Method Article

Техники обработки глаз имплантировали протез для сетчатки Локализованные Гистопатологический анализ

DOI:

10.3791/50411

⸱

August 2nd, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bionics Institute, 2Department of Anatomical Pathology, St Vincent's Hospital Melbourne, 3Department of Pathology, University of Melbourne, 4Medical Bionics Department, University of Melbourne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы визуализации сетчатки цитоархитектонике, непосредственно прилегающие к электродам в отдельных сетчатки стимулятора.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С недавним развитием протезы сетчатки, важно разработать надежные методы оценки безопасности этих устройств в доклинических исследованиях. Однако стандартная фиксация, подготовки и автоматизированные процедуры гистологии не являются идеальными. Здесь описаны новые процедуры оценки состояния здоровья сетчатки, непосредственно прилегающей к имплантату. Протезы сетчатки имеются массивы электродов в контакте с глазной ткани. Предыдущие способы не смогли пространственно локализовать глазной ткани, прилегающей к отдельных электродов в массиве. Кроме того, стандартный гистологической обработки часто приводит к искусственной валового отряд слоев сетчатки при оценке имплантированных глазами. Следовательно, было трудно оценить локальное повреждение, если присутствует, вызванных имплантацией и стимулирование имплантированный электрод массив. Поэтому мы разработали метод для выявления и локализации глазной ткани, прилегающей к имплантированной электроннойlectrodes использованием (разноцветных) красителя маркировки схемы, а мы модифицировали технику фиксации взгляда, чтобы минимизировать артефакты отслойки сетчатки. Этот метод также оказывает полупрозрачный склеры, позволяя локализации отдельных электродов, и определенные части имплантата. Наконец, мы использовали из контрольной увеличить силу гистопатологические оценок. Таким образом, этот метод позволяет надежная и эффективная дискриминации и оценка сетчатки цитоархитектонике в имплантированных глаза.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протезы сетчатки вскоре может стать полезной клинических вмешательств для лечения различных форм тяжелой потери зрения. Определенных условий, таких как пигментный ретинит (RP), результат в распространенном дегенерация фоторецепторов в глазу; эти клетки, ответственные за трансдуцирующих свет в нервные сигналы. Тем не менее, некоторые клетки в других слоев сетчатки остаются и являются потенциальными мишенями для электрической стимуляцией сетчатки протеза 1. Первые результаты клинических испытаний на человеке были перспективны для электрода массивов имплантированный в эпиретинальных 2,3, 4,5 субретинальной и интрасклеральный 6 местах. Эти устройства изготовлены из различных материалов с различными формами, но все они используют электрические импульсы, чтобы активировать оставшиеся жизнеспособные нейроны сетчатки для того, чтобы создавать визуальные восприятия.

Наша широкая группа (Bionic Видение Австралия) разработал имплантат сетчатки, который имеет прогрессированияСЭД в клиническом экспериментальном исследовании пациентов с 3 RP имплантировали супрахориоидальном массивы электродов (клиническая Число суд: NCT01603576). рис. 1А показывает, что это прототип сетчатки супрахориоидальном протеза.

Безопасность пациентов имеет первостепенное значение в клинических исследованиях и, таким образом, перед началом испытания на человеке, мы провели обширное острых и хронических тестирование на доклинических моделях (рис. 1В). Гистологические оценки были необходимы для уточнения хирургических процедур, итерацию электрод дизайн и, наконец, установить безопасность имплантата. Для поддержания эффективной работы ИС с учетом стандартной клинической патологии практики, техники парафином работал. Желательно также, чтобы использовать процедуры окрашивания сопоставимы с клиническими стандартами, такими как гематоксилином и эозином (H & E), которые могут быть легко истолкованы патологи. Мы также хотели, техника, которая может быть адаптирована для иммуногистохимического анализа, вцелях содействия дальнейшему сотовой оценки тканей.

Биосовместимость имплантата материалы и безопасность хронической электростимуляции, необходимо тщательно оценить. Важно, чтобы иметь возможность изучить гистопатология глазной ткани, прилегающей к отдельным стимулирующих электродов в массиве. Тем не менее, массивы необходимо удалить перед обработкой образцов, чтобы они могли быть испытаны, и потому, что их металлические компоненты не могут быть легко секционного. Таким образом, наши установленный подготовки ткани не позволили локализации и отображение ткани по отношению к имплантированных электродов 7. В дополнение к отсутствию метода локализации ткани, стандарт на основе формальдегида фиксации и методы обработки привело к широкому распространению артефакты и отслоение сетчатки из-за дифференциальной усадки различные слои глаз (рис. 2). В связи с неоднородностью тон сетчатки, было трудно сделать достоверное сравнение с контрольной ткани, в частности, для количественных измерений. В совокупности эти ограничения сложно точно оценить возможный ущерб, причиненный нашими имплантированных массивов.

Здесь мы представляем новые методы для преодоления этих ограничений. Мы модифицировали специализированных глаз фиксации и обработки методами 8-10 Для поддержания совместимости с парафиновой основе гистологии. Мы модифицировали стандартных гистологических и иммуногистохимических пятна давать сопоставимые результаты, основанные на обратной связи от клинической патологии. После оказания склеры полупрозрачная ткань, на основе красителя цвет-код был использован, чтобы отметить глазной ткани, прилегающих к каждому электроду, перед снятием массив из супрахориоидальное пространстве. Нанося массива электродом и отдельных участков электродов, образцы могут быть точно собраны из электродов прилегающих регионах. Соответствие образцов может быть собрана из йэлектронный контрольный глаз в целях содействия парных сравнений.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Энуклеация и пост-фиксации

Этот протокол предполагает, что предмет был имплантирован в одностороннем порядке с супрахориоидальном массив электродов.

