С целью изучения изменений ноцицептивных внутриэпидермальных нервные волокна (IENFs) в болезненных невропатии (PN), мы разработали протоколы, которые могут непосредственно исследовать трехмерный морфологических изменений, наблюдаемых в ноцицептивных IENFs. Трехмерный анализ IENFs имеет потенциал, чтобы оценить морфологические изменения в IENF PN.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Трехмерных изображений внутриэпидермальных ноцицептивных нервных волокон в человека биопсию кожи
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Биопсии кожи обычно используется для количественной внутриэпидермальных нервных волокон плотностью (IENFD) для диагностики периферической 1,2 полинейропатии. В настоящее время это обычная практика, чтобы собрать 3 мм биопсии кожи от дистального ногу (DL) и проксимального бедра (PT) для оценки длины зависит полинейропатии 3. Однако из-за разнонаправленного характера IENFs, это сложно рассматривать перекрытие нервных структур путем анализа двумерного (2D) изображения. Кроме того, трехмерные (3D) изображения может обеспечить лучшее решение этой дилеммы.
В настоящем докладе мы представляем методы применения 3D визуализации для изучения болезненной нейропатии (PN). Для того чтобы определить IENFs, образцы кожи обрабатываются для иммунофлуоресцентного анализа белковых генного продукта 9,5 (PGP), поддон нейронального маркера. В настоящее время она является стандартной практикой для диагностики небольших невропатии волокна с использованием IENFD сдерживанияляется PGP иммуногистохимию использованием светлого микроскопии 4. В данном исследовании мы применяли двойного иммунофлуоресцентного анализа для определения общего IENFD, используя PGP и ноцицептивной IENF, с помощью антител, которые распознают тропомиозином-рецептор-киназы (TRK), высокое сродство к рецептору фактора роста нервов 5. Преимущества совместного окрашивания IENF с PGP и ТРК антител приносит пользу изучения PN, четко окрашивания PGP-позитивные, ноцицептивных волокон. Эти флуоресцентные сигналы могут быть количественно определить ноцицептивных IENFD и морфологические изменения, связанные с IENF PN. Флуоресцентные изображения приобретаются с помощью конфокальной микроскопии и обрабатывается для анализа 3D. 3D-визуализация обеспечивает крутящий способностей для дальнейшего анализа морфологических изменений, связанных с PN. Взятые вместе, флуоресцентные совместным окрашиванием, конфокальной микроскопии и 3D анализ ясно пользу изучения PN.
Введение
В настоящее время это обычная практика для врачей количественно внутриэпидермальных нервного волокна плотностью (IENFD) из кожи биопсии удар, который может быть использован для диагностики небольших невропатии волокна 3, 6-8. Биопсии взяты из дистальной ножки (DL), 10 см над наружной лодыжки, и проксимальный бедра (РТ), 20 см ниже передней подвздошной ости 9. Все IENF помечены использованием белкового продукта гена 9,5 (PGP), пан нейронный маркер 10-12. В настоящее время она является стандартной практикой для диагностики небольших невропатии волокна с использованием IENFD определяется PGP окрашивания светлого микроскопии 6.....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Часть А: Иммуногистохимия
Приготовление 96-луночный планшет и профилактики фоновое окрашивание биопсии кожи Удар собирают из человеческих субъектов и инкубировали в течение 12-24 ч в фиксирующий раствор (2% параформальдегида с 0,75 М L-лизин раствор (рН 7,4) и 0,05 мМ периодата натрия) при 4 ° С, как описано выше 8. Затем образцы криопротекции в фосфатном буферном растворе (PBS) с 20% глицерина при 4 ° С в течение 1 недели, встроенные в монтажной среды оптимальной температуры резки (OCT), а затем разрезали на 50 мкм разделы криостата. Протокол, описанный ниже предназначена для 8 секций кожу, максимальное количество разделов кожи м....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы применили текущий протокол для изучения морфологии IENF в СТ и биопсии кожи DL от пациентов с PN. Кожа, из трех предметов, была собрана в университете штата Юта, чтобы продемонстрировать патоморфологию связанные с PN. Предметы включают: Случай 1: 51-летний мужчина с историей PN сахарного диабета 2 типа (Продолжительность: 14 месяцев; боли оценка: 51); Случай 2: 56-летний мужчина с историей PN сахарного диабета 2 типа (продолжительность: 108 месяцев; боли оценка: 47) и Вариант 3: 66-летний мужчина с историей PN сахарн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Измерение IENFD широко используется для определения степени периферические невропатии 13,14. В настоящее время наиболее часто используемый протокол только измеряет плотность нервных волокон, которые проникают через базальную мембрану эпидермиса, она не учитывает аксональное ветвления и / или морфологическими изменениями нервов. Кроме того, текущие IENFD анализ не коррелируют IENFD с наличием болей в PN 15.
Ранее мы сообщали, что увеличение количества ноцицептивных IENFD.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов не объявить.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Национального института здравоохранения Гранты K08 NS061039-01A2, Программа исследований неврологии и Discovery, и Альфред Таубман А. Института медицинских исследований в Университете Мичигана. Наша работа Морфология и анализ изображений Основные научно-исследовательского Мичиган Диабет и учебный центр, финансируемый Национальным институтом здоровья Грант 5P90 DK-20572 от Национального института диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний. Авторы хотели бы поблагодарить Робинсон Синглтон и Гордон Смит (Университет штата Юта) за их щедрое пожертвование образцы кожи человека для поддержки первоначального развития ноцицептивной техн....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | Для составления 1X PBS |
| Image-IT FX Signal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (поликлональный кролик) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| тропомиозин-родственная киназа А (поликлональная коза) | R& D Systems | AF1056 | Trk A Alexa |
| Fluor 488 осел α-кролик | Invitrogen | A21206 | AF488 осел α- |
| коза Alexa Fluor 647 осел α-коза | Invitrogen | A21447 | AF647 осел α-коз |
| Albumin, из бычьей сыворотки | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | ТХ-100 |
| Некалиброванная петля | LeLoop | MP 199025 | инокуляционная петля |
| 96-луночная пробирная пластина | Corning Incorporated | 3603 | луночная пластина |
| Prolong Gold антифадерный реагент с DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| микроскоп Покровное стекло 22x22 мм | Fisher Scientific | 12-541-B | Покровные стекла |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Научный | 12-550-15 | Предметные стекла микроскопа |
| Olympus Fluoview Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп | Olympus | FV500 | Конфокальный микроскоп |
| Оптимальная температура резки | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
Ссылки
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
