Простой и эффективный метод для обнаружения ядерных активация фактора в человеческих нейтрофилов с помощью проточной цитометрии

Summary

Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов в крови. Нейтрофилы обладают транскрипционно регулируется функций, таких как производство провоспалительных цитокинов и торможению апоптоза. Эти функции могут быть изучены с методом, представленные здесь, которые позволяют обнаружения и количественного ядерного фактора методом проточной цитометрии в изолированных ядрах

Abstract

Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов в периферической крови. Эти клетки являются первыми появляются на участках воспаления и инфекции, став таким образом первой линией обороны против вторжения микроорганизмов. Нейтрофилы обладают важными антимикробной функции, такие как фагоцитоз, высвобождение литических ферментов, продукцию активных форм кислорода. В дополнение к этим важным функциям защиты, нейтрофилы выполнять другие задачи, в ответ на инфекцию, таких как производство провоспалительных цитокинов и торможению апоптоза. Цитокины привлечь другие лейкоциты, которые помогают очистить инфекции, и ингибирование апоптоза нейтрофилов позволяет жить дольше на месте инфекции. Эти функции регулируются на уровне транскрипции. Однако, так как нейтрофилы являются короткоживущими клетки, исследование транскрипционно регулируется ответы в этих клетках не может быть выполнено с традиционными методами генной репортер так как нет эффективностиcient методы нейтрофилов трансфекции. Здесь мы представляем простой и эффективный метод, который позволяет обнаружения и количественного ядерного фактора в изолированных и immunolabeled ядер методом проточной цитометрии. Мы описываем методы, чтобы изолировать чистую нейтрофилов периферической крови человека, стимулируют эти клетки с анти-антител к рецептору, изолировать и immunolabel ядер, ядер и анализа методом проточной цитометрии. Этот метод был успешно использован для обнаружения NF-kB и Elk-1 ядерных факторов в ядрах из нейтрофилов и других типов клеток. Таким образом, этот метод представляет собой вариант для анализа активации транскрипционных факторов в изолированных ядрах из различных типов клеток.

Introduction

Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов в периферической крови ^1. Во время воспаления и инфекции нейтрофилы являются первыми клетками появляются на пораженные места, где они выступают в качестве первой линии обороны ^2. Нейтрофилы обладают антимикробным несколько механизмов ^3, включая фагоцитоз, продукцию активных форм кислорода, выделение литических ферментов дегрануляцию и производство провоспалительных цитокинов ^4,5. Нейтрофилы являются недолговечными клеток, которые получают быстро активировать с помощью сигналов от различных рецепторов клеточной поверхности. Несмотря на то, нейтрофилы были рассмотрены терминала клеток из-за их короткой жизни, а потому, что они подвергаются апоптозу, если активированы во время воспалительного процесса ^6, уже сейчас ясно, что они также могут изменить свой ​​фенотип, изменяя уровень транскрипции определенных генов. Продукции цитокинов ⁵ и ингибирование апоптоза ^7,8 две яmportant-зависимой активации функции клеток регулируется на уровне транскрипции в нейтрофилах. Ядерный фактор кВ (NF-kB) участвует в транскрипционным контролем цитокинов ^{4 производственных} и в регулировании выживания клеток и апоптоз ^9-11 в различных типах клеток.

Сигнальных путей, которые ведут к ядерному активация фактора, как правило, изучаются анализы гена-репортера или сдвига электрофоретической подвижности анализы (EMSA). Однако, так как нейтрофилы являются короткоживущими клетки, исследование транскрипционно регулируется ответы в этих клетках не может быть выполнена с анализа гена-репортера, поскольку нет эффективных методов для нейтрофилов трансфекции. EMSA анализы были использованы в нейтрофилах, чтобы исследовать ядерный фактор активации ^12,13, однако эта методология является сложной и дорогой, потому что она включает в себя использование радиоактивных материалов. Nucleofection является еще одним методом, который был использован successfuLLY для трансфекции моноциты ^14. Таким образом, по крайней мере в теории, ядерной активация фактора могут быть обнаружены в нейтрофилах путем трансфекции (несмотря на низкую эффективность). Однако, этот метод был бы более дорогим, отнимающим много времени и, вероятно, менее количественные. Микроскопический анализ иммуноокрашиванию клетки могут быть также использованы для обнаружения ядерных факторов в ядре. Действительно, мы обнаружили NF-kB транслокации в ядро таким образом ^15. К сожалению, этот метод также времени, меньше количественных и с учетом смещения наблюдателя.