  1. Подготовьте Postfix решений в стеклянных бутылках Schott.
    1. Фиксирующий раствор Дэвидсона, 2x 100 мл
      • 2 мл формалина (37% формальдегида)
      • 10 мл ледяной уксусной кислоты (99,7%)
      • 35 мл этанола (98%)
      • 53 мл дистиллированной воды
    2. 50% этанола, 2x 100 мл
    3. 70% этанолом, 2x 100 мл
  2. Транскардиальной перфузии субъекта с теплой (37 ° С) гепаринизированным физиологическим раствором с последующей холодной (4 ° С) нейтральный буферный формалин (10%).
  3. Свяжите швов в верхнем лимбе (или места, удаленного от супрахориоидальное массив) обоих глаз - в соответствии с прямой мышцы, чтобы служить в качестве ориентира.
  4. Выяснять глаза, поддерживая любые внешние выводы из имплантированных глаза.
  5. Наведите EACч глазом в 100 мл фиксирующего раствора Дэвидсона и оставить постфиксных при комнатной температуре.
  6. Через 18 - 36 часов в фиксаторе Дэвидсона, перевод на 50%-ном этаноле (при комнатной температуре) в течение 6 - 8 ч, затем, наконец, в 70%-ном этаноле (комнатная температура).
  7. Охладите образцы при 4 ° С и хранят до вскрытия.

Неповрежденной и давлением глобусы глаза были сохранены таким образом на срок до 3 месяцев без отрицательного влияния на результирующий гистологии.

2. Идентификация и ткани карт

Выше протокол фиксации (шаг 1) оказал склеры полупрозрачные и массив теперь видны - в том числе отдельных участках электрода (рис. 3).

  1. Снимите имплантированных мира из этанола и осторожно обрежьте лишнюю ткань, в том числе конъюнктивы и капсулы Тенонову. Обрезать зрительному нерву в 2 - 3 мм длины (рис. 3А).
  2. Использование гистологических красителей Маркинг схема, этикетки электродов с заданным кодом цвета, стараясь не размазать краску.
  • Мы выбрали коммерчески доступный набор специализированных гистологических красителей (см. Приложение). Небольшие количества красителя были тщательно наносится тонкой наконечником кисть (Roymac размер 00) в ткани и дают высохнуть на воздухе в течение 5 мин.
  • Для наших целей мы выбрали: зеленый для активного электрода (ов), который (за которые) стимулировали максимально, на сверхпороговой уровнях, в течение всего срока исследования; красная для других активных электродов, желтый для больших электродов диаметром возвращение, синий для дополнительных руководств и / или анатомических маркировки расстояния (рис. 3В и 3С).
  • Методом проб и ошибок может потребоваться, чтобы найти краситель, который является стабильным на протяжении последующих стадиях. Например, на фигуре 4, можно видеть, что зеленый краситель была более устойчивой, чем красный краситель. Разбавление краситель в 70% этаноле способствует улучшению липидного Penetрациона и тканей покрытия.
  • Это полезно рисовать или фотографировать окрашенных миру для дальнейшего использования.
  1. Вернуться на 70% этанола для обезвоживания красителя.
  2. Повторите шаг 2.1 для управления unimplanted миру.
  3. Использование швов, начиная с шага 1.3, совместите глазом управления и имплантированным глазом как зеркальной пары.
  4. Поместите силиконовый шаблон (с теми же размерами, что и электрод массив) в том месте, зеркальной по контролю глазом как имплантат расположен на имплантированный глаз (NB полупрозрачный склеры и краситель маркировку с шагом 2,2 позволить готовый визуализации имплантировали массив положение ).
  5. Выполнить шаги 2,2 и 2,3 для контроля глаз, так что каждый имплантированный электрод сайт имеет контроль пара в анатомически сопоставимых (т.е. зеркало соответствует эквивалент) расположения.

3. Вскрытие и внедрение

  1. Удалить имплантат массив из глаза и удалить перед глазом(Включая роговицу, радужную оболочку и линзы). Удалите жидкость из стекловидного оставшиеся чашки глазом (задней камеры).
  2. Рассеките имплантированы в глаз множества полос представитель (~ 2 мм толщиной), каждый из которых содержит подмножество краситель отмечены областей (рис. 3D). Следует отметить, что ориентация полосы должны быть выбраны, чтобы помочь в оценке различных аспектов реакции тканей на имплантат 7.

Это полезно, для использования в будущем, сделать запись которого краситель регионах присутствуют на каждой полосе и их относительное расположение (и цвета).

  1. Поместите полосу на боку в мелком бассейне сжиженного агара (4%, 80 - 90 ° C) с боковыми быть сокращены первого вниз (рис. 3Е).
  2. После того, агар установила, вырезать вокруг образца и место в ткань кассеты поддерживают поролоновыми вставками (рис. 3F).
  3. Повторите шаги 3.1-3.3 для контроля глаза - Takму обслуживанию препарировать зеркало соответствием полос.
  4. Обработать все кассеты с помощью стандартных (автоматизированная ночь) метод обработки парафин.
  5. Вставить обработанных тканей в парафин с боковой быть сокращены первого вниз.

