхание во время анестезии.
5. Во время операции частоты дыхания и температуры тела у мышей контролируется. Интенсивность дыхания шоULD быть устойчивой и поддерживается в пределах 40-90 вдохов / мин. Температура тела контролируется с соблюдением цвет слизистых оболочек и розовый ступнях.
6. Сделайте 1,0 см длиной продольный разрез кожи на спине. Продолжают сокращать брюшную стенку в 0,5 см продольный разрез.
7. Осторожно сожмите почки из брюшной полости и держать влажную поверхность с помощью почек капель стерильного физиологического раствора.
8. Аккуратно проколите капсулу почки, используя пустой 27 размера иглы шприца. Очень мелкий прокол достаточно. Это будет то, где вы вставляете вашу тупую иглу для введения сотовой смеси.
9. Заполнить 28 калибра тупой иглой шприца с 10 мкл вашего мобильного смеси. Аккуратно вставьте месте прокола и проникают паренхимы почки, чтобы достичь области под капсулу почки. Введите 10 мкл клеточной смеси с образованием болюса на почки под почечную капсулу. Снятие иглы.
10. Вернуться почки к Абдоминала полости. Закрепите мышечного слоя брюшины с 4-0 швами нейлоном.
11. Закройте кожи либо шва или скобы.
12. Очистка крови из кожи с использованием стерильного физиологического раствора.

4. Послеоперационный обезболивания и мониторинга

1. Введите животных с бупренорфин (0,1 мг / кг каждые 12 ч) или кетопрофен (3-5 мг / кг в физиологическом растворе каждые 12 ч), чтобы управлять послеоперационной боли, и 1 мл 37 ° С в солевом ф держать животное теплой и предотвратить обезвоживание.
2. Поместите животное в чистую клетку и поместить его на мягкий грелку.
3. Отправить обратно в животных вивария, как только они в сознание и движутся в пределах клетки.
4. Соблюдайте животных ежедневно в течение неожиданных признаков болезни и инфекции для следующих трех дней. Мышей контролируется с наблюдении за деятельностью в клетках включая доступ к пище и воде 1 день после операции. Если мыши обладают меньшим деятельности, кетопрофен внутрибрюшинно объявлениеслужил снова раз в день.
5. Снимите кожу скобы или швы через 2 недели после операции.
6. Ксенотрансплантата ткани могут быть собраны в начале 8 недель после операции. Ксенотрансплантаты могут быть отображены в естественных условиях использования малых животных ультразвука (рис. 2А), и фиксированные ткани могут быть срезы и окрашивали для различных белков с использованием иммуногистохимии (рис. 3).

Результаты

Основываясь на отчете захватывающих Тейлор и др.., Наша лаборатория разработала прививку протокол, используя широко используется H1 (NIH назначенных WA01, генетически мужчины) человека линию эмбриональных стволовых клеток. ¹ по этой статье были тщательно протестированы для контроля качества и является нормальной кариотипически ¹³ При культивировании надлежащим образом, ЭСК клетки могут быть сохранены, расширены и замораживали в недифференцированных плюрипотентных состоянии и использовании ...

Обсуждение

Ткань рекомбинации с использованием UGSM является чрезвычайно полезным методом исследовать развитие предстательной железы и молекулярных событий, ведущих к инициированию рака предстательной железы. Индуктивный потенциал UGSM была использована для многочисленных приложений в простате исследований, к ним относятся повышение опухоли предстательной железы принимают клеточных линиях и опухолях, изучая эпителиальные-стромальных взаимодействий и формирования межвидовых рекомбинантами простаты ^7,17-20 надлежащей подг...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Хэнк s Сбалансированный солевой раствор (HBSS)	GIBCO	14170
DMEM/F12	GIBCO	11330
R1881	Sigma	965-93-5	Смешать до 1 мкг/мл в этаноле (1,000x стоковый)
NEAA	GIBCO	11140
Pen-Strepping Solution	GIBCO	15070	100x стоковый
Matrigel	BD Biosciences	354230
КЕТАЗЕТ (кетамина гидрохлорид)	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	100 мг/мл; развести 1:10 в стерильном физиологическом растворе
AnaSed (ксилазин)	VET-A-MIX, Inc.	NADA 139-236	20 мг/мл; развести 1:10 в стерильном физиологическом растворе
Trypsin	BD Biosciences	215240
Collagenase	Sigma	C2014
Ketoprofen	Fort Dodge	NDC 0856-4396-01	100 мг/мл; развести 1:1000 в стерильном физиологическом растворе
Altalube глазная мазь	Altaire Pharmaceuticals, Inc.	NLC 56641-19850
Leica MZ16 F Стереомикроскоп	Leica		Можно использовать любой хороший препарирующий эндоскоп.
Весенние ножницы Vannas	Fine Science Tools	15001-08
Шприц	Hamilton	84855
Игла Hamilton, маленькая RN, 28 калибр, 0,5 дюйма, тип точки # 3 (тупой)	Hamilton	7803-02	Индивидуальная игла
для подготовки этанола	Fisher Scientific	06-669-62
Стерильные марлевые салфетки	Fisher Scientific	22-415-469
Ethicon Vicryl Suture (4-0 FS-2)	MedVet International	J392H	Игольчатый, растворимый шовный материал
Autoclip 9 мм Зажимы для ран	Becton Dickenson	427631
PVP Iodine Prep Pads	Fisher Scientific	06-669-98
Диссекторальные ножницы с тупым концом	Fine Science Tools	14072-10
Dumont щипцы с тонким наконечником Fine Tip	Fine Science Tools	11252-50
Иглодержатель с ножницами	Fine Science Tools	12002-14