Методическая статья

Caenorhabditis Элеганс Модельной системы для исследования Amylopathy

DOI:

10.3791/50435

⸱

17 мая 2013 г.

 , 
1Department of Neuroscience and Cell Biology, Robert Wood Johnson Medical School, University of Medicine and Dentistry of New Jersey

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы опишем методы для изучения аспектов amylopathies в червя C. Элеганс. Мы покажем, как построить червей, экспрессирующих человеческий Ар 42 В нейронах и как проверить их функции в поведенческих тестах. Далее показано, как получить первичных нейронов культур, которые могут быть использованы для фармакологических испытаний.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amylopathy это термин, который характеризует ненормальное синтез и накопление бета-амилоида (Ар) в тканях со временем. Ар является отличительной чертой болезни Альцгеймера (БА) и находится в деменцию с тельцами Леви, миозит включения тела и церебральной амилоидной ангиопатии 1-4. Amylopathies постепенно развиваются с течением времени. По этой причине простые организмы с короткой продолжительностью жизни может помочь выяснить молекулярные аспекты этих условий. Здесь мы описываем экспериментальных протоколов для изучения Ар-опосредованной нейродегенерацию помощью червя Caenorhabditis Элеганс. Таким образом, мы построим трансгенных червей путем инъекции ДНК, кодирующей человеческий Ар 42 в синцитиальный гонад взрослых гермафродитов. Трансформированных линий стабилизируются индуцированного мутагенеза интеграции. Нематоды возраста синхронизированы путем сбора и посева их яйца. Функции нейронов выражения Ар 42 испытывается в подходящее поведенческого анализа (хемотаксисас). Первичных нейронов культур, полученных из эмбрионов, которые используются для дополнения и поведенческие данные для проверки нейропротекторное действие антиапоптотических соединений.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Амилоида бета (Ар) представляет собой пептид из 36-43 аминокислот, которая образуется после последовательного расщепления белка-предшественника амилоида (APP) по β и γ секретазы 1. Γ секретазы обрабатывает C-конца пептида и отвечает за его переменной длины 5. Наиболее распространенными формами являются Ар Ар Ар 40 и 42, причем последний чаще ассоциируется к патологическим состояниям, таким как рекламы 5. При высоких концентрациях Ар форме β-листов для агрегации с образованием амилоидных фибрилл 6. Фибриллы депозиты являются основным компонентом старческих бляшек окружающих нейронов. Оба бляшек и диффузии, не доска олигомеров Ар, как полагают, являются основными формами патогенных Ар.

Лаборатория исследования нейронной amylopathies осложняется тем фактом, что эти условия прогресса с течением времени. Поэтому важнымиT развиваться генетически послушный животных моделях, комплементарные к мышам-с коротким сроком службы. Эти модели могут быть использованы для выяснения конкретных аспектов обычно amylopathies-клеточном и молекулярном и в силу своей простоты, помогают уловить суть проблемы. Червь Caenorhabditis Элеганс водопада эту категорию. Он имеет короткий срок службы, ~ 20 дней, а в дополнение основных клеточных процессах, включая регуляцию экспрессии генов, белков торговли, нейронные связи, синаптогенезе, клеточной сигнализации и смерти подобны млекопитающих 7. Уникальные особенности червя включают в себя мощные генетика и отсутствие сосудистой системы, которая дает возможность изучить повреждения нейронов независимо от сосудистых повреждений. С другой стороны, отсутствие мозга ограничивает применение С. Элеганс к изучению многих аспектов нейродегенерацию. Кроме того, воспроизведение и идентификации анатомических распределения повреждений не может быть выполнена в этом организме. Другой пределобъема отнести сложность для оценки как различия в профили экспрессии генов и обесценения сложное поведение и функции памяти. Здесь мы опишем методы генерирования C. Элеганс моделей amylopathies.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Строительство трансгенные черви

  1. Трансформации.
    1. Приготовления инъекции колодки. Поместите каплю горячей, 2% агарозном растворяется в воде, на покровное стекло. Быстро разместить второй покровное на каплю и слегка коснитесь его. После того, как агароза затвердеет, покровные слайд друг от друга, и выпекать покровное площадкой в ​​вакуумной печи при 80 ° CO / N.
    2. Потяните пипеток. Мы используем Саттер Р-97 Съемник тянуть 1/0.5 мм OD / ID боросиликатного капилляров с нитью. Пипетки кованые с закрытыми наконечник, который взломан на более позднем этапе.
    3. Приготовления инъекции смеси. Сделать инъекции смеси, содержащей интерес ДНК (20 нг / мкл в конструкции) плюс пустой плазмидой ДНК в конечной концентрации 150 нг / мкл. Центрифуга инъекции смеси для удаления любых загрязнений. Этот шаг имеет решающее значение, потому что загрязнители уменьшить эффективность трансформации. Передача Топ 5 мкл (мусора и других загрязнений собираются в нижней части) в чистую пробирку биспользуется в электронной инъекции.
    4. Загрузите инъекции смеси капиллярным. В нижней части пипетки погружен в инъекции смеси. Обычно 0,5 мкл достаточно, чтобы придать 100 червей.
    5. Загрузите инъекционной пипетки. Вставьте пипетки на держателе микроманипулятора и разорвать его открытым, потерев его кончик к краю покровного стекла установлены на стекло или же от космического мусора на площадку агарозы. Это очень важный шаг, поскольку слишком велики повреждения Советы червя и слишком маленькие чаевые легко засориться. Качество сломанный наконечник можно судить по форме и самое главное по расходу. Скорость потока может быть оценена по размеру пузырьки, вытекающих из открытый конец погружен в капли масла хладон 700 в ответ на давление нагнетания.
    6. Передача червей инъекции площадку. Поместить каплю 700 Галокарбоновое масло на инъекции площадку и передать несколько (1 или 2 для начинающих) червей к маслу. Используйте червя выбрать не подтолкнуть червей вниз на площадку, покау придерживаться агарозы. Черви должны быть ориентированы в ряд с вентральной сторон смотрят в одном направлении. Старайтесь не прикасаться голова червя. Если после нескольких попыток черви не соблюдают колодки, замените ее свежей площадку или увеличить толщину агарозы и / или концентрации.
    7. Вставьте пипетки в червя. При движении ступени, позиционировать червя под пипеткой. Поместите пипетку в центральном ядре гонад, потому что его цитоплазма разделяется многими ядер половых клеток. Это увеличивает вероятность того, чтобы доставить вводили ДНК многим потомства. Пипетки должны лежать почти параллельно червя (~ 15 ° -25 °). Нажмите вертикально кончик пипетки вниз тело червя, пока кожа не нажата. Затем осторожно нажмите на манипуляторе, чтобы вызвать вставку наконечника. Для достижения наилучших результатов как инъекционные половых желез.
    8. Введите раствора ДНК. Надавите на пипетку до гонаду набухает. Остановить поток и вытащить червя от пипетки. Проверьте иглу для потока, а затем перейтик следующему червя и повторите шаги инъекции.
    9. Восстановление черви: Добавить каплю (~ 10 мкл) буфера восстановления на червей и инкубировать, пока черви не начнут плавать. Добавить равный объем M9, подождите, пока черви не возобновить плавание и повторить несколько раз, пока раствор не в основном M9. Индивидуально передать червей семенами пластин.
  2. Интеграции.
    1. Налейте 40 здоровых, сытых, L4 червей в свежем пластины
    2. Облучают γ-лучей с 4000 рад в течение 40 мин. Передача облученных червей (P0) в свежем, OP50 пластин семенами (4 червей / пластина). Черви альтернативно может быть облучен дозой 300 Дж / ​​м 2 координат.
    3. Трансфер F1 10-20 трансформантах из каждой чашки на отдельные пластины, маркировать пластин с соответствующей P0 происхождения.
    4. Выделить 2-4 F2 трансформантах для каждого F1 для отдельных пластин. Проверьте F3 потомства на 100% передачи преобразование маркера. Как правило, 1-3% потомства от облученных Виль червяУ меня интеграции события.
    5. Сделать запасы из трех или более независимых линий трансформантом.

2. Поведенческие Анализы

  1. Возраст-синхронизации.
    1. Расти червей в стандартных 10 см NGM пластин OP50 + E. палочки до большой популяции беременных взрослых достигается (3-5 дней).
    2. Соберите червей в 50 мл труб Сокол, приостановив их в 1 мл буфера M9.
    3. Добавить 5 мл M9 буфера и центрифуге при 450 мкг в течение 3 мин. Удалите супернатант. Повторите 3-4х.
    4. В конце последнего центрифугирования, удаления супернатанта и добавляют 10 объемов основной раствор гипохлорита (0,5 М NaOH, 1% гипохлорита свежеприготовленный) к гранулированным червей. Инкубируют при комнатной температуре в течение ~ 10 мин. Лизис Реакцию можно контролировать путем размещения капли реакции лизиса на покровное и изучение червей под микроскопом. Когда около 80% червей разбиты реакция должна быть остановлена.
    5. Остановить реакцию лизиса надстройкаг того же объема стерильного буфера яйца.
    6. Собирают яйца (и туши) центрифугированием при 450 х г в течение 5 мин.
    7. Мойте яйца с стерильном буфере яйцо 2-3х.
    8. Выдержите яйца O / N в M9 буфера и семя их на стандартные пластины NGM.
  2. Хемотаксиса.
    1. Подготовьте несколько частей агар 0.5x0.5x0.5 см примерно. Мы кладем на депозит агар, в 10-см пластины и режем кусками агар оттуда.
    2. Замачивание кусок агара в раствор, содержащий желаемую аттрактант (при насыщающих, почти насыщающей концентрации) в течение 2 часов. Типичные аттрактанты лизин (0,5 М), биотин (0,2 М).
    3. Депозит агар кусок в 10 см испытательной пластины, в которых расположение тест месте и контроль местная были отмечены (рис. 1А). Разрешить уравновешивания и формирование градиента O / N (фиг.1В). Подготовить 5 тарелок для одного эксперимента.
    4. До эксперимента добавить 10 мкл 20 мМ NaN 3 (Anesthetic) в каждом месте.
    5. Поместите 20 возрастных синхронизированы червей в центре пластины. Место пластины в инкубатор при 20 ° С.
    6. Через 1 ч рассчитывать животных на тест / контроль пятна и расчета индекса хемотаксиса, (CI) следующим образом: figure-protocol-1 где N, N испытаний и N Центр., указывают на общее количество животных, количество животных в тесте месте и количество животных в контрольной точке.

3. Первичных эмбриональных клеточных культур

  1. Lyse червей, как описано в возрастной синхронизации.
  2. Стоп лизис реакцию добавлением такого же объема стерильного буфера яйцо и центрифугируют при 450 х г в течение 5 мин. Аккуратно отбросить супернатант соблюдая осторожность, чтобы не потерять гранулированные яиц. Повторите 2-3х или пока супернатант не ясно.
  3. Ресуспендируйте гранулированные яйца (и туши) В 2 мл стерильного буфера яйцо и добавить 2 мл стерильного 60% сахарозы в яйце буфера. Смешайте это решение, пока яйца не будут полностью ресуспендировали (поскольку они имеют тенденцию к образованию комков при центрифугировании) вручную или при помощи вортекса.
  4. Центрифуга при 450 мкг в течение 15 мин.
  5. Тщательно передачи надосадочной жидкости (содержащей яиц) в стерильную пробирку. Отменить гранул, которая содержит туши и другие побочные продукты лизиса.
  6. Удалить остаточной сахарозы путем ресуспендирования яйца в яйцо буфере и центрифугируют при 450 х г в течение 5 мин. Аккуратно собираем и отбросить супернатант. Повторить 3 раза.
  7. Под капотом ламинарного ресуспендируйте гранулированные яйца в яйца стерильном буфере, содержащем 1 Ед / мл хитиназе при комнатной температуре, чтобы переварить яичную скорлупу. Через 30 мин начинают осуществлять мониторинг реакции (под инвертированным микроскопом культуры клеток). Каждая партия хитиназе имеет несколько иную деятельность. Обычно пищеварения завершен в 1 час.
  8. Когда примерно 70-80% яичной скорлупы усваиваются хитиназе Добавить CM-15 (L-15 клеточной культуре Medбария, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 50 ед / мл пенициллина и 50 мкг / мл стрептомицина). Диссоциируют клетки, используя шприц с калибра 27. Фильтр клеточной суспензии с 5,0 мкм фильтр для удаления нетронутыми эмбрионов, группы клеток и личинок.
  9. Гранул диссоциированной клеточной суспензии центрифугированием при 450 х г в течение 15 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в CM-15 клеточной культуральной среды.
  10. Пластина диссоциированных клеток на стеклянные покровные стекла, предварительно покрытые арахисовое лектинов (0,1 мг / мл), растворенных в воде. Примечание: клетки должны придерживаться подложки, чтобы отличать.
  11. Клетки могут быть выдерживают при комнатной температуре (16-20 ° C) на воздухе в течение более 2 недель.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С нашим протоколам, которые мы изучаем последствия человеческой Ар 42 олигомеров на функцию нейронов 8. Фрагмент, кодирующий человеческий Ар 42 и искусственные кодирующую последовательность сигнального пептида из своих вектор pPD50.52 амплифицировали из конструкции PCL12 9 с использованием праймеров, которые введены Sma один сайт эндонуклеазы рестрикции на концах. Затем фрагмент вставляется в конструкцию, содержащую 2481 п.н. FLP-6 последовательность промотора в pPD95...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы опишем комбинированный подход, изучать клеточные и молекулярные аспекты amylopathies использованием C. Элеганс. Преимущества этого подхода включают: 1.) Низкая стоимость C.elegans поддерживается в нормальном чашку Петри засевают бактерии, при комнатной температуре. 2) Мощный генетики. Трансгенные животные могут быть получены в несколько месяцев, и широкий спектр последовательности промотора доступно для управления экспрессией нужного гена в определенных нейронах. 3) простые, хорошо характеризу...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Лю Шуан за критическое прочтение рукописи. PCL12 конструкция была подарком форме Д-р Кристофер Д. Линку. Эта работа была поддержана двумя Национальный научный фонд грантов (0842708 и 1026958) и AHA гранта (09GRNT2250529) в FS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1. NGM
Sodium ChlorideSigma-AldrichS58863 г
Бактериологический агарAMRESCOJ63717 г
Бакто-пептонAMRESCOJ6362,5 г
Дистиллированная водаДоведите до 975 мл
Стерилизуется автоклавированием, затем добавьте следующие элементы и хорошо перемешайте
СульфатмагнияSigma-AldrichM26431 мл 1 М стока
Кальция хлоридSigma-AldrichC56701 мл 1 М стока
ХолестеринСигма-ОлдричC30451 мл 5 мг/мл стока ( в этаноле)
Калий-фосфатный буфер25 мл 1М стока
2. Калийфосфатный буфер
Калийфосфат одноосновнойSigma-AldrichP5655108,3 г
Калийфосфат двухосновнойSigma-AldrichP378635,6 г
Дистиллированная водаДовести до 1 л
Стерилизовано автоклавированием
3. M9 буфер
фосфат калия одноосновнойSigma-AldrichP56553 г
Фосфат натрия двухосновнойSigma-AldrichS51366 г
Хлорид натрияSigma-AldrichS58865 г
Сульфат магнияSigma-AldrichM26431 мл 1 м бульона
Дистиллированная водаДоведите до 1 л
Стерилизовано автоклавированием
4. Яйцевой буфер (рН 7,3, 340 мОсм)
Хлорид натрияSigma-AldrichS5886118 мМ
Хлорид калияSigma-AldrichP540548 мМ
Хлорид кальцияSigma-AldrichC56702 мМ
Хлорид магнияSigma-AldrichM48802 мМ
HEPESFisher ScientificBP31025 мМ
Дистиллированная водаДовести до 1 л
Стерилизована автоклавированием
5. CM-15
L-15 питательная средаGibco11415450 мл
Фетальная бычья сывороткаGibco10437-02850 мл
ПенициллинGibco1514050 единиц/мл
стрептомицинGibco1514050 г/мл
Отрегулируйте до 340 мОсм с сахарозой, затем стерильно отфильтруйте в автоклавные флаконы и храните при температуре 4° C
6. Другие реагенты
галокарбон 700 маслогалоуглерод продукты9002-83-9
5 μ m Acrodisc Шприцевой фильтрPALL Co.4199
ХитиназаСигма-ОлдричC6137-5УН
Лектин (арахис)Сигма-ОлдричL0881-10MG
Гидроксид натрияFisher ScientificS320
ЛизинСигма-ОлдричL5501
БиотинСигма-ОлдричB4639
Растворгипохлорита натрияСигма-Олдрич425044
Азиднатрия Сигма-Олдрич71289
СахарозаСигма-ОлдричS0389

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
  2. Kotzbauer, P. T., Trojanowsk, J. Q., Lee, V. M. Lewy body pathology in Alzheimer's disease. Journal of Molecular Neuroscience. 17 (2), 225-232 (2001).
  3. Greenberg, S. A. Inclusion body myositis: review of recent literature. Current Neurology and Neuroscience Reports. 9 (1), 83-89 (2009).
  4. Revesz, T., et al. Sporadic and familial cerebral amyloid angiopathies. Brain Pathology. 12 (3), 343-357 (2002).
  5. Hartmann, T., et al. Distinct sites of intracellular production for Alzheimer's disease A beta40/42 amyloid peptides. Nature Medicine. 3 (9), 1016-1020 (1997).
  6. Ohnishi, S., Takano, K. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cellular and Molecular Life sciences: CMLS. 61 (5), 511-524 (2004).
  7. C. elegans II. Cold Spring Harbor Monograph. DL, R. iddle, et al. 1, M. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1222(1997).
  8. Cotella, D., et al. Toxic role of k+ channel oxidation in Mammalian brain. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (12), 4133-4144 (2012).
  9. Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9368-9372 (1995).
  10. Cai, S. Q., Sesti, F. Oxidation of a potassium channel causes progressive sensory function loss during aging. Nature Neuroscience. 12 (5), 611-617 (2009).
  11. Yu, S., et al. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 3384-3387 (1997).
  12. Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).
  13. Caserta, T. M., et al. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis : an international journal on programmed cell death. 8 (4), 345-352 (2003).
  14. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

C elegansSEGFP

Похожие статьи