4. Резка и окрашивание

  1. Вырезать парафиновых блоков в 5 мкм разделы, касающиеся регулярно Записки из шагов 2 и 3.
  2. Сбор разделов от каждого из окрашенных областей и установить на слайдах.

Области, непосредственно примыкающей к каждой окрашенный место склеры теперь могут быть оценены с уверенностью, что это было в непосредственной близости к соответствующему электроду в массиве (рис. 4).

  1. Пятно или выполнять иммунофлюоресценции как хотелось бы. Пример пятен и иммуногистохимии показано на рисунке 5 являются: H &E; Luxol быстрый синий (LFB); крезиловым фиолетовым; Массона трехцветный сине; периодические кислоты Шиффа (PAS); Перлза берлинская лазурь STAВ, анти-глутаминсинтетазу (GS); анти-нейрофиламента белка (NF); анти-глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) и 4 ',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI).
  2. Стандартные и специальные окрашивали, как описано:
    1. H & E окрашивание проводили в соответствии с протоколом, прилагаемым к Leica multistainer ванны массив ST5020 (Leica Biosystems).
    2. LFB и крезиловым фиолетовым (модифицированный из 11):
      1. Dewax в три изменения ксилола (3 х 2 мин) и 2 изменения этанола (100%, 100%) (2x 1 мин) и полоскание в водопроводной воде (45 сек).
      2. Гидрат секций 95% этанола.
      3. Место в LFB решение 11 при 37 - 42 ° C (в течение ночи).
      4. Смойте избыточного пятна с 70% этанола.
      5. Промыть в дистиллированной воде.
      6. Место в разбавленных карбоната лития (8%) (несколько секунд).
      7. Дифференцировать в 70% этаноле (несколько секунд).
      8. Промыть в дистиллированной воде.
      9. Повторяйте шаги с 4.4.2.6 до 4.4.2.8, при необходимости, до Bсправочных бесцветна.
      10. Место в крезиловым фиолетовым ацетат рабочего раствора при 37 ° С (10 мин).
      11. Не мойте в воде.
      12. Высушить в три изменения абсолютного спирта (1x 30 сек, 20 сек 2x) и 3 изменения ксилоле (1x 1 мин 30 сек, 2 х 1 мин).
      13. Горы и покровного с DPX.
    3. Массона трехцветный синий (модифицированный из 11):
      1. Dewax согласно 4.4.2.1.
      2. Принесите срезы в дистиллированную воду (2 мин).
      3. Пятно ядер с использованием Weigert железный гематоксилин (2 мин).
      4. Стирать в водопроводной воде, промыть в дистиллированной воде.
      5. Пятно в Biebrich алого фуксинсернистой кислотой раствор (5 мин).
      6. Промыть в дистиллированной воде.
      7. Дифференцироваться в фосфомолибденового-фосфорновольфрамовая кислоту до коллаген бледно-розового (6 мин).
      8. Промыть в дистиллированной воде.
      9. Контрастное в анилин синий (1 мин).
      10. Хорошо промыть в 1%-ной уксусной кислотой (1 мин).
      11. Дегидрировать, гора и покровного как пER 4.4.2.12 и 4.4.2.13.
    4. PAS (модифицированный из 11):
      1. Dewax согласно 4.4.2.1.
      2. Oxidize в 1% йодной кислотой (15 мин).
      3. Мыть в проточной воде, затем дистиллированной водой.
      4. Пятно в реагента Шиффа (15 мин).
      5. Стирать в воде (5 мин).
      6. Контрастное с Харрисом гематоксилином (1 мин).
      7. Вымойте кратко в водопроводной воде.
      8. Дифференцировать в 0,5% кислоты спиртом (1 DIP).
      9. Хорошо промыть в водопроводной воде.
      10. Синий в водопроводной воде Скотта (1 мин).
      11. Хорошо промыть в воде.
      12. Дегидрировать, гора и покровного согласно 4.4.2.12 и 4.4.2.13.
    5. Перлза прусской синевы, как описано в 11.
  3. Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили, как описано:
    1. Dewax согласно 4.4.2.1.
    2. Промыть в дистиллированной водой (2х 5 мин).
    3. Выполнение поиска антигена использованием 0,01% цитратным буфером, рН 6 при 75 - 80 ° C (20 мин)д дать остыть в 0,01%-ном растворе цитратного буфера (20 мин).
    4. Мытье секций в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) (2 х 5 мин).
    5. Проницаемость клеточной мембраны в промывочном буфере раствора (10 мин).
    6. Инкубируют в сыворотке решение блоке (2 ч).
    7. Выдержите разделов в одном первичных антител разводят в антителом разбавителя (10% нормальной козьей serum/0.1% Тритон X-100/PBS) (на ночь в холодильник). Титр каждого первичного антитела использовали показано в таблице 1.
    8. После инкубации в течение ночи, мыть мыть в разделах буферный раствор (5x 3 мин). С этого момента, держите разделов в темноте.
    9. Инкубируйте разделы в соответствующие вторичные антитела в титре 1:500 в течение определенного времени (см. таблицу 1 для деталей).
    10. Вымойте секций в мытье буферным раствором (3x 5 мин).
    11. Инкубируйте разделы DAPI (1:25000 / PBS) (30 мин).
    12. Вымойте секций в мытье буферным раствором (3x 5 мин).
    13. Горы и покровного использованием светитьсяNT монтажная СМИ.

Образцы для испытаний контрольных образцов и готовы к парного сравнения.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 4 показана представитель разделе получены от резки образца изображен на рисунке 3. Раздел был вырезан в 5 мкм толщиной и окрашивали H & E в соответствии с методиками, описанными выше. Валовая форма образца полосы сохраняется с минимальной разнице ткани артефактов (рис. 4а). Оба красителя маркировки были видны на склеру, хотя зеленого красителя была более устойчивой, чем красный (фиг.4В). Слоях сетчатки не artifactually отсоединяется, и морфологию сетчатки сохраняется (рис. 4в). Ткань сетчатки, прилегающей к красителем маркировку, которая соответствует расположению электродов в матрице, могут быть легко идентифицированы.

5 показан специальный представитель и иммуногистохимического окрашивания срезов тканей получали в соответствии с текущим протоколом. См. Рисунок 5 captioN и вспомогательных материалов для более подробно на конкретных пятна и модификаций, произведенных с их использованием. После модификации, эти пятна и иммуногистохимии были эквивалентны установленными стандартами - и это будет проверено патологоанатомами.

Тип первичного антитела и титр (в скобках) GFAP (1:1500) NF200 (1:100) GS (1:100)
Тип вторичные антитела и титр (в скобках) Alexa Fluor 594 Alexa Fluor 488 Alexa Fluor 488
Продолжительность инкубации вторичным антителом 1 час 2 часа 45 мин

Таблица 1. Тип антител, титр и продолжительность маркировки.

figure-results-1
Рисунок 1. SuprachoroIdal матрицы электродов Prototype. А) Макро фотография клинической класса формованных массива. B) микрофотография ручной доклинических массива.

figure-results-2
Рисунок 2. Бывший сетчатки гистологии. Стандартные гистологические методы были использованы для подготовки этих, H & E окрашенных, участки глаз имплантировали массив электродов супрахориоидальном.) Ортогональных разрез полости матрицы электродов (изображена звезда). Сетчатки отсоединяется от внешней ткани глаза. Это особенно очевидно под имплантированным региона (стрелка). Невозможно определить, какая часть сетчатки примыкает к каждому отдельному электроду массива. Масштабная линейка = 1 мм. B) с большим увеличением в штучной упаковке в области панели. Есть несколько, регулярно расположенных, артефакты в сетчатке ЛэРТС (стрелки), а также основные отрыва от тапетума слой (отражающего слоя в кошачий глаз). Масштабная линейка = 100 мкм. C) с большим увеличением в штучной упаковке региона на панели В. Стрелка указанных наружных сегментов фоторецепторов, а также пигментный эпителий, которые остаются нетронутыми, предполагая, что отделение было искусственной побочный эффект обработки, в отличие от быть вызваны в естественных условиях травмы или патологии. Масштабной линейки = 20 мкм.

figure-results-3
Рисунок 3. Локализация и рассечение электродов соседних тканей. Н.э.) Высокий динамический диапазон макро фотографии энуклеированными глазом, с супрахориоидальном массива электродов на месте.) Сообщение фиксируется фиксатором Дэвидсона, а до удаления массива, полупрозрачные склеры позволяет визуализироватьотдельные электроды в массиве (одного примера показано стрелкой). B) электроды выделены заранее определенный цвет красителя. C) краска маркировки на регулярных расстояниях от анатомических ориентиров используются для поддержания согласованности между экспериментами. D) После удаления Массив, глаз расчленена руку в образце полос. Цветные стрелки показывают два электрода соседних участков на склеру. Желтый пунктирная линия указывает плоскости срезов. E) Макро-фотографии полоска образца встроена в агар блока. F) Макро фотография агар-вставки полоски образца от панели Е, вырезаны и помещены в кассету вложение поддерживается губки биопсии свести к минимуму движение секции в процессе обработки.

figure-results-4
Рисунок 4. Новый сетчатки гистологии. Чонг> выше полоска образца (на рисунке 3D), содержащая электрод кармане, был парафин, срезы по 5 мкм и окрашивали H & E. A), зеленый и красный окрашенных областей (указано стрелками, так же как рисунок 3D) видны разрез на уровне желтого пунктирной линией на фиг 3D. Шкала бар = 1,000 мкм. Сетчатка не отсоединяется, ни под группой кармана, ни удаленно. B) коробку области от панели с видимым красным и зеленым красителем, указанном стрелками, и сохранности сетчатки во всем. Шкала бар = 500 мкм. C) коробку от региона Панель В, показывая нетронутыми, прилагается, сетчатки, прилегающих к зеленым красителем. Шкала бар = 50 мкм. Зная, что расположение краситель указывает положение электрода, можно с уверенностью оценить соседние ткани сетчатки на наличие повреждений, если таковые имеются, вызванной электрическим стимулированием.

