Методическая статья

Изоляция, обработки и анализа мышиного десен Клетки

19.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50388

⸱

2 июля 2013 г.

 ,  ,  , 
1Institute of Dental Sciences, Hebrew University - Hadassah Medical Center, 2Department of Periodontology, Hebrew University - Hadassah Medical Center

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Это исследование описывает эффективный способ изолировать и обработки тканей десны от мыши полости рта с целью получения одной клеточной культуры. Полученные клетки могут быть использованы для дальнейшего анализа потока цитометрии и молекулярных исследований.

Аннотация

Мы разработали методику точно изолировать и обрабатывать мышиные десневой ткани для проточной цитометрии и молекулярных исследований. Десны является уникальным и важным ткани для изучения иммунных механизмов, поскольку он участвует в иммунный ответ против оральный биопленки, которые могут вызывать заболевания периодонта. Кроме того, в непосредственной близости от десны к альвеолярной костной ткани позволяет также изучение костного ремоделирования при воспалительных процессах. Наш метод дает большое количество иммунных клеток, что позволяет анализировать даже редкие популяции клеток, таких как клетки Лангерганса и Т-регуляторные клетки как мы показали ранее 1. Используя мышей для изучения местных иммунных реакций, участвующих в потеря альвеолярной кости при заболеваниях пародонта является выгодной из-за наличия различных иммунологических и экспериментальных средств. Тем не менее, из-за их малого размера и сравнительно неудобным доступ к мышиным десны, многие исследования избежать рассмотрение эту темус критической ткани. Метод, описанный в этой работе могли бы способствовать анализу десен, которые, будем надеяться увеличить наши занижение на устном иммунной системы и ее роль во время заболевания пародонта.

Введение

Десны мягких тканей, окружающих шейном отделе зубы и покрывает альвеолярного отростка (рис. 1). Десны является одним из видов жевательной слизистой, которые могут быть далее разделены на эпителий слизистой оболочки и соединительной ткани (также известный как подслизистой или собственной пластинке слизистой оболочки). Анатомическое строение десны и соседних зубов позволяет бактериям жить и развиваться налета (биопленки), которые постоянно бросает вызов местной иммунной системы. В результате воспалительной реакции развивается в десне, которая в некоторых случаях становится разрушительной - состояние называется заболеваний пародонта 2. В основном, бляшка индуцированного периодонтальной патологии можно разделить на гингивит и периодонтит. Гингивит представляет собой обратимое состояние местной воспалительной реакции, которая приурочена к десне. Периодонтит, с другой стороны, является необратимым деструктивный процесс, в котором крепление аппарат (альвеолярной кости, периодонтальноесвязки, цемента и десной) разрушается 3.

Десны было предложено служить как эффекторные и индуктивных сайтов во время заболевания пародонта 4. Человека исследования показали, что в ответ на зубной налет, иммунные эффекторные клетки и молекулы динамически проникли или отправления десны 5-7. Данное мероприятие было показано, играют важную роль в разрушении пародонта 8,9. Принимая во внимание данные, полученные в этих исследованиях содержится ценная информация относительно этого патологического процесса, работа с тканями человека обладают основных этических, технических и экспериментальных ограничений. Развитие экспериментальной модели позволило причинно-следственных экспериментов с помощью использованием трансгенных мышей и в естественных вмешательства 10. В результате, наши знания о механизмах, участвующих в пародонтозом значительно увеличилось в течение последних двух десятилетий. Тем не менее, из-за сложности заболеваний пародонта, существуетПродолжается дискуссия о природе местного иммунного ответа содействие разрушению ткани. Существует также отсутствие в нашем понимании на функции центральных иммунных клеток в десны при заболеваниях пародонта. Таким образом, важно, чтобы изучить патологических воспалительных реакций, происходящих в ткани-мишени заболевания, десны.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Подготовьте заранее:

