Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Всего зажим патч для сотовых изучения механизмов Инфракрасный нервного возбуждения

20.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50444

⸱

31 июля 2013 г.

 ,  ,  , 
1Biotactical Engineering, Faculty of Engineering and Industrial Science, Swinburne University of Technology, 2Department of Otolaryngology, The University of Melbourne

В этой статье

Краткое содержание

Инфракрасный нерва была предложена в качестве альтернативы электрической стимуляции в диапазоне нервных типов, включая те, которые связаны с слуховой системы. Этот протокол описывает метод патч зажим для изучения механизма инфракрасного стимуляция нервов в культуре первичных слуховых нейронов.

Аннотация

Это было продемонстрировано в последние годы, что импульсный лазер инфракрасного света может быть использован, чтобы вызвать электрические реакции в нервной ткани, независимо от каких-либо дальнейших изменений ткани-мишени. Инфракрасное нейронных стимуляции сообщалось в различных периферийных и сенсорной нервной ткани в живом организме, с особый интерес показано на стимуляцию нейронов слухового нерва. Тем не менее, в то время как INS было показано, что работать в таких условиях, механизм (или механизмы), в котором инфракрасное излучение вызывает нервного возбуждения в настоящее время не очень хорошо понял. Протокол, представленные здесь описывается целой клетки патч зажим метод предназначен для облегчения Исследование инфракрасных нервного возбуждения в культуре первичных слуховых нейронов. Тщательно характеризующие реакцию этих клеток инфракрасного лазерного освещения в пробирке при контролируемых условиях, то можно получить более глубокое понимание фундаментальных Physicaл и биохимических процессов, лежащих в основе инфракрасного нервного возбуждения.

Введение

Области нейрофизиологии и медицинские бионика во многом полагаются на методы, которые позволяют управляемым стимуляции электрические реакции в нервной ткани. В то время как электрическая стимуляция остается золотым стандартом в нервном возбуждении, он страдает от ряда недостатков, таких как наличие артефактов стимуляции при записи нервные реакции, а также отсутствие стимуляции специфику в связи с распространением тока в окружающие ткани 1.

Последние два десятилетия мы стали свидетелями развития оптически опосредованной стимуляции методы 2. Некоторые из этих методов требует модификации ткани-мишени, либо путем добавления конкретной молекулы (например, клетку молекулы) 3 или некоторую форму генетической манипуляции (например Optogenetics) 4, ни один из которых просты в применении за пределами исследование параметра. Особый интерес поэтому инфракрасный нервного возбуждения (INS), где Ву нервной ткани возбуждается импульсного инфракрасного лазерного излучения. INS имеет потенциал, чтобы преодолеть многие недостатки электрической стимуляции, позволяя весьма специфический, бесконтактные стимуляции нервной ткани 2. Тем не менее, в то время как INS было успешно продемонстрировано в различных условиях, в естественных условиях, точный механизм возбуждения остается неопределенной.

Согласно последним публикациям показали прогресс в раскрытии механизмов, ответственных за INS 5-7. Быстрый нагрев за счет поглощения лазерного излучения водой видимому, играет ключевую роль. Однако, помимо этого консенсуса пока не достигнуто. Шапиро и др.. 7 предлагает весьма общей механизм, посредством быстрого нагрева вызывает возмущение в распределении заряженных частиц, прилегающей к мембране клетки, что приводит к изменению емкости клеточной мембраны и последующей деполяризации. Кроме того, Альберт и др.. 5 утверждают, что Laseт индуцированного нагрева активирует специфический класс чувствительных к температуре ионных каналов (переходный рецепторный потенциал ваниллоидные канала), что ионы проходить через клеточную мембрану. На данном этапе неясно, как эти механизмы сочетаются, да и вообще, есть ли дальнейшие факторы, которые еще не были идентифицированы.

Несмотря на небольшое число публикаций (ссылки 5,7-9) исследовали INS в пробирке, подавляющее большинство работ в этой области опубликовано была проведена в естественных условиях (например, ссылки 1,6,10-18). Инфракрасный стимуляции слуховых нейронов был области, представляющие особый интерес, в связи с потенциальных применений в кохлеарных имплантах 10,14-18. В то время как в естественных условиях эксперименты важно проверить эффективность метода в различных условиях, повышение уровня Контроль, обеспечиваемый в лабораторных исследованиях как ожидается, приведет к более детальному пониманию мехамом ответственность за INS. Данный отчет описывает получение культивируемых нейронов спирального ганглия для исследований патч зажим, так как они могут быть использованы для изучения фундаментальных механизмов а также ссылки на большое количество существующих данных из слуховой системы.

Техника патч зажим является отличным инструментом для исследования электрофизиологических явлений, обеспечивая средства регистрации электрической активности отдельных клеток и изучение вклада отдельных глубинные течения 19. Когда эта методика применяется к стабильной в пробирке подготовка первичных нейронов, таких как культивируемых нейронов спирального ганглия, он предлагает возможность для углубленного изучения механизмов, посредством которых нервная деятельность находится под контролем и манипулировать.

Протоколам, определенным в этой работе методы план исследования влияния лазерной стимуляции на электрические свойства нейронов спирального ганглия через зажим патчзаписей. Этот подход основан на волокном лазерный а не в свободном пространстве лазер, что позволяет безопасно операции, а также легче и более воспроизводимые выравнивание без необходимости модифицировать стандартную конфигурацию микроскопа. На основании этих протоколов, должна быть возможность проводить широкий спектр экспериментов для того, чтобы более четко определить механизм или механизмы, лежащие в INS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культура нейронов спирального ганглия

  1. Стерилизовать маленькие круглые (например, 10 мм в диаметре) покровные стекла и изогнутые щипцы в автоклаве. Передача стерилизовать покровные в отдельные лунки стерильного 4-кольцо 35 мм чашки Петри или 4-луночного планшета с использованием стерилизованного щипцов. Применить 150 мкл поли-L-орнитин (500 мкг / мл) и мышиного ламинина (0,01 мг / мл) к верхней поверхности покровного стекла и место в инкубаторе (37 ° С) в течение 48 часов. Убедитесь, что покровные не плавают от дна скважины.
  2. Подготовка 50 мл стерильной нейробазальной среды (NBM) для каждого нейронные культуры: 47,5 мл нейробазальной, 0,5 мл N 2 добавки, 1 мл B27 добавки, 0,5 мл L-глутамина и 0,5 мл пенициллина-стрептомицина. Примечание: Добавки могут быть заморожены, хранили при -20 ° C и добавляли к медиа в день требуется.
  3. Диссоциируют нейронов спирального ганглия от послеродовой день 4-7 крысят, как описано выше 20,21, намING как ферментативная (0,025% трипсина и 0,001% ДНКаза I) и механического оборудования. См. Whitlon соавт. Виейра 22 и др. 23. Для получения подробных сведений из нейронов спирального ганглия культуры или Паркер и др.. 24 для демонстрации Modiolus изоляции.
  4. Аспирируйте любой оставшийся раствор poly-L-ornithine/laminin от покровных и мыть кратко в НБМ.
  5. Добавить 150-200 мкл диссоциированных нейронов ганглиев подвески спирали к покровные и поместить в инкубатор (37 ° C, 10% CO 2). Примечание: до 20 Покровные стекла могут быть получены из средней помет 8 щенков крысы.
  6. Через четыре часа после покрытия нейронов, аспирации раствором для удаления остатков клеток и заменить 150-200 мкл нагретый свежий НБМ. Примечание: средства массовой информации может потребоваться ежедневное пополнение, чтобы избежать обезвоживания.
  7. Возврат покровные в инкубатор, пока не потребуется для электрофизиологических записей. Примечание: диссоциированными спиральныекультурах нейронов ганглиев может использоваться для электрофизиологических экспериментов четыре часа после диссоциации и в течение двух дней после этого. Время в пробирке должны быть приняты во внимание в ходе анализа результатов. Пополните НБМ каждые 24-48 часа.

2. Подготовка к записи патч зажим

  1. Готовят растворы
    1. Внутриклеточной (микропипетки) Решение: 115 мм K-глюконат, 7 мм KCl, 10 мМ HEPES, 0,05 мМ EGTA, 2 мМ Na 2 АТФ, 2 мМ Mg-АТФ, 0,5 мМ Na 2 GTP (доведения рН до 7,3 с помощью КОН; приспособиться к 295 мосмоль / кг сахарозы). Передайте раствора через стерильный фильтр (0,2 мкм) и разделить на 200 мкл аликвоты не сохраняется при температуре -20 ° C до дня записи.
    2. Внеклеточный (ванна) раствор: 137 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2, 10 мМ HEPES, 10 мМ глюкозы (доведения рН до 7,4 с помощью NaOH; приспосабливаться к 300-310 мосмоль / кг сахарозы) . Это решение состоит в день записи.
  2. Подготовьте записи микропипетки с сопротивлением 2-6 МОм. Мы используем СО 2-лазера съемника (P-2000; Саттер инструменты) и боросиликатного стекла (1,0 мм наружный диаметр; 0,58 мм внутренний диаметр, 75 мм длина).
  3. Подготовьте лазера. Этот протокол предназначен для использования с волокном лазерный, например, 1870 нм Инфракрасный Стимулятор нерва от OptoTech P / L. Оптическое волокно используется для подачи света в наших экспериментах 200/220 мкм ядро ​​/ оболочка диаметром кварцевого волокна с числовой апертурой 0,22 и FC-PC разъемов на обоих концах (AFW Технологии MM1-FC2-200/220-5-C -0,22). Патч-корды были сокращены в два раза для получения двух волокна косички (т.е. коннектором на одном конце и расщепляется в другой). Эффекты диаметр сердцевины волокна и числовой апертурой на изменения температуры лазерной индуцированной были подробно рассмотрены Томпсон и др.. 25
    1. Раскол кончик свет волокно доставки с использованием стандартных методови убедиться, что полученный совет высокого качества от наблюдения с помощью оптического микроскопа (т.е. кончик должна быть перпендикулярна к оси волокна и появляются плоские при визуальном осмотре). Подключите светло-волокна доставки к волоконно-связанной выходе лазерной стимуляции с использованием соответствующей через разъем (например Thorlabs ADAFC2).
    2. Измерьте выходной мощности лазера от расщепленный кончик волокна света доставки с использованием соответствующего документа (например, когерентное FieldMate с LM-3 головки детектора). Рекомендуется проверить мощность лазера каждый раз, когда свет волокна доставки расщепляется или значительную регулировка производится с лазером (например, перевозки из одной лаборатории в другую).
    3. Вставьте световод доставки в патроне волокна или аналогичное устройство и прикрепите патрон в соответствующие микроподвижки. Важно иметь возможность точно определить угол θ, что оптическое волокно образует с покровным. Это англе может быть измерено с фотографией экспериментальной установки и использования программного обеспечения для обработки изображений (например ImageJ), чтобы получить угол. Угол θ (или диапазон возможных углов) в основном ограничивается пространственным ограничений экспериментальной установки, - в частности микроскопом. Типичные значения θ в наших экспериментах (на основе прямого микроскопа) около 36 °, однако оптимальным углом могут существенно отличаться для альтернативных установок (например, те, которые используют инвертированный микроскоп).
    4. Выполняйте соединения между лазером и патч зажим системы сбора данных (например, Digidata 1440A, Molecular Devices), как показано на рисунке 2. Цифровой выход из патч зажим системы сбора данных должен быть подключен к лазерному через внешний генератор функций, что делает возможным определение параметров лазерного импульса независимо от системы сбора данных. Другой стороны, этот выход может быть подключен непосредственно клазерный привод (требуется длительность импульса и частоты повторения быть установлены с помощью программного обеспечения для получения данных). В любом случае сигнал используется для запуска лазер должен быть подключен к входу системы сбора данных, чтобы гарантировать, что сроки и продолжительность лазерных импульсов могут быть записаны одновременно с электрофизиологических сигналов.

3. Патч зажим Записи по расследованию INS

  1. Заполните соответствующий контейнер перфузии система с внеклеточным раствором и регулировать расход обеспечить перфузию ванну со скоростью 1-2 мл / мин. Мы используем самотечные системы (аспиратор бутылки, запорный клапан, а PE трубки) с встроенным в линию нагреватель для быстрого нагревания раствора, и перистальтический насос для удаления отработанного раствора путем отсасывания.
  2. Поместите покровное с культивируемых клеток в записи камеры (ванна) из прямой микроскоп. Использование больших увеличениях воды погружения цели (Е. Г. 40X) и фазово-контрастная (например, дифференциального интерференционного контраста или Dodt отличие градиент), визуально определить спиральный ганглий нейронов в культуре. Типичный нейрон спирального ганглия по фазе яркие, круглые и примерно 15 мкм в диаметре с видным ядра, как показано на рисунке 1а.
  3. После того, как нейрон был расположен, переключиться на более низком увеличении цели (например, 10X) и найдите целевой нейронов в поле зрения.
  4. Переместить подачи света оптического волокна в положении с использованием следующей процедуры (или эквивалент):
    1. Использование микроподвижки для перемещения выходного волокна, пока наконечник близка к целевой нейронов как в горизонтальной и вертикальной плоскостях. Вертикальное положение торца волокна может быть проверена путем перемещения объектива вверх и вниз (сканирование фокуса).
    2. Вернитесь к высокой цели увеличения и позиционирования зонда оптического волокна по своему прямому позицию рядом с TОн нейрона (см. Рисунок 2 вставки). При регулировке вертикального положения волокна, важно, чтобы нижний край волокон лежит на (т.е. только прикосновения) покровное, чтобы свести к минимуму неопределенность в расположении волокон. Оптимальное выравнивание в горизонтальной плоскости, будет зависеть от угла θ, что волокна делает с покровным и радиус волокна р. Для того, чтобы расположить волокна таким образом, что центр мишени нейрона лежит вдоль оси волокна, горизонтальное расстояние между верхним краем волокна и клетки-мишени должны быть
      Δ целевых = R (COSEC θ - θ 2 греха),
      где отрицательное значение будет указывать, что оптическое волокно выступы клетки. При выравнивании волокно, расстояние Δ целевого между верхним краем волокна и центром нейрона может быть приближенно достигнуто путем визуального осмотра. Однако Δ целевой предназначен дляслужить в качестве приблизительного ориентира только. Позиционирование волокна таким образом, что фактическое расстояние Δ между верхним краем волокна и центром нейрона заметно отличается от Δ цели (как на фиг.1), может дать представление о влиянии как радиальное смещение (т.е. от центра луч) и осевое смещение (т.е. вдоль оси волокна) пучка относительно мишени нейрона. Например, установка Δ ≈ 0 можно было бы ожидать увеличение местной температуры в непосредственной близости от клетки - т.е. с профилем пучка для типичных многомодовых волокон хорошо аппроксимируется верхней распределение шапка 26, снижение локально поглощенной энергии (температуры) из-за смещения от центра луча минимальна по сравнению с увеличением поглощенной энергии от движущихся лица конец волокна ближе к клетке.
      В то время как следует позаботиться, чтобы расположить волокна, как точно и как По повторяемостьюssible использованием визуальных ориентиров, точное измерение расположения волокон относительно целевого нейрона (например, Δ) имеет большее значение, чем позиционирование его на заданном расстоянии от отеля. Δ может быть определена (по оценкам неопределенности максимум ± 3 мкм) путем анализа изображений, как описано в пункте 3.8.2 протокола. В некоторых экспериментах 5,8, источников белого света были связаны через волокна с целью выявить нужную ячейку. Этот подход был оказались неэффективными в вертикальном настройки микроскопа, а интенсивность света, рассеянного от целевой области была относительно низкой в ​​этих мелких углов (θ).
    3. Когда волокно находится в положении, переместить его по известным количеством чтобы просто позиционирование микропипетки. Волокно может быть возвращен в исходное положение, когда нейронной записи достигнута.
  5. Заполните микропипетки с внутриклеточными решение и надежно свои места на головыTage из усилителя (например Multiclamp 700B, Molecular Devices). Использование трубки прикреплены к боковым микроэлектрода держатель, применяют небольшое количество положительное давление, чтобы предотвратить засорение микропипетки.
  6. Использование микроманипулятор, переместите микропипетки в положение чуть выше целевого нейрона.
  7. Протокол для записи всего ячейки:
    1. Нанесите 10 мс, +10 мВ Меандр (например, испытание на герметичность) в фиксации потенциала режима усилителя и отрегулируйте микропипетка потенциал (пипетки зачете) базовый сигнал 0 нА. Печать тест должен также использоваться, чтобы определить сопротивление микроэлектрода находится в пределах желаемого диапазона (например, 2 - 6 МОм).
    2. Во время контроля сопротивления, использование точных регулировок микроманипулятор осторожно расположить пипетки на поверхность мишени нейрона. Когда микропипетки находится в контакте с нейрона, сопротивление будет увеличиваться (от ~ 0,5 до 1 МОм). Яmmediately после увеличения сопротивления, удалите избыточное давление жидкости и нанесите небольшое отрицательное давление. После сопротивления прошла 10 - 20 МОм, исправить мембранный потенциал к холдингу уровне (например, около -60 мВ).
    3. Сопротивление электрода должна продолжать увеличиваться, пока не превышает 1 ГОм, показывая, что эффективное уплотнение (называется 'gigaseal') была образована между клеточной мембраной и микропипетки. На данный момент, удалить все давление жидкости из пипетки.
    4. После gigaseal была сформирована, использовать короткие импульсы тока (от 25 до 100 мкс; +1 V) или короткие импульсы отрицательного давления жидкости для разрыва клеточных мембран и достичь всю конфигурацию ячейки.
    5. Запишите мембранные емкости, последовательное сопротивление и входное сопротивление, определенная по экспоненциальной кривой установлены на текущее время импульса тест печать. Свернуть переходные емкости, регулируя CpFast и CpSlow управления на усилителе, то Switcч усилителя в режиме цельной клетке, и компенсировать емкость и сопротивление до плоской текущего наблюдается в печать тест. Применить серии компенсация сопротивления (~ 70% коррекции, 70% прогноз), регулируя емкость и сопротивление контроля для поддержания плоской характеристикой печать тест.
    6. Переключить на текущий зажим в режиме усилителя. Обратите внимание на мембранный потенциал покоя (при отсутствии ввода тока). Установка удерживающего тока для стабилизации мембранного потенциала на заданном уровне (например, -60 мВ). Нейтрализовать пипетку емкостью и регулировать баланс моста, чтобы сбалансировать падение напряжения.
    7. Проверьте стрельбы свойств нейронов, стимулируя с деполяризующими тока (+10 до +200 Па +10 шагов годовых; 300 мсек).
    1. Переместить назад оптические волокна в позиции рядом с нейроном. Используя программу обработки изображений, соединенный с ПЗС-камерой, захват изображений из положения волокна по отношению к целевой нейрон, сосредоточив внимание на плоскость нейрона на начальном этапе, а затем по верхнему краю оптического волокна (см. рисунок 1).
    2. В последующем анализе полученных изображений (например, 1b и 1с Цифры) можно точно определить Δ (положение верхнего края оптического волокна к относительной центр мишени нейрона). После Δ известно, такие параметры, как расстояние от торца волокна к целевой нейрона (вдоль оси волокна) г и радиальное смещение нейрона от центра т δ луч может быть рассчитана с помощью простых тригонометрических соотношений:
      Z = R греха 2θ + Δ COS θ
      δ R = ((R COS 2θ - грех θ Δ) 2 + Ау 2) 1/2,
      где Ау является расстоянием между осью волокна и центром нейрона, если смотреть сверху (например, таковыеэлектронной рис. 1).
      Анализ должен учитывать отклонение положения от клетки к клетке, а точное знание этих параметров местоположения может потребоваться для устранения возможных различий между стимуляцией процессов 25.

4. Эксперименты INS

  1. Во время записи электрофизиологических данных в любом токовых клещей или напряжения зажим конфигурации, запустите стимуляции лазером на нужные параметры (например, мощность, длительность импульса, частота и т.д.). С нашей лазер, оптическая мощность регулируется с помощью прямого ввода в лазерный привод и указывается вручную перед каждой записью. Длительность импульса и частоты повторения может управляться либо внешний генератор сигнала или программное обеспечение сбора данных (как описано в пункте 2.3.4). Убедитесь, что данные записываются с обеих канал патч зажим и лазерный канал курок.

Лазерных импульсов с длинамиот около 500 мкс до 15 мс и энергией ~ 0,25-5 мДж обычно дает измеряемый электрический ответов. Установка частоты повторения лазерных импульсов равной 1 Гц или менее может быть полезно для начальных экспериментов, так как это сводит к минимуму воздействие этого параметра. Типичные результаты, показывающие изменение записанного сигнала представлены в следующем разделе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Спиральные нейронов ганглиев реагировать на лазерного излучения с повторяемых сигналов в обоих фиксации потенциала и тока зажим конфигурации записи. 3а показаны типичные изменения тока через клеточную мембрану в ответ на 2,5 мсек, 0,8 мДж лазерного импульса (средний отклик от 6 лазерных импульсов, повторяющиеся с интервалом в 1 сек) с мембранного потенциала состоялось при -70 мВ, -60 мВ и -50 мВ. Чистые внутренние токи постоянно вызывали в ответ на лазерных импульсов, возвращаясь к начальным значениям п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Использование протоколов изложенных в настоящем документе, можно извлечь и культуре нейронов спирального ганглия и исследовать лазерной вызвало электрическую активность, выполняя целый экспериментов клетки патч зажим. При использовании в пробирке, технику патч зажим обеспечивает уровень контроля над экспериментальными параметрами, которые не достижимы в естественных условиях. Лазерная стимуляция параметров, таких как длина волны, энергия импульса, длительность импульса, форма импульса и последовательно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Эта работа выполнена при поддержке Австралийского совета исследований при Связь грантового проекта LP120100264.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Материалы и оборудование для клеточных культур
Стеклянные покровные стеклаLomb ScientificCSC 10 1 GP
4-кольцевая чашка для клеточных культур VWR International82050-542
Раствор поли-L-орнитинаSigma-AldrichP4957
LamininInvitrogen23017-015
Изогнутый щипцыWPI14101пинцет Dumont #5 (45° угловой наконечник)
CO2 ИнкубаторThermoScientificHeracell 150i
Таблица 1. Материалы и оборудование для клеточных культур.
Neurobasal media
Neurobasal AGibco10888-022
N-2 добавкаInvitrogen17502-048
B27 бессывороточная добавкаInvitrogen17504-044
Пенициллин-стрептомицинInvitrogen15140-148
L-глютаминInvitrogen25030-149
<стронг>Раствор внутриклеточный
хлорид калияSigma-AldrichP4504
HEPESSigma-AldrichH4034
D-глюконат калияSigma-AldrichG4500
EGTASigma-AldrichE3889
Na2ATPSigma-AldrichA2383
MgATPSigma-AldrichA9187
NaGTPSigma-AldrichG8877
Гидроксид калияLabServBSPPL738.500
СахарозаSigma-AldrichS8501
Внеклеточный раствор
Хлорид натрияSigma-Aldrich310166
Хлорид калияSigma-AldrichP4504
HEPESSigma-AldrichH4034
Хлорид кальцияSigma-Aldrich383147
Хлорид магнияSigma-AldrichM8266
D-глюкозаSigma-AldrichG8270
Гидроксид натрияLabServBSPSL740.500
СахарозаSigma-AldrichS8501
Table 2. Решения для клеточных культур и пластырей. а) Нейробазальная среда. б) Внутриклеточный раствор. в) Внеклеточный раствор.
Вертикальный микроскопZeissAxioExaminerD1Оснащен контрастным объективом Додта
Водно-иммерсионный объективZeissW Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Платформа и X-Y стол ThorLabsBurleigh Гибралтар
Записывающая камераWarner InstrumentsRC-26G
Виброизоляционный столTMCMicro-g 63-532
ПЗС-камераДиагностические приборыRT1200
Программное обеспечение для камерыДиагностические приборыSPOT Базовый
встраиваемый раствор нагревателяWarnerSH-27B
Регулятор температурыWarnerTC-324B
Усилитель патч-клещейМолекулярные устройстваMulticlamp 700B
Патч-хомут система сбора данныхМолекулярные приборыDigidata 1440A
МикроманипуляторSutter InstrumentsMPC-325
Стекло для микропипетокSutter InstrumentsGBF100-58-15Боросиликатное стекло с нитью накала
Пуллер для микропипетокSutter InstrumentsP2000
Программное обеспечение для записиAxoGraphLab pack и электрофизиологические инструменты
Аспиратор флаконSigma-AldrichCLS12201L1 л Пирекс бутылка аспиратора, с выходом для трубки
ПЭ ТрубкаHarvardPolyE #340
Перистальтический насосMasterflex Cole-ParmerHV-07554-85
Таблица 3.Патч зажим оборудование.
1,870 нм лазерный диодOptotech
200/220 μ m Многомодовый оптоволоконный патч-корд (FC/PC)AFW TechnologiesMM1-FC2-200/220-5-C-0.22Светоотдача оптического волокна, кварцевый сердечник и оболочка, 0,22 NA
Сквозной разъем оптического волокна (FC/PC)ThorlabsADAFC2
Скалыватель оптического волокнаEREMFO1
Инструмент для снятия оптического волокна (0,25 - 0,6 мм) SiemensДля снятия оптической оболочки
Инструмент для снятия изоляции оптического волокна (0,6 - 1,0 мм)SiemensДля снятия внешнего покрытия патч-корда
ГенераторЛюбой генератор сигналов, который может выдавать необходимые формы импульсов и способен срабатывать извне
ПозиционерПозиционер, изготовленный на заказ. Можно заменить стандартным микропозиционером, используемым для экспериментов с патч-клемом
оптоволоконный патронNewportFPH-DJ
Лазерный измеритель мощности и детекторная головкаCoherentFieldMate (измеритель мощности) с LM-3 (детекторная головка)
Table 4. Лазерное оборудование.
сигналов оптического волокна :

Ссылки

  1. Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003(2005).
  2. Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser & Photonics Reviews. 5, 68-80 (2011).
  3. Kramer, R. H., Fortin, D. L., Trauner, D. New photochemical tools for controlling neuronal activity. Current Opinion in Neurobiology. 19, 544-552 (2009).
  4. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  5. Albert, E. S., et al. Trpv4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of Neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
  6. Wells, J., et al. Biophysical mechanisms of transient optical stimulation of peripheral nerve. Biophysical Journal. 93, 2567-2580 (2007).
  7. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736(2012).
  8. Bec, J. -M., et al. Characteristics of laser stimulation by near infrared pulses of retinal and vestibular primary neurons. Lasers in Surgery and Medicine. 44, 736-745 (2012).
  9. Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. Journal of Physiology (London). 589, 1295-1306 (2011).
  10. Izzo, A. D., et al. Laser stimulation of auditory neurons: Effect of shorter pulse duration and penetration depth. Biophysical Journal. 94, 3159-3166 (2008).
  11. Wells, J., Konrad, P., Kao, C., Jansen, E. D., Mahadevan-Jansen, A. Pulsed laser versus electrical energy for peripheral nerve stimulation. Journal of Neuroscience Methods. 163, 326-337 (2007).
  12. Teudt, I. U., Nevel, A. E., Izzo, A. D., Walsh, J. T., Richter, C. P. Optical stimulation of the facial nerve: A new monitoring technique. Laryngoscope. 117, 1641-1647 (2007).
  13. Jenkins, M. W., et al. Optical pacing of the embryonic heart. Nature Photonics. 4, 623-626 (2010).
  14. Izzo, A. D., Richter, C. P., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Laser stimulation of the auditory nerve. Lasers in Surgery and Medicine. 38, 745-753 (2006).
  15. Izzo, A. D., et al. Selectivity of neural stimulation in the auditory system: A comparison of optic and electric stimuli. J. Biomed. Opt. 12, 021008(2007).
  16. Richter, C. P., et al. Optical stimulation of auditory neurons: Effects of acute and chronic deafening. Hearing Research. 242, 42-51 (2008).
  17. Littlefield, P. D., Vujanovic, I., Mundi, J., Matic, A. I., Richter, C. P. Laser stimulation of single auditory nerve fibers. Laryngoscope. 120, 2071-2082 (2010).
  18. Izzo, A. D., et al. Optical parameter variability in laser nerve stimulation: A study of pulse duration, repetition rate, and wavelength. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54, 1108-1114 (2007).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable-membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  20. Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O'Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291, 1-14 (2012).
  21. Coleman, B., Fallon, J. B., Pettingill, L. N., de Silva, M. G., Shepherd, R. K. Auditory hair cell explant co-cultures promote the differentiation of stem cells into bipolar neurons. Experimental Cell Research. 313, 232-243 (2007).
  22. Whitlon, D. S., et al. Survival and morphology of auditory neurons in dissociated cultures of newborn mouse spiral ganglion. Neuroscience. 138, 653-662 (1016).
  23. Vieira, M., Christensen, B. L., Wheeler, B. C., Feng, A. S., Kollmar, R. Survival and stimulation of neurite outgrowth in a serum-free culture of spiral ganglion neurons from adult mice. Hearing Research. 230, 17-23 (2007).
  24. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. B. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of corti. J. Vis. Exp. (36), e1685(2010).
  25. Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 17, 075002(2012).
  26. Snyder, A. W., Love, J. D. Optical Waveguide Theory. , Chapman and Hall. (1983).
  27. Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modelling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18, 035004-0310 (2013).
  28. Yao, J., Liu, B. Y., Qin, F. Rapid temperature jump by infrared diode laser irradiation for patch-clamp studies. Biophysical Journal. 96, 3611-3619 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Слуховые нейронынейроны спирального ганглиялазерное облучениеустановка для патч-клампапозиционирование оптического волокнаемкость мембраныкомпенсация последовательного сопротивлениярежим фиксации тока
Всего зажим патч для сотовых изучения механизмов Инфракрасный нервного возбуждения
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.