ve_content "FO: держать-together.within-страницы =" всегда "> figure-results-5
Рисунок 5. Примеры изменение сетчатки cytohistochemistry помощью специальных пятен и иммунофлюоресценции. Использование фиксатора Дэвидсона, в отличие от стандартных методов фиксации формалином, требуются изменения в обычные протоколы окрашивания, как указано в основном тексте протокола. Патологоанатомов подтвердили, что эти модификации привели к эквивалентным окрашивания.) H &E; гематоксилином пятна клеточных ядер фиолетовый в то время как эозином пятна цитоплазме клеток, коллаген и поддерживающей ткани различных оттенков розового цвета. B) LFB пятна миелина синий цвет, а контрастирующая крезиловым фиолетовым может быть использован для . выявления ганглиозных клеток путем окрашивания Ниссля органов в рамках перикариона синий и подчеркнув спутниковой клетки, окружающие клетки C) Массона трехцветный сине; Biebrich алой кислоты фуксин решение пятна мышц Fiнов красный, в то время как анилин голубой окраски коллагена, в данном случае склеры, синий D) PAS;. гликопротеин компонентов базальной мембраны и компоненты соединительной ткани окрашивали фиолетовый, в то время как гематоксилином counterstains клеточных ядер фиолетовый E) Перлза берлинскую лазурь.; в месте кровотечения, образование гемосидерина из деградированных эритроцитов и выделение железа производит комплексы фиолетового цвета в то время как добавление нейтральных красное пятно красного цвета лизосом F) GS;. этого нейротрансмиттера фермент в клетках Мюллера 13 (зеленый ), можно видеть, проходящих в обоих направлениях с клеткой Мюллера органов во внутреннем ядерном слое и Мюллера клетки endfeet образующий внутреннюю ограничивающую мембрану G) NF-200;. этой тяжелой цепи белка цитоскелета (зеленый), найденные в сомы клеток и процессы , поперечные связи с другими нейрофиламенты для сохранения структуры нейронов 14,15. Ганглийклеток и их аксонов можно увидеть в слое ганглиозных клеток и слой нервных волокон, в то время как аксоны горизонтальных клеток, расположенных на внешней границы внутреннего ядерного слоя в кошачьих сетчатки, также выделены. Контрастного с DAPI (синий) позволяет визуализировать слои сетчатки H) GFAP;. Эта белка цитоскелета (красный) распространение в клетках Мюллера и астроцитов в течение глиозом 16, можно видеть, выстилающих слой нервных волокон с клетками Мюллера формирования тонких расширений через внутреннюю чтобы внешние слои сетчатки. Контрастного с DAPI (синий) позволяет выводить слоев сетчатки. Шкала бар = 50 мкм на всех панелях. Внутренний сетчатки показано в верхней части каждого изображения; внешней сетчатки показано в нижней части каждого изображения, за исключением Панель Е, которое показывает subscleral реакции.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оценке безопасности имплантата первоочередное внимание для проведения доклинических исследований. Перед протез сетчатки могут быть имплантированы в организме человека очень важно убедиться, что это не вызовет никакого вреда. Это требует оценки как биосовместимость имплантата 17-23, а также любой потенциальный ущерб, который может быть вызвано хроническим электрической стимуляции 24-26. Опыт работы с подобными нейронных протезов, такие как кохлеарный имплантат, дает представление о широком диапазоне стимуляции, и физических, параметров, которые не вызывают повреждение тканей 27. Тем не менее, сетчатка имеет различные характеристики на других сайтах имплантации и поэтому точный пределы безопасности (например, максимальная плотность заряда) не может предположить из предыдущих исследований в других системах. Плотности заряда являются самыми высокими в активных центрах электрода и это соответствует, имеющие наибольший потенциал для повреждения. Поэтому способ локализации ткани в непосредственной близостив отдельных активных электродов значительно увеличит полезность этих исследований. Ткани, прилегающей к конкретным регионам имплантата также могут выделяться, для детального изучения. Этот целевой подход позволяет меньше разделов, которые будут проанализированы, сохраняя уверенность, что "наихудший сценарий" был рассмотрен.

Склеральное метода локализации красителя описанные здесь был тщательно протестирован с ручной формы и формованные силиконовые / массивы Pt электрода 28-30. Он был использован с тонкопленочными полиамид 7,31 массивов, а также тонкопленочных силиконовых / Pt массивов 32. Некоторые исследования протез сетчатки занятых "в форме пули" электродов с интрасклеральный имплантаций 33. В настоящем техники должно быть эффективным для оценки этого типа электрод массивов. Кошачьего глаза с тонкой склеры (толщина в заднем полюсе 90 - 200 мкм) позволило визуализации отдельных электродов в массиве. Тем не менее, даже если отдельные электродез не были видны, их позиции могут быть легко выведены использованием силиконового шаблона при контур массива можно увидеть (аналогичный используемому в шаге 2.6).

Краситель отображение ограничивает необходимость получения нерелевантные срезов тканей, как только участки с красителем настоящее получаются. Способность точно вывести положения электродов позволяет не только соответствующие гистопатологического анализа и большей статистической мощности, но имеет большое влияние на время и стоимость управления за счет сокращения количества слайдов и лезвия использоваться, а также расходы на оплату труда. Использование красителя, который является приверженцем и может выдержать обработки ткани в то время также видна в неокрашенных срезов тканей является важным первоначального рассмотрения. Знание расположения краситель и ориентацию ткани при вскрытии и во время встраивания помогает процесса резки. Это включает в правильной ориентации блока для достижения секцию, которая не косым срезом и дает полное representatiна ткани. Поэтому важно, что лицо, осуществляющее резки присутствует во время краситель приложений, рассечение и вложение.

Общий протокол является устойчивым к незначительному изменению, в частности, с фиксацией таймингов. Тем не менее, рассечение глаза и красителем маркировку шаги деликатных хирургических вмешательств, которые выигрывают от хорошей ловкости рук, чтобы избежать повреждения образца. В то время как фиксатор Дэвидсон оказался эффективным для снижения искусственной отряд сетчатки вблизи имплантата, это не мешает прямого механического повреждения во время вскрытия. Фиксатором Дэвидсона не было легко совместимы с некоторыми специальными гистологических и иммуногистохимических процедур. Поэтому существует необходимость изменить / оптимизировать эти шаги как описано выше. Дополнительные изменения в окрашивании раза и концентрации были сделаны до достижения оптимального результата достигнуто не было - для более подробной информации, обратитесь к дополнительным материалам.

Количественная оценка сетчаткигистологии остается проблематичным. Сетчатка неоднородных и оба толщины и изменение плотности клеток с увеличением расстояния от области Centralis 34,35. Таким образом, соседние ткани в имплантированный глаз не может быть использована для сравнения и контрольный глаз используется вместо этого. Попарно соответствующие каждой секции с контролем глаза дает нам более мощные статистические сравнения патологических изменений; эффективности и безопасности результатов с протезирования сетчатки лучше оценивать при сравнении парных глазах в теме 36. Особое внимание должно быть принято, чтобы минимизировать наклонного среза, как это может повлиять на количественной оценке.

Таким образом, способы, описанные выше, значительно улучшили гистопатологические анализа, который в свою очередь привело к более эффективному доклинических процесса. Результаты доклинических исследований с использованием этих методов непосредственно привело к клиническому испытанию, в котором 3 RP пациентов были благополучно имплантировали suprachoroiДал сетчатки протезов. Эти методы являются актуальными как для сетчатки стимуляторов и других глазных имплантатов, где патологический ответ на долгосрочные имплантация должна быть оценена. С помощью этого метода стоит преимуществ для поддержания цитоархитектонике и регистрация патологии регионах, представляющих интерес на имплантат. Хотя это специально не проверены, модификации этих процедур может быть использован в других видах и других анатомических местах, особенно там, где массив имплантируется поверхностно.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность: г-жа Alexia Сондерс и г-жа Мишель McPhedran для экспериментальных помощи; г-жа Хелен Фэн для изготовления электродов, д-р Пенни Аллен и доктор Джонатан Йео для хирургической помощи; штаба Королевский Викторианский глаз и ушей больницы Биологические Научно-исследовательский центр по уходу за животными; Профессор Роб овчарки для создания общего представления по всему, и д-р Бриони Nayagam и г-н Рональд Люн за критические замечания по проекту форме рукописи.

Эта работа была выполнена в Институте бионики и больницы Св. Винсента, Мельбурн. Финансирование было предоставлено Яна Поттера, Фонд Джона Рида T Благотворительные фонды, и Австралийского совета исследований через своего Специального научно-исследовательской инициативы в Bionic науке и технике Видение грант Bionic видения Австралии (BVA). Бионика института благодарит за поддержку он получает от правительства штата Виктория в рамках своей оперативной программы поддержки инфраструктуры.

Materials

Нестандартный раствор Подготовка для особых пятен

1% Aqueous Cresyl Violet Stock Solution

  • Cresyl violet 1 г
  • Вода дистиллированная 100 мл

Cresyl Violet Acetate Working Solution

  • 1% водный стоковый раствор кресила фиалки 9 мл
  • Дистиллированная вода 51 ml
  • 10% уксусная кислота 0,5 мл

Biebrich Scarlet-Acid-Fuchsin Solution

  • 1% Beihrich scarlet 90 мл
  • 1% кислота фуксин 10 мл
  • Ледяная уксусная кислота 1 мл

Раствор фосфомолибдно-фосфтунгстовой кислоты

  • Фосфомомолибдная кислота 2,5 г <ли>Фосфовольмовая кислота 2,5 г <ли>Дистиллированная вода 100 мл

Анилиновый синий раствор

  • Анилиновый синий 2,5 г <ли>Ледяная уксусная кислота 2 г <ли>Дистиллированная вода 100 мл

    Растворы для иммуногистохимии

    Wash Buffer Solution

    • 0.1% Triton X-100 в фосфатно-солевом буфере (PBS)

    Serum Block Solution

    • 10% нормальной козьей сыворотки/0,1% Triton X-100 в классе PBS

    SUPPLEMENTARY MATERIAL

    Luxol Fast Blue

    Целью выполнения окрашивания Luxol Fast Blue (LFB) было определение ганглиозных клеток в слое ганглиозных клеток с помощью противовеса из крезилового фиолетового. В то время как LFB окрашивает миелин, крезилово-фиолетовый краситель связывается с веществами Ниссля в нейронах, состоящих из грубого эндоплазматического ретикулума и рибосом. Многочисленные клетки сетчатки содержат вещество Ниссля, в том числе амакриновые клетки. Эти клетки обычно расположены во внутреннем пограничном слое внутреннего ядерного слоя, но смещенные амакриновые клетки могут быть обнаружены в слое ганглиозных клеток. Окрашивание веществом Ниссля помогает дифференцировать большие, сильно окрашенные ганглиозные клетки от более мелких смещенных амакриновых клеток. Чтобы облегчить визуализацию этих клеток, мы модифицировали протокол рабочего раствора крезил-фиалки, увеличив объем стокового раствора крезил-фиалки в рабочем растворе. Мы увеличивали объем с шагом 1,0 мл с 6,0 мл до 9,0 мл, в свою очередь уменьшая объем дистиллированной воды. Оценивая легкость визуализации и идентификации ганглиозных клеток, оптимальное окрашивание было достигнуто с помощью 9 мл дополнительного раствора кресилфиолетового стока и 51 мл дистиллированной воды. Крезиловый фиолетовый является основным красителем, хотя для окрашивания вещества Ниссля его требуется использовать в кислом растворе, и поэтому объем уксусной кислоты остался неизменным на уровне 0,5 мл.