Здесь мы представляем простой и эффективный метод, который позволяет обнаружения и количественного ядерного фактора в изолированных и immunolabeled ядер методом проточной цитометрии. Мы описываем методы, чтобы изолировать нейтрофилов периферической крови человека, стимулируют эти клетки через интегрины или Fc рецепторов с анти-антител к рецептору, изолировать и immunolabel ядер, ядер и анализ с помощью проточной цитометрии (Figure 1). Этот метод был успешно использован для обнаружения NF-kB ¹⁵ и Elk-1 ¹⁶ ядерных факторов нейтрофилов ядер. Чувствительность этого метода позволяет обнаруживать небольшие изменения в ядерных уровней фактора в ядре. Этот метод также может быть использован для анализа уровня факторов транскрипции в ядрах от других типов клеток.

Protocol

1. Выделение нейтрофилов (ПМН) из крови человека

1. Используйте около 20 мл крови человека с гепарином (10 ЕД / мл) в качестве антикоагулянта. Кровь была собрана из взрослых здоровых добровольцев venopuncture. Все эксперименты проводились при утверждении комитета по биоэтике при институте де-следственной Biomédicas - UNAM.
2. Поместите 2 мл 6% декстрана T500 в PBS в 15 мл коническую трубку центрифуги и добавить 10 мл крови. Смешать путем обращения трубки два или три раза и оставьте на 45 мин, чтобы обеспечить оседание эритроцитов.
3. В свежем 15 мл коническую трубку центрифуги поставить 5 мл Ficoll-Paque.
4. Возьмите лейкоцитов плазмы, обогащенной что образуется над осаждаются эритроциты, и осторожно пипеткой его на верхней части Ficoll-Paque формирования второго слоя. Убедитесь в два этапа.
5. Центрифуга при 516 х г в течение 20 мин при 4 ° C. После центрифугирования на межфазной плазмы и Ficoll-Paque есть слой мононуклеаров. Небраскаutrophils находятся в нижней части трубки.
6. Ликвидация супернатанта, разбить осадок клеток, нажав на трубке против стойку, и ресуспендирования клеток путем добавления 10 мл холодного (4 ° С) PBS. Примечание: ресуспендирования клеток с помощью пипетки вверх и вниз не рекомендуется, поскольку это слишком повреждения в клетках.
7. Передача клеточной суспензии в 50 мл коническую трубку центрифуги и центрифугируют при 290 х г в течение 5 мин при 4 ° C.
8. Перерыв осадок клеток как раньше, и добавляют 10 мл холодного (4 ° C) гипотонический раствор (0,2% NaCl, 1% БСА, 20 мМ Hepes, рН = 7,4) для лизиса эритроцитов. Смешать по закрученной трубки аккуратно от руки ровно на одну минуту.
9. Добавить 10 мл холодного (4 ° C), гипертонический раствор (1,6% NaCl, 1% БСА, 20 мМ HEPES, рН = 7,4), перемешать и подсчета клеток с использованием гемоцитометр (обычно> 95% ПМН).
   Примечание: Держите трубку с клеточной суспензии на льду при подсчете клеток.
10. Центрифуга, как и прежде ресуспендируют PMN в 107 клеток / мл в холодном (4 ° С) PBS. Держите на льду.
    Примечание: нейтрофилы остаются жизнеспособными и функциональной при 4 ° С в течение приблизительно от 6 до 8 часов.

2. Активация PMN

1. Положите 100 мкл суспензии PMN (1 х 10 ⁷ клеток / мл) в 1,5 мл трубки Эппендорф.
   Примечание: Образец трубы должно быть сделано по крайней мере, в двух экземплярах. Обычные отрицательного контроля должна включать в себя первое антитело только, и только вторичным антителом.
2. Добавить соответствующие анти-интегрин или анти-Fc рецептор моноклональных антител (МКА) в концентрации 10 мкг / мл и инкубировали на льду в течение 15 мин.
3. Вымойте PMN путем добавления 1 мл холодного (4 ° С) PBS, центрифугирования при 1743 х г (4.500 оборотов в минуту) в микроцентрифуге и аспирационных супернатант.
4. Перерыв осадок клеток, нажав в нижней части трубки от стойки, добавить 1 мл холодного PBS, и мыть два раза, как и в предыдущем шаге.
   Примечание: Эти моет удаления несвязанного антитела.
5. Ресуспендируют PMN в том же (вitial) объем теплой (37 ° C) PBS, содержащей 60 мкг / мл F (аb ') 2 антимышиного IgG.
   Примечание: вторичные анти-мышиных IgG антитела будут связываться с первым анти-рецептор антител и приведет к сшиванию рецепторов.
6. Инкубировать при 37 ° С в течение от 1 до 20 мин, в зависимости от ядерного фактора интереса. Для NF-kB обычно 15 минут, а для Elk-1 обычно 5 мин.
   Примечание: инкубации клеток при 37 ° C индуцирует рецепторов сшивания, которая не может иметь место при 4 ° C.
7. Добавить 1 мл холодного PBS и центрифугируют 3 мин при 1743 мкг в микроцентрифуге.
8. Удалить супернатант
9. Замораживание ПМН сразу в dry-ice/ethanol ванну и держать их там в течение 10 мин.

3. Выделение и фиксация ядер

1. Ресуспендируют замороженных PMN осадок в 100 мкл холодного (4 ° C) гипотонического буфера (10 мМ HEPES, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl _2, и 1 мМ недавно на добавленную _{DL-дитиотреитол} [DTT], РН = 7,9). Рекомендуется принять труб из dry-ice/ethanol ванну один за другим, и протирайте дно пробирки перед добавлением гипотонического буфера.
2. Место на льду, и проверьте целостность ядра путем окрашивания аликвоты ядер подвеска с трипановым синим. Ядрами оглянуться и синий. Неповрежденном PMN не получить загрязнена, и остатки клеток выглядит как синяя частиц неправильной формы.
   Примечание: Если ядрами суспензии содержит много неповрежденных клетках или мусор, то лучше отказаться от подготовки и повторить процедуру с другим образцом.
3. Центрифуга ядер при 775 мкг (3.000 оборотов в минуту) в микроцентрифуге в течение 10 мин в холодной комнате. В этот момент ядра очень хрупкие и дополнительный уход должны быть приняты в соответствии образцы холодного и не центрифугирования при чрезмерной силы.
4. Удалить супернатант очень осторожно пипеткой.
5. Добавить 100 мкл холодного 4% параформальдегидом в PBS, чтобы исправить ядер.
   Примечание: осадок очень рыхлыйD добавления буфера достаточно, чтобы ресуспендируйте ядер. Пипетки вверх и вниз следует избегать.
6. Инкубировать на льду в течение 20 мин.
7. Immunolabel ядер для проточной цитометрии или держать их в течение 24 ч при 4 ° C.

4. Ядрами для иммунного анализа потока цитометрии

1. Центрифуга ядер на 1743 XG (4.500 оборотов в минуту) в микроцентрифуге в течение 1 мин, и удалите супернатант очень осторожным пипетированием.
2. Добавить 100 мкл холодного (4 ° C) 0,1% Triton X-100, 4% параформальдегидом в PBS в permeabilize ядер. Инкубировать на льду в течение 10 мин.
3. Центрифуга пермеабилизованной ядер при 1743 мкг в микроцентрифуге и осторожно удалите супернатант. В этот момент ядра гранулы не придаем также в нижней части трубы. Рекомендуется к центрифуге снова, если осадок получает свободный.
4. Ресуспендируют ядер в 500 мкл холодного 4% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) в PBS, чтобы блокировать неспецифические сайты связывания, и инкубировать на льду в течение 20 мин. Центрифугироватьядер при 1743 х г в течение 3 мин в микроцентрифуге и осторожно удалите супернатант.
5. Ресуспендируют ядер в 100 мкл холодного PBS, содержащем 4% FBS и 2,5 мкг / мл мАт против ядерного фактора интереса. Инкубировать на льду в течение 20 мин.
   Примечание: Обычно отрицательного контроля должна включать в себя анти-ядерный фактор антитела только, и FITC-меченого вторичного антитела только.
6. Мыть два раза с 500 мкл холодного PBS с 4% FBS и центрифугирования при 1743 х г в течение 3 мин.
7. Удалить супернатант очень осторожно, ресуспендируют ядер в 100 мкл холодного PBS, содержащем 4% FBS и 10 мкг / мл соответствующего FITC-меченого вторичного антитела и инкубировали на льду в течение 20 мин.
8. Вымойте ядер в два раза с 500 мкл холодного PBS с 4% FBS, как и в предыдущем шаге.
9. Ресуспендируют ядер в 400 мкл холодного 4% параформальдегидом в PBS.
   Примечание: ядра помещают в параформальдегид, чтобы образца будут храниться в течение нескольких дней без загрязненияпроблемы, которые могут возникнуть в присутствии сыворотки.
10. Анализ немедленно проточной цитометрии или хранить в темноте при 4 ° C в течение трех дней.

