В данной работе мы представляем метод для анализа опухолевых микрососудов в естественных условиях с использованием динамического контрастным усилением флуоресценции видеомикроскопии. Были приобретены два количественные параметры: функциональный плотности капилляров, отражающий кровоснабжение опухоли, и утечки индекс, отражающий неплотности из эндотелиальных стенках.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В естественных изображений опухолевого ангиогенеза с помощью флуоресцентной конфокальной видеомикроскопии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Волокнистые конфокальной флуоресцентной в естественных изображений с светового пучка использует тот же принцип, как флуоресцентной конфокальной микроскопии. Это может возбудить флуоресцентные в элементах на места через оптические волокна, а затем записать некоторые из излучаемых фотонов, с помощью тех же оптических волокон. Источником света является лазер, который посылает возбуждающего света через элемент в расслоения и, как он сканирует по образцу, воссоздает изображения пиксель за пикселем. Как это сканирование происходит очень быстро, путем объединения его с выделенным программным обеспечением для обработки изображений, изображения в режиме реального времени с частотой 12 кадров / сек можно получить.
Мы разработали методику для количественного характеризуют капилляров морфологию и функцию, с помощью конфокальной флуоресцентной видеомикроскопии устройство. Первый шаг в нашем эксперименте было записывать 5 секунд фильмов в четырех квадрантов опухоли визуализировать капиллярную сеть. Все фильмы были обработаны с помощью программного обеспечения (яmageCell, Мауна-Кеа Технологии, Париж Франция), который выполняет автоматизированную сегментацию сосудов вокруг выбранного диаметра (10 мкм в нашем случае). Таким образом, можно количественно оценить "функциональной плотности капилляров ', который является соотношение между общей площадью сосуда и общей площади изображения. Этот параметр был суррогатным маркером плотности микрососудов, как правило, измеряется с помощью патологии инструменты.
Вторым шагом было записывать фильмы опухоли в течение 20 мин для количественного утечку макромолекулярном контрастного вещества через стенки капилляров в интерстиций. Измеряя соотношение интенсивности сигнала в интерстиции над, что в сосудах, был получен "индекс утечки", действуя в качестве суррогатного маркера проницаемости капилляров.
Введение
Ангиогенез является сложным процессом, 1, что предполагает формирование новых кровеносных сосудов из уже существующих судов. Патологические изменения в ткани микроциркуляции, состоящие из артериол, капилляров и венул, вовлечены в большом спектре заболеваний, таких как рак, воспаление, или диабет. Поэтому очень важно в разработке методов количественной оценки структуры микрососудов и функции. Изображений позволяет изучать микрососудов в не-или микро-инвазивная образом, в режиме реального времени и в естественных условиях, и повторные измерения с течением времени в той же животного 2.
В настоящее время динамического контрастным усилением (DCE) визуализации 3 обычно используется для оценки тканевой микроциркуляции. Динамическая визуализация с контрастным усилением является методом, который следует в течение долгого времени биораспределение трассера введен внутривенно. С этим приобретением, количественные параметры могут быть извлечены отражающие ткани васкуляризации. Томография DCEбыл наиболее часто используется с КТ, МРТ или УЗИ. Однако эти методы визуализации не позволяют непосредственное наблюдение микрососудов, так как их разрешение, кроме с использованием конкретных экспериментальных устройств, наиболее часто остается макроскопическим.
В этой статье мы предлагаем изучить сосудистую сеть опухоли в микроскопическом масштабе и в естественных условиях с использованием динамического оптических изображений контрастным усилением, с расслаивается конфокальной видеомикроскопии. Мы использовали макромолекулярную контрастное вещество (FITC-декстран), который остается исключительно в судах или утечек через эндотелия барьер в интерстиции, в соответствии с его молекулярной массы и характеристики эндотелия ткани изучены 4. Это позволило изучение как структуры микрососудов, по правильно разграничения сосуды и проницаемость капилляров, по протекал, и накапливается в интерстиции.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка Агента Contrast
- Для FITC-декстрана 70 кДа, доза вводится 500 мг / кг (10 мг FITC-декстран разводили в 0,1 мл физиологического раствора на мышь весом 20 г).