    Periodic Acid Schiff

    Окрашивание периодической кислотой Schiff (PAS) было выполнено для выделения Полисахариды, особенно гликоген, обнаруженные в базальных мембранах и клеточных стенках грибов, указывают на грибковую инфекцию. Процесс окрашивания PAS заключается в окислении гидроксильных групп в полисахаридах с помощью периодической кислоты с образованием альдегидных групп. Применение реагента Шиффа связывается с альдегидными группами, придавая им пурпурный цвет, а гематоксилин контрокрашивает, образуя ядра фиолетовых клеток. Наши слайды показали слабое окрашивание на внутренней пограничной мембране. Это может быть связано с присутствующими полисахаридами, так как не все полисахариды могут быть окислены в стандартных временных рамках, особенно те, которые содержат анионные полисахариды. Поэтому мы увеличили продолжительность стадии окисления с 10 минут до 12, 15 и 20 минут. Мы обнаружили, что 15-минутная стадия окисления была наиболее эффективной при окрашивании PAS.

    Masson' s Trichrome Blue

    Принцип окрашивания трихромного синего цвета Массона заключается в окрашивании коллагена и мышц, что в наших предметных стеклах сетчатки может быть использовано для указания на увеличение коллагеновой ткани, что может указывать на фиброз из-за травмы. Это окрашивание чувствительно к техникам фиксации, поэтому для получения оптимального окрашивания потребовались изменения. Процесс этого окрашивания заключается в первоначальном окрашивании цитоплазмы и мышечных волокон в красный цвет с помощью кислотного красителя Бибриха с алой кислотой фуксина. Дифференцировка с фосфомолибдной/фосфовольфрамовой кислотой конкурирует с красным красителем в коллагеновых волокнах. В склере крупные молекулы фосфомолибдной/фосфовольфрамовой кислоты способны проникать через рыхлую соединительную ткань, в отличие от плотных мышечных волокон, которые проникают только в мелкие молекулы. Затем наносится анилиновый синий краситель для замены кислоты в коллагеновых волокнах, образуя склеры, окрашенные в синий цвет. Чтобы оптимизировать это окрашивание на срезах сетчатки, продолжительность окрашивания красителем Бибриха на основе скарлатиновой кислоты фуксина была уменьшена, чтобы создать баланс между синим и красным красителем. Использование фиксатора Дэвидсона также потребовало увеличенного времени дифференцировки для удаления красного красителя из коллагена. Мы опробовали дифференцировку через 5, 6, 8 и 10 минут, с оптимальными результатами через 6 минут. Дифференцировка также варьируется в зависимости от толщины и разреза гладких участков, при этом может потребоваться дифференцировка более чем за 6 минут.

    Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody

    Поликлональный, хозяин - кролик, имеет молекулярную массу 50 кДа. Антиген GFAP представляет собой промежуточный филамент, обнаруженный в цитоплазме (цитоплазма астроцитов и Mü Антиген состоит из 428 аминокислот и имеет молекулярную массу 49512 Da.

    Neurofilament-200 antibody

    Моноклональный, хозяин вид - мышь, клон N52, изотип IgG1, он распознает фосфорилированные и нефосфорилированные формы тяжелых нейрофиламентов, которые имеют молекулярную массу 200 кДа. Антитело будет связываться с эпитопом в хвостовом домене нейрофиламента. Антитело окрашивает нейрофиламенты в перикариях нейронов, дендритах и аксонах.

    Glutamine Synthetase (GS) антитело

    Моноклональный, клон GS-6, вид хозяина - мышь, имеет молекулярную массу 45 кДа и изотип антитела IgG2a. Антиген GS обнаруживается в цитоплазме клетки (цитоплазма Mü Антиген содержит 373 аминокислоты и молекулярную массу 42 064 Да.

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Система маркировкиDavidson Bradley Products1163-4 - красная 1163-5 - синяя 1163-2 - желтая 1163-1- зеленая 
Кролик поликлональный антиглиальный фибриллярный кислый белок антителоMilliporeAB58041:1500, ночная инкубация
Мышиный моноклональный антиглутаминсинтетазный антителоMilliporeMAB3021:100 ночная инкубация
Моноклональный мышиный антинейрофиламент 200 антителоSigma-AldrichN01421:100 ночная инкубация
4',6-диаминдино-2-фенилиндол, дилактат (дилактат)Life TechnologiesD35711:25,000 30 мин инкубация
Alexa Fluor 488 козий антимышиный IgGLife TechnologiesA110291:500
Superfrost 90° желтыйGrale ScientificSF41299 
Предметные стекла для микроскопа FLEX IHCDAKOK802021-2 
Alexa Fluor 594 козья антикроличья IgGLife TechnologiesA110371:500
Обычная козья сывороткаLife TechnologiesPCN500010% сыворотка/0,1% Triton X-100/PBS
<td colspan="4">

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Santos, A., Humayun, M. S., et al. Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa. Arch. Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).
  2. Humayun, M. S., Weiland, J. D., et al. Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis. Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).
  3. Roessler, G., Laube, T., et al. Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).
  4. Chow, A. Y., Chow, V. Y., et al. The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa. Arch. Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).
  5. Zrenner, E., Bartz-Schmidt, K. U., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. Proc. R. Soc. B. 278, 1489-1497 (2011).
  6. Fujikado, T., Kamei, M., et al. Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 4726-4733 (2011).
  7. Villalobos, J., Allen, P. J., et al. Development of a surgical approach for a wide-view suprachoroidal retinal prosthesis: evaluation of implantation trauma. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 250, 399-407 (2012).
  8. Latendresse, J. R., Warbittion, A. R., Jonassen, H., Creasy, D. M. Fixation of testes and eyes using a modified Davidson's fluid: comparison with Bouin's fluid and conventional Davidson's fluid. Toxicol. Pathol. 30, 524-533 (2002).
  9. Agrawal, R. N., He, S., et al. In vivo models of proliferative vitreoretinopathy. Nat. Protoc. 2, 67-77 (2007).
  10. Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 233, 366-370 (1995).
  11. Bancroft, J. D., Gamble, M. Theory and practice of histological techniques. , 6, Churchill Livingstone. (2008).
  12. Horobin, R. W., Bancroft, J. D. Troubleshooting histology stains. , Churchill Livingstone. (1998).
  13. Pow, D. V., Robinson, S. R. Glutamante in some retinal neurons is derived solely from glia. Neuroscience. 60, 355-366 (1994).
  14. Lewis, S. E., Nixon, R. A. Multiple phosphorylated variants of the high molecular mass subunit of neurofilaments in axons of retinal cell neurons: characterization and evidence for their differential association with stationary and moving neurofilaments. J. Cell Biol. 107, 2689-2701 (1988).
  15. Ruiz-Ederra, J., García, M., Hicks, D., Vecino, E. Comparative study of the three neurofilament subunits within pig and human retinal ganglion cells. Mol. Vis. 10, 83-92 (2004).
  16. Bringmann, A., Pannicke, T., et al. Müller cells in the healthy and diseased retina. Prog. Retin. Eye Res. 25, 397-424 (2006).
  17. Seo, J. M., Kim, S. J., et al. Biocompatibility of polyimide microelectrode array for retinal stimulation. Mater. Sci. Eng. C. 24, 185-189 (2004).
  18. Gerding, H., Benner, F. P., Taneri, S. Experimental implantation of epiretinal retina implants (EPI-RET) with an IOL-type receiver unit. J. Neural Eng. 4, S38-S49 (2007).
  19. Majji, A. B., Humayun, M. S., et al. Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 2073-2081 (1999).
  20. Walter, P., Szurman, P., et al. Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits. Retina. 19, 546-552 (1999).
  21. Pardue, M. T., Stubbs, E. B. Jr, et al. Immunohistochemical studies of the retina following long-term implantation with subretinal microphotodiode arrays. Exp. Eye Res. 73, 333-343 (2001).
  22. Gekeler, F., Szurman, P., et al. Compound subretinal prostheses with extra-ocular parts designed for human trials: successful long-term implantation in pigs. Graefes. Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 245, 230-241 (2007).
  23. Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. III Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).
  24. Montezuma, S. R., Loewenstein, J. I., Scholz, C., Rizzo, J. F. III Biocompatibility of materials implanted into the subretinal space of Yucatan minipigs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 47, 3514-3522 (2006).
  25. Ray, A., Colodetti, L., et al. Immunocytochemical analysis of retinal neurons under electrical stimulation. Brain Res. 1255, 89-97 (2009).
  26. Nakauchi, K., Fujikado, T., et al. Threshold suprachoroidal-transretinal stimulation current resulting in retinal damage in rabbits. J. Neural. Eng. 4, S50-S57 (2007).
  27. Shepherd, R. K., Murray, M. T., Houghton, M. E., Clark, G. M. Scanning electron microscopy of chronically stimulated platinum intracochlear electrodes. Biomaterials. 6, 237-242 (1985).
  28. Villalobos Villa, J. Safety of a Wide-Field Suprachoroidal Retinal Prosthesis. , The University of Melbourne. (2012).
  29. Nayagam, D. A. X., Allen, P. J., et al. A Pre-Clinical Model for Chronic Electrical Stimulation of the Retina via Suprachoroidal Electrodes. Association for Research in Vision and Ophthalmology Annual Meeting, Fort Lauderdale, Florida, USA, , (2012).
  30. Nayagam, D. A. X., Villalobos, J., et al. A Suprachoroidal Retinal Prosthesis is Safe in a Chronic Implantation Model. in Vision and Ophthalmology Annual Meeting., Vol. 4928/A327. Association for Research in Vision and Ophthalmology Annual Meeting, Fort Lauderdale, Florida, USA, , (2011).
  31. Cicione, R., Shivdasani, M. N., et al. Visual cortex responses to suprachoroidal electrical stimulation of the retina: effects of electrode return configuration. J. Neural Eng. 9, 036009(2012).
  32. Schuettler, M., Stiess, S., King, B. V., Suaning, G. J. Fabrication of implantable microelectrode arrays by laser cutting of silicone rubber and platinum foil. J. Neural Eng. 2, S121-S128 (2005).
  33. Morimoto, T., Kamei, M., et al. Chronic implantation of newly developed suprachoroidal-transretinal stimulation prosthesis in dogs. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52, 6785-6792 (2011).
  34. Bron, A. J., Tripathi, R. C., Tripathi, B. J. Wolff's anatomy of the eye and orbit. , Arnold. (2001).
  35. Stein, J. J., Johnson, S. A., Berson, D. M. Distribution and coverage of beta cells in the cat retina. J. Comp. Neurol. 372, 597-617 (1996).
  36. Dagnelie, G. Psychophysical evaluation for visual prosthesis. Annu. Rev. Biomed Eng. 10, 339-368 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal ProsthesisHistopathological AnalysisTissue Dye MarkingEye Fixation TechniqueAgar StabilizationParaffin EmbeddingBrightfield MicroscopyImmunofluorescence MicroscopySclera TranslucencyMatched Control

Related Articles