Методическая статья

Иммуногистохимического анализа в нервной системе крыс центральной и периферической ткани лимфатического узла Разделы

DOI:

10.3791/50425

⸱

14 ноября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Neuroscience, Neuroimmunology Unit, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet, 2Department of Neuroimmunology, Center for Brain Research, Medical University of Vienna, 3Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Vascular Biology Unit, Karolinska Institutet

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем оптимизированный, подробный протокол двойного иммуноокрашивания в фиксированных формалином, залитых парафином срезах ткани центральной нервной системы (ЦНС) крыс и периферических лимфатических узлов (ЦНС).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммуногистохимия (IHC) обеспечивает высокую точность, надежную и привлекательную визуализацию белка. Правильное исполнение и интерпретация ВВК на основе многоцветного мечения является сложной задачей, особенно когда используется для оценки взаимосвязи между целевых белков в ткани с высоким содержанием жира, например, центральной нервной системы (ЦНС).

Наш протокол представляет собой уточнение стандартной методики иммунноокрашивания особенно скорректированной для выявления структурных и растворимых белков у крыс ЦНС и периферических лимфатических узлов (LN), пострадавших от нейровоспаления. Тем не менее, с или без дополнительных модификаций, наш протокол, вероятно, может быть использован для обнаружения других связанных с ними белковых мишеней, даже в других органах и видов, чем здесь представлены.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на использование передовых с высокой пропускной способностью анализа, выполненного на methylome, транскриптома или даже протеома уровне, иммунное остается золотым стандартом для обнаружения белка непосредственно в образце ткани, культуры клеток или клеток мазка. Раскрывая картину локализации / распределения, иммуногистохимии (IHC) может оценить относительные соотношения и топографические взаимосвязи белков-мишеней, и даже указывают на их биологическую активность. Поэтому IHC широко используется для клинических и исследовательских целях, например, для диагностики, оценки лечения, изучение механизмов развития заболеваний, функциональных и фенотипических изменений в моделях на животных и т.д.

По существу , содержащий гистологии, патологии, биохимии и иммунологии, IHC значительно продвинулась с 1941 года, когда флуоресцентно меченые антитела были использованы впервые для определения пневмококковых антигенов в инфицированной ткани 1. Visualization клеточных продуктов и компонентов по IHC основан на связывании антител (абс) до их специфического антигена (Ag). Помимо использования флуорофора помечены антитела, иммунные реакции также могут быть визуализированы с помощью ферментов , как пероксидаза 2,3 или щелочной фосфатазы 4. Кроме того, коллоидного золота меченные антитела 5 используются для выявления специфических взаимодействия антиген-антител при помощи световой и электронной микроскопии, в то время как радиоактивные метки визуализировали с помощью авторадиографии.

Иммунореакция Ag-Ab могут быть обнаружены с помощью прямых и косвенных методов. Прямой метод, по существу , быстрее и проще, так как он использует непосредственно помечены первичной Abs 6. Тем не менее, из-за значительной потери чувствительности, косвенные методы являются предпочтительными для прямых. Двухшаговые косвенные процедуры обнаружения требуют немеченого первичного Abs, как и первый, и меченого вторичного Abs , направленные против первичного Abs, в качестве второго слоя 7.Усиление сигнала может быть достигнуто путем вовлечения в дальнейшем, с ферментом в сочетании третичный Ab (трехступенчатый косвенный метод), который связывается с вторичным Ab. Обычно используемые методы обнаружения косвенными являются авидин-биотин и пероксидазу-antiperoxidase (PAP). В качестве альтернативы, щелочной фосфатазы-antialkaline фосфатазы (APAAP) комплекс может быть использован вместо метода РАР. Следует отметить, что щелочной фосфатазы (AP) методы , как представляется, еще более чувствительны , чем методы иммунопероксидазных 4. комплексный метод авидинбиотиновом (АВС) использует биотинилированные вторичные Ab в комбинации либо с меченным авидинбиотиновом комплекса (LAB), или меченый стрептавидин-биотин комплекса (ПЛИТА). Чувствительность обнаружения может быть дополнительно увеличена за счет привлечения авидин , меченный пероксидазой или щелочной фосфатазы 8. Другие методы обнаружения в использовании полимерные маркировки, тирамин усиление и иммуно-катящегося кольца 9. Следует отметить, что различные методы обнаружения могут быть объединены для многократного обнаружения Ag в той же ткани,образец, о котором сообщалось в первый раз в 1978 году 4. Одновременный двойной иммунным окрашиванием , представленной здесь проводили в фиксированных формалином, парафин крысиных срезах тканей ЦНС и LN с использованием пероксидазы переплете и АР-конъюгированные вторичные антитела, соответственно. Сигналы визуализировали с использованием 3,3'-diaminobencidine (DAB) хромоген и быстрый синий (FB) APAAP комплекс, соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этическое Заявление
Данное исследование проводится в соответствии с рекомендациями Национального совета Швеции лабораторных животных и Директивы Европейского Сообщества Совета (86/609 / EEC) в соответствии с этическими разрешений N338 / 09, N15 / 10 и N65 / 10, в котором были утверждены Комитет Северной Стокгольм животных по этике.