- Агент не должен подвергаться воздействию слишком долго, чтобы света. Чтобы избежать отбеливания, рекомендуется, чтобы покрыть трубу с алюминиевой фольгой.
2. Анестезия
- Мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией смеси 1:04 ксилазина (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, Франция) и кетамин (кетамин 500, Virbac, Каррос, Франция), соответственно 66 мг / кг и 264 мг / кг для 20 г мыши.
3. Подготовка органа интересов
- Мы побрился мышей по месту нахождения интерес (например, над подкожной опухоли). Волос животных часто самофлюоресцирующими когда белый. Когда черный, он поглощает свет.
- Кожа перед орган для включения в образ рассекали. Важно не ждать до кровотеченияхг остановилось перед инъекцией контрастного вещества, в противном случае он будет течь в крови и загрязнять изображение.
4. Приобретение
- Контрастное вещество вводили либо через яремную вену или хвостовую вену. Существует нет или мало фоновый сигнал в органе, наблюдаемой в отсутствие флуоресцентного контрастного вещества.
- Зонд был помещен в передней части органа для включения в образ. В нашем исследовании, это было опухоль.
- Лазер был включен, чтобы осветить опухоль и увидеть флуоресценцию в капиллярах.
- Опухоль была исследована вручную путем перемещения зонда в очень медленном движении во время записи для визуализации капиллярную сеть. Важно поддерживать устойчивый руку, и этот метод требует немного опыта. В нашем исследовании, этот первый шаг позволил количественную оценку функционального плотности капилляров.
- Вторым шагом было динамичным приобретение с течением времени. Для этого исследования мы использовали 70 кДа FITC-декстран. Там нет интерстициальный утечки в большинстве нормальных органов, но есть в опухоли. Чтобы получить изображения том же месте в течение долгого времени (как в нашем случае), важно создать систему для поддержания зонд на интересующей области. Это было сделано с помощью ручной поддержки, чтобы держать зонд, и путем размещения немного ультразвукового геля на кончике зонда. Перед записью времени было проведено, чтобы стабилизировать зонда в контакт с опухолью. После того, как позиция была обеспечена, был только минимальный движение из-за дыхания мыши. Лазер был включен в записи 3 изображений каждые 30 сек в течение 20 мин, чтобы обнаружить присутствие капиллярной утечки. Это был выключен между каждой съемкой для снижения контрастного вещества отбеливание.
- В нашем эксперименте мышей умерщвляли в конце процедуры для гистологического анализа опухолей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Используя данные, собранные, мы могли количественно анализировать различные параметры, отражающие микроциркуляцию.
Мы учились в естественных условиях периферических сосудов сеть опухоли толстой кишки, имплантированного в BALB-C-мышей с использованием расслаивается конфокальной флуоресцентной системы видеомикроскопии (Cellvizio, Maunakea Технологии, Париж, Франция 2), после инъекции макромолекулярным флуоресцентного контрастного вещества флуоресцеинизотиоцианатом-декстрана...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Изучение опухоли микроциркуляции стало необходимым в понимании патофизиологии роста опухоли, распространения и реакции на лечение 1. Оптический изображений является одним из методов, которые могут быть использованы для наблюдения капилляры использованием флуоресцентного контрастное вещество и количественно морфологический (Functional капиллярной плотности) и функциональные (утечка индекс) параметры.
Флуоресцентной микроскопии изображений мы использовали в этом исследовании имеет с...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нам нечего раскрывать.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Инсулин серинг<бр/> Myjector 1мл<бр/> 29Г | Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Флуоресцеин изотиоцианат-декстран 70 кДа | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 мг/мл <бр/> разведенный в физрастворе |
| Фиброволоконная конфокальная видеомикроскопия | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Набор для калибровки и очистки для LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Магазин в 4 ° C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Программное обеспечение для мозаики | MaunaKea Technologies | ||
| Программное обеспечение для обнаружения судов | MaunaKea Technologies |
Ссылки
- Folkman, J. Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P. Imaging angiogenesis. Methods Mol Biol. 467, 25-51 (2009).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C. Disrupting tumour blood vessels. Nat Rev Cancer. 5 (6), 423-435 (2005).
- Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