5. Анализ проточной цитометрии

1. Анализ immunolabeled ядер в проточной цитометрии такой FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) или аналогичное устройство.
2. Настройте параметры приобретения: FSC в логарифмической шкале на 10-1, SSC в логарифмической шкале в 196, и ворота ядер в дот-сюжет.
3. Приобретать десять тысяч ядер в образце.
4. Анализ флуоресценции FITC-окрашенных ядер через FL-1 канал (506 нм) установлены на логарифмической шкале на 400.

Results

Способ очистки описаны здесь обычно обеспечивает нестимулированных нейтрофилов (ПМН) с чистотой более 95% (рис. 1А). Изолированные PMN может быть стимулировано путем сшивания частности рецепторов специфические моноклональные антитела. Мы стимулировали ПМН через рецепторы Fc и интегрины (рис. 1б). Как только стимулировали, ПМН лизируются и ядра изолированы с высокими выходами. Ядра затем immunolabeled для конкретного ядерного фактора, таких как ядерный фактор кВ (NF-kB), со специфическим...

Discussion

Очистка метод, описанный здесь позволяет изоляции нестимулированных нейтрофилов (ПМН) с чистотой более 95% (оценка микроскопических наблюдений), в течение короткого времени. Иногда нейтрофилы могут быть загрязнены эритроцитов, если последний не лизируются полностью. Это обычно не влияет на технику, так как эритроциты и ПМН можно легко отличить в отличие популяции клеток с помощью проточной цитометрии. Изолированные PMN может быть стимулировано путем сшивания частности рецепторов специфические моноклональные антитела. В ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Heparin	PiSA (Мексика)
Dextran T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark)	T1-Dexton T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
Sodium chloride	Sigma	S7653
Sodium phosphate monoprincipal	Sigma	S9638
Двухосновной фосфат	натрия Sigma	S9390
Бычий сывороточный альбумин (БСА)	Sigma	A2153	Фракция Кона V
HEPES	Sigma	H3375
Хлорид калия	Sigma	P9541
Магния хлорид безводный	Sigma	M8266
DL- дитиотреитол (DTT)	Sigma	D9163
Трипан синий (0,4 % раствор)	Sigma	T8154
Параформальдегид	Sigma	P6148
Triton X-100	Sigma	X100
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	GIBCO	10437-028
Моноклональное антитело IV.3	Medarex (Аннандейл, Нью-Джерси)	025-1	Человекоспецифичное анти-FcRII (CD32)
Моноклональное антитело 3G8	Medarex (Аннандейл, Нью-Джерси)	028-2	Специфичное для человека анти-FcRIII (CD16)
Моноклональное антитело TS2/16	Dana Farber Cancer Research Institute (Бостон, Массачусетс)	Подарено доктором Мартином Хемлером	Специфичное для человека анти-β 1 интегрин (CD29)
Моноклональное антитело IB4	Калифорнийский университет, Сан-Франциско	Пожертвовано доктором Эриком Дж. Брауном	Специфичный для человека анти-β 2 интегрин (CD18)
F(ab')2 козий антимышиный IgG	Cappel (Aurora, OH)	55468
FITC-конъюгированный F(ab')2 козий антимышиный IgG	Cappel (Aurora, OH)	55522
FITC-конъюгированный F(ab')2 козий анти-кроличий IgG	Cappel (Aurora, OH)	55665
Anti-NF-κ B p50	Santa Cruz Biotechnology (Санта-Круз, Калифорния)	sc-114	Кролик поликлональное антитело
Anti-NF-κ B p65	Santa Cruz Biotechnology (Санта-Круз, Калифорния)	sc-109	Кролик поликлональное антитело
EQUIPMENT
15-мл центрифужная пробирка	Corning	430791
50 мл центрифуга	Corning	430291
центрифуга, Sorvall Настольная	Dupont Instruments	RT 6000D
pH-метр	Пипетка Corning	340
Пипетман P-20 Пипетман	F123600
Пипетман Пипетман P-200
Пипетман P-1000	Гемоцитометр Жильсона	F123602
	микроскоп	Фишера Научный
Микроскоп	Nikon	Eclipse E600
Инвертированный микроскоп	Инкубатор с	TMS
	Fisher Scientific	2IS-M
Микроцентрифуга	Eppendorf	5414C
Проточный цитометр	Becton Dickinson (Франклин Лейкс, Нью-Джерси)	FACScalibur