1. Подготовка ткани

  1. Перфузия & крепление
    1. Обезболить животное с изофлуран для выполнения transcardial перфузии через левый желудочек. Инициирование промывку сосудистую фосфатно-солевым буфером (PBS) для удаления компонентов крови, а затем 4% параформальдегидом в 0,1 М PBS (PFA).
    2. Сосредоточение расчлененный мозги, спинной мозг и периферические ткани LN, погружая в PFA. Через 24 ч при температуре 4 ° С, не передавать ткани, из PFA в PBS и хранят при температуре 4 ° С до дальнейшей обработки. В качестве альтернативы коммерческим PBS, растворить 9 г NaCl в 250 мл S &# 246; Rensen буфер и добавьте 750 мл деионизированной воды (дН 2 O); подготовить 0,2 М Соренсен буфера (рН 7,4) растворять 13,8 г NaH 2 PO 4 х 1H 2 O и 71,2 г Na 2 HPO 4 х 2H 2 O в 2,5 л дН 2 O.
  2. Обезвоживание и вложения
    1. Отрежьте ткани в приблизительно 5 мм толщиной порциями с помощью лезвия бритвы.
    2. Инициировать ткани упрочнения процесса (обезвоживание) с использованием ткани-Tek VIP Вакуумная инфильтрация процессор (стандартная процедура , основанная на погружения в воду в концентрации восходящих этанола с последующим ксилолом и , наконец , парафин (таблица 1).
    3. Поместите ткань в форму и залить в жидкий парафин вокруг образца, чтобы сформировать "парафиновый блок". Длительное хранение требует комнатной температуры (RT). Тем не менее, до секционирования, рекомендуется , чтобы охладить блоки, например, в течение ночи (O / N) при температуре 4 ° С.

2. Секционирование

  1. Поместите блок парафина в основной держатель санно микротома, который может перемещаться назад и вперед через нож. Отрегулировать оптимальный угол между блоком и микротома нож (который зависит от геометрии ножа, но и от скорости резки и техники).
  2. Вырезать 3 - 5 мкм поперечные сечения из парафинового блока.
  3. Передача просто вырезать секцию в контейнер воды и смонтировать его затем из воды на предметное стекло.
  4. Осторожно нажмите на установленную секцию против бумажное полотенце, чтобы удалить остатки воды и возможные пузырьки воздуха. Коммерчески предварительно покрытые клейкие стеклянные слайды рекомендуется.
  5. Сухой слайды в течение нескольких часов в печи на 50 - 60 ° C.

3. Депарафинирование (Регидратация & Блокирование эндогенной пероксидазы)

  1. Погрузите слайды 2x в ксилоле (в альтернативном варианте ксилол заменительXEM-200), каждый раз, когда 15 - 20 '.
  2. Полоскание в 99% этаноле.
  3. Для того, чтобы блокировать эндогенную активность пероксидазы, инкубировать секций в течение 30 мин в метаноле растворе, содержащем 0,25% перекиси водорода.
  4. Продолжить регидратации с использованием этанола с увеличением содержания воды (99%, 70%, в конечном итоге в дистиллированной воде.
  5. С этого момента и до монтажа на покровных стеклах секции должны быть сохранены сырыми.

4. Антиген Retrieval

  1. Используйте пароварку для кипячения слайдов в растворе поиска взаимосвязанного антигена (в данном случае ЭДТА , рН 8,5 буфер) в течение 60 '(ЭДТА буфер исходный раствор содержит 1,21 г Трис и 0,37 г ЭДТА , растворенного в 50 мл дН 2 O, для приготовления рабочего разбавленный раствор 2,5 мл ЭДТА раствор в 47,5 мл дН 2 O).
  2. Охладить слайды на комнатной температуре в течение прибл. 1 ч, а затем промыть 3 - 5x с Трис-солевом буферном растворе (TBS, используют в качестве альтернативы PBS), состоящий из 0,05 М Трис и 0,15 М NaCl; рН 7,5 доводили Wiй HCl. В качестве альтернативы использовать коммерческую TBS.

5. Блокирование неспецифических сайтов связывания

  1. Для того, чтобы избежать неспецифические фоновые реакции, инкубировать разделы по комнатной температуре в течение 30 мин в блокирующем растворе, содержащем 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) и 90% буфера DAKO.

6. Дважды иммунноокрашивания: Одновременная Инкубация с первичными Абс

  1. Развести необходимое количество первичных антител в блокирующем растворе и инкубировать O / N при температуре 4 ° С. Для получения двойного иммуноокрашиванием объединить альфа-эотаксина (Ccl11; 1: 300) с альфа-CD68 (Ed1; 1: 1000) или α-Iba1 (Aif1, 1: 1000) или α-Cd8α (Ox-8; 1: 200) ,
  2. Ополосните слайдов 3-5x с буфером TBS (использовать в качестве альтернативы 10x разбавленный буфер DAKO).
  3. Развести необходимое количество вторичных антител (биотинилированных анти-коза и AP-сопряженную анти-мышь, как 1: 200) в блокирующем растворе и инкубировать 1 час на RT.
  4. Промыть слайды 3 - 5x с буфером TBS (насе альтернативно 10x разводили DAKO буфера).
  5. Инкубируйте слайды с авидин-пероксидаза хрена (HRP комплекса), разведенного в блокирующем растворе в течение 1 часа по РТ.
  6. Промыть слайды 3 - 5 раз с TBS буфером (использовать в качестве альтернативы 10x разбавленный буфер DAKO).

7. Визуализация

  1. Визуализация связанного AP-меченным вторичным антителом
    1. Готовят 0,1 М Трис-HCl, растворяя 12,1 г трис - в 1 л дН 2 O и доведения рН до с помощью HCl. Используйте один и тот же буфер Tris-HCl, чтобы приготовить 1М раствор левамизол. Подготовьте свежемолотый 4% раствор NaNO 2 в дН 2 O.
    2. Для того, чтобы получить 50 мл Быстрого голубой (FB) субстрат (объем, необходимый для одной стандартной стеклянной кювете) растворяет 6,25 мг нафтол-AS-MX-фосфатдегидрогеназы в 312,5 мкл ДМФА в стеклянной трубке и размешать в 50 мл подогретого (37 ° C), буфер Трис-HCl. Растворить 12,5 мг FB RR соли в 312,5 мкл 2 н HCl добавляют 312.5 мкл ранее Подготовительномкрасный 4% раствор NaNO 2 , и перемешивали смесь в те же 50 мл подогретого буфера трис-HCl. Слегка встряхните, пока желтая жидкость не станет ясно, и, наконец, добавить 77 мкл предварительно приготовленного раствора 1 М левамизол. Фильтрата полученную смесь и вылить на предметные стекла помещают в стеклянную кювету.
    3. Инициировать инкубации при 37 ° С и контролируют процесс развивается под световым микроскопом, прибл. через каждые 15 - 30 мин. Поворачивая нечеткое, замените FB раствора свежей смеси.
    4. Промыть слайды 3 - 5x с TBS буфером и передачи затем в буфере PBS.
  2. Визуализация связанного биотинилированного вторичного антитела
    1. Приготовьте DAB / H 2 O 2 проявляющий раствор путем разбавления 1 мл маточного раствора DAB (25 мг DAB в 1 мл PBS) в 49 мл PBS. Добавить 16,5 мкл H 2 O 2 и фильтрат перед заливкой на секции.
    2. Преобразование хромогена DAB в лоб осаждающейсяп пигмент может быть немедленным. Контроль процесса разработки под световым микроскопом (даже пару секунд дольше инкубации может вызвать высокий фон и замаскировать специфический сигнал).
    3. Интенсивность осадка коричневого пигмента может быть альтернативно повышена путем инкубации в растворе, состоящем из 2% сульфата меди и 0,9% NaCl в течение 5 '.
    4. Промыть слайды 3 - 5 раз с PBS и , наконец , с дН 2 O, используют в качестве альтернативы водопроводной воды.
    5. Установите слайды с крышкой скользит непосредственно из воды с помощью водной GelTol монтажной среды. Избегайте создания пузырьков воздуха.
    6. Разрешить полного высыхания монтажной среды, например, о / п при 4 ° С. Хранить сушеные слайды на RT.
1. % Спирт этиловый 20 ' 40 ° C
2. % Спирт этиловый 60 &# 39; 40 ° C
3. % Спирт этиловый 90 ' 40 ° C
4. % Спирт этиловый 60 ' 40 ° C
5. % Спирт этиловый 90 ' 40 ° C
6. % Спирт этиловый 60 ' 40 ° C
7. % Спирт этиловый 90 ' 40 ° C
8. % Спирт этиловый 120 ' 40 ° C
9. Ксилол 30 ' 40 ° C
10. Ксилол 60 ' 40 ° C
11. парафиновый 60 ' 60 ° C
12. парафиновый 60 ' 60 ° C
13. парафиновый 60 ' 60 ° C
14. парафиновый 120 ' 60 ° C

Таблица 1. Обработка тканей Tissue-Tek VIP вакуумной пропитки процессор.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Двойные immunostainings (со-окрашивании) были выполнены в фиксированных формалином, парафин крысиных ЦНС и LN секции. 3-5 мкм срезы толщиной ткани были вырезаны с помощью саней микротома, установленный впоследствии на предварительно покрытых стеклах клеевых и обрабатывают , как описано ранее 10,11,12. Если коротко, то после того, как deparaffinizing, регидратации ткани и эндогенной пероксидазы инактивацией срезы подвергали процессе извлечения антигена, с последующей стадией бл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стандартные процедуры IHC часто требуют определенных корректировок для получения оптимального результата, который обычно подразумевает обширный опыт, но и "проб и ошибок" подход. От подготовки ткани до целевой визуализации, почти каждый шаг в протоколе не может быть подвергнут индивидуально разработаны модификации для того, чтобы улучшить конечный результат. Протокол Двойное окрашивание, представленные здесь служит примером IHC на основе белка таргетирования особенно скорректирована для оценки взаимосвязи межд...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Ганса Лассмана и Яна Бауэра за их руководство и поддержку. Мы также благодарим Каталин Бенедек за отличную техническую помощь и Кэролайн Вестерлунд за критическую и лингвистическую оценку.

Это исследование было поддержано грантами Biogen Idec, Фонда Веннера-Грена, Шведского исследовательского совета, Шведской ассоциации людей с неврологическими нарушениями, Шведского фонда мозга, EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) и Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Реагент
Изофлуран (Изофлуран): 1-Хлор-2,2,2-трифторэтил (дифторметиловый эфир) 2-Хлор-2-(дифторметокси)-1,1,1-трифлуоретан (C<суб>3H<суб>2ClF<суб>5O)Бакстер1001936060Облучение глаз. Вероятно, влияет на фертильность и повреждает матку ребенка. Применять только в надлежащим образом оборудованных обезболивающих условиях.
Хлорид натрия (NaCl)Merck1.0604
Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS), таблеткаSigma-AldrichP4417
Параформальдегид (OH(CH2O)nH (n = 8 - 100)), 4% в 1x PBSApl pharma34 24 28Опасность для здоровья. Разъедающий. Легковоспламеняющиеся. Острая токсичность.
Этанол ≥ 99,5%, абсолютный (CH3CH2OH)Sigma-Aldrich459844-1Lлегковоспламеняющийся.
Ксилол (ксилолы, гистологическая степень; C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich534056Flamable. Острая токсичность.
Histo-Comp Парафиновый воскТкань-TekV0-5-1001
Адгезивный микроскоп СлайдыStarfrostMIC-1040-W
Заменитель ксилола XEM-200 Vogel GmbHND-HS-200Респираторная сенсибилизация. Канцерогенность.
α-CD8 (Ox-8) мышиный против крыс, первичное антителоAbD SerotecMCA48G
α-Iba1 (AIF1) мышиное против крыс, первичное антителоMilliporeMABN92
α-CD68 (ED1) мышиное против крысы, первичное антителоAbD SerotecMCA341R
α-эотаксин C-19 (CCL11) козье против крыс, первичное антителоSanta Cruz BTSC-6181
Щелочная фосфатаза (АФ)-конъюгированное вторичное антителоDakopatts, ДанияD0314
Биотинилированное вторичное антителоAmersham BiotechRPN1025
комплекс авидин-пероксидаза хрена (HRP) Sigma-AldrichA3151
Нафтол AS-MX фосфат (C19H18NO5P)Sigma-AldrichN4875-1GОстрая токсичность.
Быстрая синяя соль RR, азойский диазо No 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2)Sigma-AldrichFBS25
Левамизола гидрохлорид (C11H13ClN2S)Sigma-Aldrich31742Острая токсичность.
3,3'-диаминобензидина тетрагидрохлорид (DAB хромоген)DAKOS3000Легковоспламеняющийся. Токсичный.
Сульфат меди (CuSO4)Merck1.02791Острая токсичность. Экологический газзард.
ГельТол Водная монтажная средаThermo Electron Corporation230100
Перекись водорода, 30% (H2O2)Merck107210Острая токсичность.
Метанол (CH3OH)Fluka65543Острая токсичность. Респираторная сенсибилизация. Канцерогенность. Огнеопасный.
Трис (гидроксиметил)аминометан, основание ТРИС (C4H11NO3 )AppliChemA1379Раздражение кожи и глаз.
Трис Буферизованный Физраствор (TBS), таблеткаSigma-AldrichT5030
Ди- Натрия гидрофосфат дигидрат (Na2HPO4 x 2H2O)Merck1.0658
Моногидрат дигидрофосфата натрия (2PO4 x 1H2O) Merck1.06346
Фетальная сыворотка теленка (FCS) Cambrex BioScienceDE-14-802F
DAKO цитационный промывочный буфер 10x DAKO S3006Следует хранить при температуре 2-8 °°; C для подавления роста бактерий. Не допускайте пенообразования.
N,N-диметилформамид; DMF (C3H7NO)Fluka40250Легковоспламеняющийся. Острая токсичность.
Покровные стекла 24 x 36 мм Menzel-Glä serBB024036A1
Соляная кислота, конс. (HCl)Sigma-Aldrich30721Коррозионный, раздражающий, проникающий. Сенсибилизатор легких (в виде кислотного тумана). Токсичный.
Раствор соляной кислоты объемный, 2 М HCl (2 N)Fluka71826Коррозионный, раздражающий, проникающий. Сенсибилизатор легких (в виде кислотного тумана). Токсичный.
Нитрит натрия, ReagentPlus, ≥ 99,0% (NaNO2)Окислитель Sigma-AldrichS2252. Токсичный. Опасен для окружающей среды.
Этиленединитрилотетрауксусная кислота дигидрат соли натрия (ЭДТА; C10H14N2Na2O8 x 2H2O)Merck1.08454Пероральное воздействие может вызвать последствия для репродуктивной системы и развития.
Оборудование
Tissue-TekV.I.P Вакуумный инфильтрационный процессорSakura5902 VIP Jr. 115 В, 60 Гц
Hacker-Bright 8000 Series База Сани Микротом Хакерские инструменты
Бытовая отпариватель для еды BraunMultiGourmet FS 20
Световой микроскоп Leica Polyvar 2

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
  2. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
  3. Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
  4. Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
  5. Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  6. Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
  7. Polak, J. M., Van Noorden, S. Introduction to immunocytochemistry. , Bios Scientific Publishers Ltd. Oxford, UK. (2003).
  8. Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
  9. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
  10. Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794(2012).
  11. Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
  12. Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
  13. Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
  14. Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
  15. Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
  16. Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
  17. Hayat, M. Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , Kluwer Academic. New York. (2002).
  18. Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
  19. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
  20. Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
  21. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
  22. Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
  23. Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
  24. Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
  25. Van der Loos, C. Immunoenzyme multiple staining methods. , Bios Scientifc publishers Ltd. New York. (1999).
  26. Elias, J. Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , ASCP Press. Chicago. (2003).
  27. Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
  28. Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
  29. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
  30. Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
  31. Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
  32. Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи