Лазерная Захват микродиссекция нейронов от Дифференцированный человека нейрональные клетки в культуре

Краткое содержание

Клетки человека нейрональные (NPC) были расширены под пролиферирующих условиях. НПС дифференцировались в нейронных богатых культур в присутствии комбинации нейротропинов. Нейронные маркеры были обнаружены иммунофлуоресцентного окрашивания. Чтобы изолировать чистую популяцию нейронов, НПС были дифференцированы на PEN мембранных горками и лазерная захвата микродиссекции была выполнена.

Аннотация

Нейрональные клетки-предшественники (НПК), выделенные из головного мозга плода человека были расширены при пролиферативных условиях в присутствии эпидермального фактора роста (EGF) и фактор роста фибробластов (FGF), чтобы обеспечить избытке клеток. НПС дифференцировались в присутствии новой комбинации фактора роста нервов (NGF), головного мозга нейротрофический фактор (BDNF), дибутирил цАМФ (DBC) и ретиноевой кислоты на чашки, покрытые поли-L-лизин и мыши ламинин, чтобы получить нейрон богатых культур. НПС также дифференцированы в отсутствие нейротропинов, DBC и ретиноевой кислоты и в присутствии цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), получая астроцитов богатых культур. Дифференцированные НПС характеризовались иммунофлюоресцентного окрашивания для панели нейронных маркеров, включая NeuN, synapsin, ацетилхолинэстеразы, синаптофизина и GAP43. Глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) и STAT3, астроцитов маркеры, были обнаружены в 10-15% дифференцированных NPC. Для облегчениякамерного типа конкретных молекулярная характеристика, лазерная захвата микродиссекции было проведено с целью изолировать нейроны культивировали на полиэтиленнафталата (PEN) мембранные горки. Методы, описанные в данном исследовании ценный инструмент для продвижения нашего понимания молекулярного механизма нейродегенерацией.

Введение

Пожизненное нейрогенез как известно, происходит в субвентрикулярной зоне боковых желудочков и в субгранулярной слоем зубчатой ​​извилине взрослом мозге млекопитающих ^1. Нейрональные клетки (NPC), которые происходят из этих регионов мультипотентные клетки, которые могут дифференцироваться в нейроны, астроциты и олигодендроциты ^2. НПС породили интерес из-за их потенциала для пересадки у больных с различными нейродегенеративных расстройств, включая болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, инсульт и болезни Альцгеймера (БА) ^3. Исследования с НПС в целом направлены на этого угла трансплантации но потенциал NPC-производных нейронов в качестве модели клеточной культуры, чтобы определить механизм нейродегенерацией не в полной мере. Предыдущие исследования обычно используется постмитотические нейроны, выделенные из головного мозга грызунов тканей, которые должны быть выделены для каждого эксперимента, поскольку они несамообновлению. Хотя человеческая нейробластома клеточные линии, включая SH-SY5Y и SK-N-MC клетки могут быть расширены, они не имеют характеристики первичных нейронов. Человеческие НПС, с другой стороны, предлагают как преимущества, так как они могут быть расширены для многократного прохода и могут быть дифференцированы, чтобы генерировать клеточной популяции с характеристиками первичных нейронов ^4,5. В текущем исследовании, мы описываем новый протокол дифференциации получить последовательную нейронов богатых населения из коммерчески доступных НПС, выделенных из мозга человеческого плода. Поскольку эти культуры действительно содержат небольшой процент клеток глии, нужно использовать дополнительные методы, чтобы изолировать чистую популяцию нейронов для молекулярных характеристик. Лазерный захват микродиссекции (LCM) представляет собой новый метод, с помощью которого гомогенной популяции клеток из раздела тканей могут быть селективно захватывается для анализа экспрессии генов ^6. Мозг представляет собой гетерогенную ткань, состоящая из нейронов, глии и другие мобильные типес. LCM была использована для определения экспрессии генов нейронов конкретных анализов ^7-10. Ранее мы уже выполняется НОК нейронов гиппокампа от AD (Tg2576) разделов мозга мыши, чтобы показать снижение экспрессии циклического элемента AMP ответ связывающего белка (CREB) и BDNF в частности, в нейронах гиппокампа ^11. В настоящем исследовании мы описываем процедуры для расширения человеческих НПС, дифференцировки нейронов, иммунофлуоресцентного окрашивания нервных маркеров и LCM для выделения нейронов культивируемых на PEN мембранных слайдов.