  • PBS + 2% FCS
  • PBS + 2% FCS с 2 мг / мл коллагеназы типа II и 1 мг / мл ДНКазы I типа (1 мл на образец)
  • Стерилизованные хирургические инструменты
  • 0,5 М раствора ЭДТА

1. Верхние десны Техника иссечение

  1. Усыпить мышей с использованием утвержденных IACUC руководства.
  2. Вырежьте обе стороны полости рта включая щеки и нижней челюсти ветви с острым / тупым прямыми ножницами.
  3. Опустите нижнюю челюсть.
  4. Разрежьте мягких и твердых тканей в воображаемой линии 1 мм за третий моляры со стандартными ножницами. Направляйте ножницы перпендикулярно плоскости небной кости (рис. 2А, синие линии).
  5. Надрезать мягких и твердых тканей 2 мм за резцами (рис. 2А, синие линии).
  6. Потяните вниз передней части рта. Носовая полость наблюдается после этого шага.
  7. Поместите ножницыпараллельно небу, положить одним лезвием в полость носа, другой лезвие должно надрезать в вестибюль. Вырезать не до заднего разреза (рис. 2А, зеленые линии). Повторите этот шаг, на обеих сторонах верхней челюсти. В конце верхней челюсти отделяется от остальной части черепа (фиг. 2В).
  8. Снимите верхнюю челюсть, вырезать его в середину шва (рис. 2, черная пунктирная линия) и обрезки ткани небных каждого Hemi-верхней челюсти, пока не достигая альвеолярной кости.
  9. Пил тканях десны (как Hemi-челюстных костей) с их передней границе с Адсона щипцов (без зубов).
  10. Поместите вырезали десну в тарелку с PBS + 2% FCS.

2. Обработка десен

  1. Поместите вырезали десны в чашке для культуры ткани (35 х 10 мм) с 1 мл PBS + 2% FCS, 2 мг / мл коллагеназы типа II и 1 мг / мл ДНКазы типа I.
  2. Фарш хорошо тканей с N ° 15 стерильные хирургические лезвия.
  3. Трansfer ткани от пластины до 15 мл коническую пробирку.
  4. Промыть ткань / клетки, оставшиеся на пластине с 1 мл PBS + 2% FCS и передачи в той же пробирке.
  5. Выдержите в шейкере инкубаторе в течение 20 мин при 37 ° C, 200 оборотов в минуту (рекомендация: Разогреть инкубатор).
  6. Добавить 20 мкл 0,5 М ЭДТА и инкубировали в течение еще 10 мин при 37 ° С, 200 об.
  7. Заполните пробирку до 12 мл PBS + 2% FCS и центрифугируют при 4 ° С, 400 мкг в течение 8 мин (рекомендуется предварительно холод центрифуги).
  8. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток с 2 мл PBS + 2% FCS.
  9. Фильтр образца с 70 мкм клетки-фильтр и сохранить поток через.
  10. Центрифуга при 4 ° С, 320 х г в течение 5 мин.
  11. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в 300 мкл PBS + 2% FCS.
  12. Граф клеток (примерно 5-10 х 10 5 клеток, как ожидается, с одной челюсти).

3. Внеклеточного и внутриклеточного антителаОкрашивание на цитометрическим анализом

Рекомендуется для работы внутри капюшоном, с выключенным светом. Очень важно, чтобы сохранить клетки в постоянном холодной окружающей среде, а также все необходимые материалы.

  1. Пятно клетки от внеклеточных молекул добавлением 0,2-0,5 мкг каждого выбранного антитела на 1 × 10 6 клеток в общем объеме 100 мкл.
  2. Vortex кратко.
  3. Инкубировать пробирки в течение 15 мин в темноте при 4 ° С.
  4. Мытье клеток с 2 мл PBS + 2% FCS.
  5. Центрифуга при 4 ° С, 320 х г в течение 5 мин.
  6. Супернатант и ресуспендирования клеток путем добавления, по каплям 500 мкл холодного Cytoperm BD / Cytofix при встряхивании.
  7. Инкубировать пробирки в течение 40 мин при 4 ° С в темноте.
  8. Vortex кратко.
  9. Вымойте клетки дважды 1 мл холодной BD Пермь / промывочного буфера и спина при 800 мкг в течение 7 мин при 4 ° C.
  10. Супернатант за исключением 300 мкл.
  11. Пятно клетки внутриклеточнодобавлением 1 мкг каждого выбранного антитела на 1 × 10 6 клеток в общем объеме 100 мкл.
  12. Vortex кратко.
  13. Выдержите в течение 30 минут в темноте при 4 ° C.
  14. Вымойте клетки дважды 1 мл холодной BD Пермь / промывочного буфера и спина при 800 мкг в течение 7 мин при 4 ° C.
  15. Супернатант и ресуспендирования клеток путем добавления 300 мкл холодного BD Пермь / промывочного буфера.
  16. Vortex кратко.
  17. Передача подвески, что фильтрация FACS труб.
  18. Держите труб в темном и холодном месте, пока анализ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Примеры проточной цитометрии анализа на десневой клетки представлены. Десен клетки, собранные от 2 мышей проводили в проточной цитометрии LSR II и проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo. 3А продемонстрировано распределение десны клетки от наивных мышей в сторону рассеяния (SSC) против прямого рассеяния (FSC) сюжет. Память стратегию для выявления (I), лимфоциты (II), моноциты / дендритных клеток и (III), гранулоциты указано. Для сравнения цели, мы также представляем FACS график, иллюс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Maxilla тканей десны, полученные из одной мыши достаточны для анализа субпопуляции Т-и В-лимфоцитов, а также их способность выразить внеклеточных и внутриклеточных молекул, как мы ранее описанных 1. Тем не менее, если редких клеточных популяций представляют интерес (например, ДК), рекомендуется объединить ткани от 2-3 мышей. Следует отметить, что если предпочтительнее, можно очистить и небной и тканей десны, а затем вырезать десны (модификация шагом 1,8-1,9). Следует также отметить, что десны нижней челюсти м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами от Израиля научного фонда (№ 1418/11) и в АНН (№ 1933/12), чтобы AW, немецкий Израильского фонда для молодых исследователей (GIF младших) Ах, и д-р я . Cabakoff благотворительный фонд исследований в Еврейском университете Хадасса школы зубоврачебной медицины в АНН и AW.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Коллагеназа типа IIWorthington Biochemical Corp.CLS-2
DNAse ISIGMADN25-1G
EDTASIGMA E6758-100G
Dulbecco's PBSSIGMAD8537
Фетальная бычья сыворотка Biological Industries04-121-1Термоинактивированный
вакуумный фильтрJet BiofilFPE-204-500
5 мл Полистирол с круглым дном ПробиркаBD Falcon352052
Клеточное ситечко 70 μ mSPL Lifesciences93070
Чашка для культуры тканей 35× 10 ммNUNC153066
BD Cytofix/CytopermBD554714
Антитело против мыши CD11cBiolegend117305Клон N418
Антитело против мыши CD45.2Biolegend109819Клон 104
Антитело против мыши CD4Biolegend100413Клон GK1.5
Антитело против мыши CD8aBiolegend100733Клон 53-6.7
Антитело против мыши CD3Biolegend100214Клон 17A2
Антитело против мыши CD326 (Ep-CAM)Biolegend118219Клон G8.8
Антитело против мыши CD207 (Langerin)ImgenexDDX0362DКлон 929F3.01
Антитело против мыши I-Ad (MHC-II) antobodyBiolegend115010Клон 39-10-8
Проточный цитометр LSR IIBD Biosciences
FlowJo Software v 7.6.5Tree Star

Ссылки

  1. Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
  2. Listgarten, M. A. Pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).
  3. Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
  4. Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
  5. Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
  6. Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
  7. Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
  8. Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
  9. Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
  10. Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи