Методическая статья

Ускоренное диабета 1 типа у мышей Индукционная приемными Передача диабетогенные CD4 + Т-клеток

DOI:

10.3791/50389

⸱

6 мая 2013 г.

 , 
1Department of Microbiology & Immunology, Pennsylvania State University College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы предоставляем воспроизводимый метод, чтобы вызвать сахарный диабет 1 типа (СД-1) у мышей в течение двух недель от приемных передачи островок антиген-специфические, первичные CD4 + Т-клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Без ожирения диабетические (NOD) мышей спонтанно развивается аутоиммунный диабет после 12-недельного возраста и является наиболее широко изучены животную модель человеческого диабета 1 типа (СД-1). Сотовые передачи исследований в облученных мышей получатель будет установлено, что Т-клетки играют ключевую роль в патогенезе СД-1 в этой модели. Мы описываем здесь простой способ быстро индуцируют T1D приемными передача очищенной, первичные CD4 + Т-клеток из предварительно диабетической NOD трансгенных мышей для островка-специфических Т-клеточный рецептор (TCR) BDC2.5 в NOD.SCID мышей получателя. Основные преимущества этого метода в том, что изоляция и приемных передачи диабетогенные Т-клеток может быть завершена в течение одного дня, облучение получателей не требуется, и высокая частота T1D поведения возникает в течение 2 недель после переноса Т-клеток. Таким образом, исследования патогенеза и терапевтических вмешательств при СД1 может протекать с большей скоростью, чем с методами, которые полагаются на гетерогенные популяции Т-клеток или клоны, полученных из диабетических мышей NOD.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOD мышей развивается аутоиммунный диабет спонтанно и широко используется в качестве животной модели для человеческого СД-1 1,2. Патогенез СД-1 в NOD мышей характеризуется инфильтрацией, начиная с 3-4 недель, в панкреатических островках Лангерганса дендритными клетками и макрофагами, после чего Т-и В-клеток. Эта фаза неразрушающего пригородных инсулитом приводит к медленному, прогрессирующим разрушением инсулин-продуцирующие клетки поджелудочной железы β, в результате чего явным диабетом в 4-6 месячном возрасте 3. Передача спленоцитов 4,5, 6,7 CD4 + или CD8 + 8,9 Т-клеток от диабетических мышей NOD было показано, что промежуточный диабета у мышей NOD с ослабленным иммунитетом, указывая, что островок-реактивные Т-клетки играют центральную роль в патогенезе СД-1. В зависимости от условий эксперимента, диабет разработаны в мышей-реципиентов медленно, в течение нескольких недель в этих исследованиях. Кроме того, различные клоны Т-клеток, полученных трудоемким и дорогостоящимкультивирование диабетогенные Т-клеток, как сообщается, посредником диабета через несколько недель после перевода на мышей-реципиентов 7,10. При наличии трансгенных мышей, экспрессирующих TCR, полученных из CD4-CD8 или ограничением диабетогенные клонов Т-клеток, несколько лабораторий впоследствии показали, что Т-клетки селезенки от таких мышей были в состоянии передавать диабетом получателям 11-13. В частности, BDC2.5 мышей NOD являются трансгенными для BDC2.5 TCR, которая является специфической для хромогранином, белка в бета-клетки поджелудочной железы 14-16. Передача в пробирке активированный или ООН-активированной полностью или фракционированного клетки селезенки открыто диабетическая или преддиабетом BDC2.5 мышей передаются диабет новорожденных или иммунодефицитных мышей NOD с разной эффективностью 11,17-19.

Опишем простой метод, который использует очищенную трансгенных CD4 + Т-клеток от преддиабетическом BDC2.5 мышей, чтобы вызвать T1D в мышей-реципиентов при высокой эффективности и consisteNCY. Большие количества наивных, островок антиген-специфических CD4 + Т-клетки выделяют из этих мышей с активацией флуоресценции сортировки клеток (FACS) для CD4 + CD62L + Т-клеток, экспрессирующих TCR трансгенных Vβ4 цепи. Очищенный трансгенных Т-клетки, которые затем передаются без активации в NOD.SCID мышей, у которых отсутствует функциональный Т-и В-клеток и инсулитом и диабет без 20. Мышей-реципиентов контролируются на повышенных концентраций глюкозы в моче указывает T1D, которая быстро развивается в течение двух недель после перевода T клетки.

В отличие от других методов, которые передают диабетогенные Т-клеток с гетерогенной особенностей, наш протокол использует FACS отсортированные CD4 + Т-клеток, которые почти исключительно выразить диабетогенные BDC2.5 TCR. Благодаря своей однородности, только небольшое количество Т-клеток передается (~ 1x10 6 клеток / мышь) необходимы для быстрого развития СД-1 в течение 2 недель в 100% случаев. Еще одно преимущество нашего протокола является то, что irradiatioп мышей-реципиентов не является необходимым, так и для некоторых других методов. Потенциальным ограничением этого метода является то, что она не позволяет расследование вклад как CD4 и CD8 Т-клетки или подмножества специально CD8 Т-клеток при диабете.

Описанный протокол будет полезна для изучения быстрых T1D развитие, опосредовано наивный, моноспецифическую CD4 + Т-клеток, а также терапевтических стратегий вмешиваться в самонаведения островковых антиген-специфические клетки Th к органу-мишени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изоляция Т-клеток из селезенки и лимфатических узлов мышей BDC2.5

  1. Использование 6-недельных предварительно диабетической женский BDC2.5 мышей в качестве доноров диабетогенный CD4 + Т-клеток. Мыши должны быть диабет, насколько это определяется моче глюкозы измерения (см. ниже).
  2. Эвтаназии каждой мыши с помощью CO 2 удушья и удаления узлов селезенки, подмышечные и плечевой лимфатические в стерильных условиях. Для удаления селезенки, смочите меха с 70% этанола, а затем вырезать и убрать кожу. Селезенка будут видны виде темно-красного орган на левой стороне мыши. Сделать 1-дюймовый разрез в брюшной полости помощью небольшого ножницы и осторожно понять селезенки в центре с парой небольших пинцетом. Аккуратно обрезать соединительной ткани и прилегающего жира в максимально возможной степени и удаление селезенки.
  3. Соберите селезенки и лимфатических узлов в 10 мл среды Dulbecco's-изменения Орла (DMEM), в 15 мл коническую трубку на льду.
  4. Подготовка суспензии отдельных клеток с помощью гоэлектронной конце 10 мл стерильного шприца аккуратно нажать на лимфоидных органов через ячейки 70 мкм фильтры (один фильтр в селезенке и лимфатических узлах 4-6 за фильтром) в те же 50 мл коническую трубку.

Во время этого процесса полоскания каждый фильтр с 1 мл DMEM несколько раз с целью максимизации извлечения клеток из фильтра.

  1. Передача собранных клеток из 50 мл коническую трубку в 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 300-400 мкг в течение 7 мин при комнатной температуре.
  2. Для лизиса эритроцитов, отбросить супернатант, вновь приостановить клеток в 5 мл аммония-хлоридно-Калий (ACK) буфером (рН 7,2), и инкубировать ACK-клеточной суспензии при комнатной температуре в течение 5 мин.
  3. Добавить 10 мл DMEM с ACK-клеточной суспензии и центрифуги трубки, как указано выше. Промойте осадок клеток раз в 10 мл DMEM.

2. Флуоресценции Активированный сортировки клеток из диабетогенные CD4 + Т-клеток от мышей BDC2.5

  1. Повторное приостановить клеток в 5 мл FACS ссодержащих буфер и подсчитывают количество жизнеспособных клеток (с использованием фазово-контрастного микроскопа и гемоцитометра) трипанового исключения синий краситель.
  2. Использование буфера FACS, регулировать громкость клеточной суспензии до 5 х 10 7 клеток / мл. Удалить ~ 1 х 10 6 клеток на окрашивание управления (1 отсутствие пятна, 3 одноместных пятна). Пятно образец для неактивированными трансгенных CD4 + Т-клеток с анти-CD4 (APC), анти-TCR Vβ4 (FITC) и анти-CD62L (PE) моноклональные антитела (МКА) в 15 мл трубки. Выполнение клетки окрашивания с использованием концентраций мАт предложено производителем в течение 20-30 мин при 4 ° С в темноте.
  3. Промыть образец одного пятна и управления буфером FACS при> 3X объем реакции окрашивания. Центрифуга трубки при 300-400 мкг, удалить супернатант, и повторно суспендирования клеток в FACS буфере (1-2 × 10 7 клеток / мл для сортировки образца и 300 мкл на одно пятно контроль) и хранят на льду до следующего шагу.
  4. Пройти клеточную образца через 35 мкм ячейкиПробка фильтра трубку, чтобы удалить скопления клеток. Сортировка образцов для CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + клеток по мобильному сортировщик с квалифицированным оператором. Сбор отсортированных клеток в 3 мл DMEM в 15 мл трубки. Разрешить 2,5-3 часа, в том числе установки, чтобы разобраться 1,5 х 10 8 клеток (приблизительное количество клеток, полученных из 3 мышей донора) в своего рода скоростью 2 х 10 4 Всего событий / сек. Ожидайте ~ 2,5 х 10 6 неактивированными трансгенных CD4 + Т-клеток на мышь после сортировки клеток.
  5. Запишите абсолютное число отсортированных клеток в конце отсортируйте отцентрифугированы 7 мин при 300-400 г х. Удалите супернатант и вновь приостановить клетки (2 × 10 6 клеток / мл) в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS) (Mg 2 + / Ca 2 + бесплатный) для приемных передачи Т-клеток.

3. Приемные Передача диабетогенные CD4 + Т-клеток от мышей BDC2.5

  1. С помощью шприца емкостью 1 мл и 18-1 ½ иглы, осторожно повторно приостанавливать FACS-очищенные CD4 +Т-клетки и загрузить 1 мл шприца. В ходе подготовки к инъекции, заменить 18-1 ½ иглы с 27 ½ иглы.
  2. Expose 6-8 недельных самок мышей NOD.SCID получателя в нагревательную лампу, пока они не проявляют ухода поведение.
  3. Сдерживать мышей-реципиентов в фиксатор и протрите их хвост с 70% (объем / объем) этанола для дезинфекции месте инъекции.
  4. Введите 1-2 × 10 6 FACS отсортированных клеток / мышь (почти в 500 мкл PBS) в одну из боковых вены хвоста.

Не заставляйте поршня. Если игла расположена надлежащим образом в вену, инъекции будет проходить почти без сопротивления.

4. Мониторинг мышей-реципиентов для гипергликемии и T1D

  1. Начиная пять дней после T передачи клетку, NOD.SCID мышей получатель ежедневное наблюдение в течение повышенное содержание глюкозы в моче использованием индикаторных полосок (Bayer Diastix) в соответствии с инструкциями производителя. Мыши с двумя последовательными Уринпоказания электронной глюкозы> 250 мг / дл считаются диабет.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наши результаты показывают, изоляция BDC2.5 трансгенных клеток, экспрессирующих CD62L, которое является критическим для Т-клеток к дому, чтобы вторичных лимфоидных органах, таких как лимфатические узлы поджелудочной железы. Наши данные еще раз продемонстрировать мощные способности этого моноспецифическую клеточной популяции T для передачи быстро и эффективно, чтобы T1D NOD.SCID мышей получателя.

Выделение диабетогенный CD4 + Т-клеток от мышей BDC2.5 показан на рисунке 2. При...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

СД-1 может быть индуцирован в мышей-реципиентов с различной эффективностью по приемных передачи целых клеток селезенки или Т-клетки из подмножества диабетических мышей NOD или трансгенных мышей для TCR, полученный из сахарного диабета клеточных клонов Т. Мы сообщаем здесь воспроизводимый метод, чтобы побудить T1D в мышей-реципиентов в течение двух недель в 100% случаев, передавая FACS-очищенный CD62L + BDC2.5 трансгенных CD4 + Т-клеток в NOD.SCID мышей.

Особые преимущества BDC2.5 T модель пе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все мыши были размещены в колледже штата Пенсильвания Медицины специфических патогенов (SPF) объекта в соответствии с руководящими принципами штата Пенсильвания Институциональные уходу и использованию животных комитета.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим д-ра. Роберт Бонно и Нил Кристенсен за полезные комментарии.

Эта работа выполнена при поддержке Университета штата Пенсильвания Медицинского колледжа средств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Мышей BDC 2.5 TCR трансгенный NOD (NOD. Cg-Tg(Tcrα BDC 2.5, Tcrβ BDC 2.5)JAX004460
NOD. Мыши с ТКИД (NOD. CB17-Prkdcscid/J)JAX001303
модифицированная орлиная среда Dulbecco (DMEM)Themo ScientificSH30022.01
Bayer DiastixFisher ScientificAM2803
15 мл конические тубыFalcon352095
50 мл конические тубыFalcon352070
Стерильный хирургический пинцет
Стерильные ножницы
Стерильные ножницы
70 μ m клеточные фильтрыFisher Scientific22363548
35 μ m пробирки с крышками фильтраBD Biosciences352235
буфер хлорида аммония-калия (ACK) 0,15М NH<суб>4Cl, 1 мМ KHCO3, 0,1 мМ Na<суб>2ЭДТА, pH 7,2 в dH<суб>2O
жидкость оболочки BD FACSFlowTM жидкость оболочкиBD Biosciences342003
FACS окрашивающий буферPBS, 0,2 мМ ЭДТА, 0,5% БСА/FCS, фильтр стерилизованный
Фазово-контрастный микроскоп
Трипановый синий
гемоцитометр
Anti-CD4 (APC) mAb Biolegend1005616клон RM4-5
Anti-TCR Vβ 4 (FITC) mAbBD Biosciences553365клон KT4
Anti-CD62L (PE) mAbBD Biosciences553151клон MEL-14
Сортировщик клетокBD Biosciencesнапример BD FACSAria III
Тепловая лампа Удерживатель
1 мл шприцыBecton Dickinson309602
18-1½ калибровочные иглы (стерильные)Becton Dickinson305196
27½ калибровочные иглы (стерильные)Becton Dickinson305109
малой парыбольшой парымыши

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Makino, S., et al. Breeding of a non-obese, diabetic strain of mice. Jikken Dobutsu. 29, 1-13 (1980).
  2. van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol. Rev. 91, 79-118 (2011).
  3. Delovitch, T. L., Singh, B. The nonobese diabetic mouse as a model of autoimmune diabetes: immune dysregulation gets the NOD. Immunity. 7, 727-738 (1997).
  4. Wicker, L. S., Miller, B. J., Mullen, Y. Transfer of autoimmune diabetes mellitus with splenocytes from nonobese diabetic (NOD) mice. Diabetes. 35, 855-860 (1986).
  5. Bendelac, A., Carnaud, C., Boitard, C., Bach, J. F. Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD mice to healthy neonates. Requirement for both L3T4+ and Lyt-2+ T cells. J. Exp. Med. 166, 823-833 (1987).
  6. Haskins, K., McDuffie, M. Acceleration of diabetes in young NOD mice with a CD4+ islet-specific T cell clone. Science. 249, 1433-1436 (1990).
  7. Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. H. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors. Diabetes. 42, 44-55 (1993).
  8. Wicker, L. S., Todd, J. A., Peterson, L. B. Genetic control of autoimmune diabetes in the NOD mouse. Annual Reviews in Immunology. 13, 179-200 (1995).
  9. Serreze, D. V., et al. MHC class I-mediated antigen presentation and induction of CD8+ cytotoxic T-cell responses in autoimmune diabetes-prone NOD mice. Diabetes. 45, 902-908 (1996).
  10. Milton, M. J., Poulin, M., Mathews, C., Piganelli, J. D. Generation, maintenance, and adoptive transfer of diabetogenic T-cell lines/clones from the nonobese diabetic mouse. Methods Mol. Med. 102, 213-225 (2004).
  11. Kurrer, M. O., Pakala, S. V., Hanson, H. L., Katz, J. D. Beta cell apoptosis in T cell-mediated autoimmune diabetes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 213-218 (1997).
  12. Amrani, A., et al. Perforin-independent beta-cell destruction by diabetogenic CD8(+) T lymphocytes in transgenic nonobese diabetic mice. J. Clin. Invest. 103, 1201-1209 (1999).
  13. Dobbs, C., Haskins, K. Comparison of a T cell clone and of T cells from a TCR transgenic mouse: TCR transgenic T cells specific for self-antigen are atypical. J. Immunol. 166, 2495-2504 (2001).
  14. Haskins, K., Portas, M., Bradley, B., Wegmann, D., Lafferty, K. T-lymphocyte clone specific for pancreatic islet antigen. Diabetes. 37, 1444-1448 (1988).
  15. Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
  16. Stadinski, B. D., et al. Chromogranin A is an autoantigen in type 1 diabetes. Nat. Immunol. 11, 225-231 (2010).
  17. Luhder, F., Chambers, C., Allison, J. P., Benoist, C., Mathis, D. Pinpointing when T cell costimulatory receptor CTLA-4 must be engaged to dampen diabetogenic T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12204-12209 (2000).
  18. Tang, Q., et al. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J. Exp. Med. 199, 1455-1465 (2004).
  19. Calderon, B., Suri, A., Pan, X. O., Mills, J. C., Unanue, E. R. IFN-gamma-dependent regulatory circuits in immune inflammation highlighted in diabetes. J. Immunol. 181, 6964-6974 (2008).
  20. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
  21. Waldner, H., Sobel, R. A., Price, N., Kuchroo, V. K. The autoimmune diabetes locus Idd9 regulates development of type 1 diabetes by affecting the homing of islet-specific T cells. J. Immunol. 176, 5455-5462 (2006).
  22. Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J. Exp. Med. 186, 1663-1676 (1997).
  23. Thomas, D. C., Mellanby, R. J., Phillips, J. M., Cooke, A. An early age-related increase in the frequency of CD4+ Foxp3+ cells in BDC2.5NOD mice. Immunology. 121, 565-576 (2007).
  24. Prochazka, M., Gaskins, H. R., Shultz, L. D., Leiter, E. H. The nonobese diabetic scid mouse: model for spontaneous thymomagenesis associated with immunodeficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 3290-3294 (1992).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD4NOD SCIDBDC2 5

Похожие статьи