Протокол

1. Расширение человека НПС (рис. 1)

1. Оживить Замороженный исходный материал человека НПС из мозга плода (Lonza, Walkersville, MD, США) и культуры их в суспензии в Т-75 колб как нейросферы (рис. 1А) в Neurobasal среде, содержащей распространения добавки, EGF (10 нг / мл) и FGF (10 нг / мл).
2. После 3 дней в культуре, передавать нейросферы в 15 мл пробирку и центрифугируют при 500 оборотах в минуту в течение 5 мин.
3. Жидкость над осадком сливают, оставляя за ~ 100 мкл среды выше клеточного осадка и передавать в пробирку Эппендорфа. 100 мкл осадок клеток достаточно разделить на 2 Т-75 колб. Если меньше, уменьшить количество колб как нейрональные клетки-предшественники не могут размножаться если разделить тонкими.
4. Растирают с осадок мкл 50х наконечника 200, удерживая наконечник 200 мкл против нижней части трубы. Разделите клеточной суспензии поровну на две части и добавить их в 2 Т-75 колб (1-2 Сплит), по одному для продолжалирасширение и другой для дифференциации.
5. Продолжить культуру нейрональных клеток для расширения (в первую колбу) путем изменения среды каждые 4-5 дней, пока нейросферы не достигают своего оригинальный размер 300-500 мкм. Изменение среды путем центрифугирования (500 оборотов в минуту; 5 мин), отказаться от старого среду и добавить новую среду.

2. Дифференциация человека НПС в Нейрон-богатой культуры (рис. 2)

1. Для дифференциации нейрональных клеток-предшественников нейронов в богатой культурой, поместите один покровное в каждую лунку 24-луночного планшета и покрыть 100 мкг / мл поли-L-лизина путем добавления 500 мкл в каждую лунку. Инкубировать посуду в течение 30 мин при комнатной температуре.
2. Аспирируйте поли-L-лизин раствор и сполосните пластину стерильной водой.
3. Далее, покрывают лунки планшета с 500 мкл 5 мкг / мл мышиного ламинина и инкубируют в течение 30 мин. После инкубации промойте лунки с PBS.
4. 4 дня после splittiнг клетки (шаг 1.4), передать небольшие нейросферы в колбу, помеченные 'для дифференциации' в блюда, покрытые с плотностью ~ 500 нейросферы на лунку в 24-луночный планшет.
5. Через 6 ч, когда нейросферы приложить к чашке, удалить среды пролиферацию и дифференцировку добавить среду, состоящую из Neurobasal среды, B27 добавка, NGF (20 нг / мл), BDNF (10 нг / мл), DBC (100 мМ), и ретиноевой кислоты (2 мкМ).

3. Иммунофлуоресценции Окрашивание дифференцированных НПС (рис. 3)

1. После культуре нейрональных клеток в дифференцировке в нейроны среды в течение двух недель, нейрон-богатой культурой получается. Промыть нейроны раз в PBS, а затем исправить их в 4% параформальдегида в течение 30 мин. После фиксированной, промыть клеткам три раза PBS.
2. Инкубируйте клетки с пермеабилизации буфера (5% BSA и 0,2% Тритон Х-100 в ЗФР) при комнатной температуре в течение 60 мин.
3. Выдержите посуду O / N при 4 ° C Iпа шейкер со следующим сочетанием поликлональные и моноклональные антитела в 3% БСА в PBS: NeuN (1:250) и synapsin (1:250); ацетил холинэстеразы (1:500) и синаптофизин (1:250); BDNF (1 : 500) и GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) и GFAP (1:1000).
4. Промыть покровные три раза ЗФР, а затем инкубируют с их анти-кроличьего-Cy3 и анти-мыши-FITC вторичными антителами при комнатной температуре в темноте в течение 90 мин. После инкубации, мыть покровные три раза PBS.
5. Поместите 10 мкл монтажной среды на предметное стекло, вынуть покровное из культуральной блюдо с пинцетом, и поместить его вниз головой на монтажную среду. Аккуратно протрите лишнюю монтажную среду и запечатать края с лаком для ногтей.
6. Изучите иммуноокрашиванию нейронов в флуоресцентным микроскопом.

4. Лазерная Захват микродиссекция нейронов (рис. 4)

1. Дифференцировать НПС в нейронной богатых культуры на PEN мембраны слайдаы покрывают поли-L-лизин и мыши ламинина в соответствии с процедурами, описанными в рисунке 2.
2. Выполните все последующие шаги в рамках РНКазы условиях.
3. Пятно культуры с использованием HistoGene Пятно (Arcturus) для визуализации клеток.
4. Найти области чистых популяций нейронов, лишенных астроцитов с помощью дорожной карты образ всего слайда с системой Veritas LCM. Отметить нейроны используя инструменты рисования.
5. Выполните лазерный захват этих областях с использованием компьютерным управлением точность и автоматизацию в два этапа. Во-первых, ИК (инфракрасный) обжигают при нескольких пятен с током, лазерным 70 мВт и импульса 2500 мкс, чтобы получить мембрана приложить к крышке. Далее, отмеченные область вырезали с помощью режущего инструмента УФ на условиях низкого уровня 10 мВ.
6. Сочетание этих процессов выборочно захватывает отмеченные районы от мембраны PEN на CapSure LCM макро колпачками. Когда колпачок снят, мембрана с пeurons придерживается крышки.
7. Изолировать общей РНК из образцов LCM использованием изоляции комплект PicoPure РНК (Arcturus) и лечения ДНКазой.
8. Amplify выделенной РНК с помощью РНК RiboAMP усиления комплект в соответствии с инструкциями из комплекта.
9. Выполните реального времени RT-PCR анализ с использованием TaqMan зонды для обнаружения человеческого нейрофиламентов тяжелую цепь (hNFHc).

Сокращения:

AD, болезнь Альцгеймера; BDNF, мозговой нейротрофический фактор; CREB, циклический АМФ элемент ответ связывающий белок; DBC, дибутирил цАМФ; EGF, эпидермальный фактор роста; FGF, фактор роста фибробластов; GFAP, глиальных фибриллярного кислого белка; LCM, лазерная захватить микродиссекции; ФРН, фактор роста нервов; NPC, нейрональные клетки; PEN, полиэтиленнафталат.

Результаты

Расширение НПС (рис. 1)

Когда нейросферы разбита на суспензии отдельных клеток растиранием, наконечник пипетки должна касаться дна трубки так, чтобы было некоторое сопротивление, когда суспензию пипеткой вверх и вниз. Количество раз растирания будет варьироваться между отдельными лицами и должно быть принято решение методом проб и ошибок, изучив полученную суспензию клеток под микроскопом. Очень важно, чтобы обеспечить достаточную плотность клеточной суспензии, потому что распр...

Обсуждение

Мы описываем в этом исследовании нейрона богатых модель клеточной культуры по дифференциации самообновляющихся нейрональных клеток человека и способ, чтобы изолировать чистую популяцию нейронов лазерным захвата микродиссекции. Мы использовали комбинацию NGF, BDNF, DBC и ретиноевой кислоты для нейронов дифференциации NPC. DBC используется для активации CREB, транскрипционный фактор, который усиливает нейрогенез ^12. Ретиноевой кислоты вызывает выход из клеточного цикла и снижает глиальных население ^13.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Нейропрогениторные клетки (NPC)	Lonza	PT-2599
Neurocult NS-A Человеческая базальная среда	Технология стволовых клеток	5750
Neurocult NS-A Пролиферационная добавка	Технология стволовых клеток	5753
Нейрокультовая добавка для дифференцировки NS-A Технология	стволовых клеток	5754
Добавка B-27 (50x)	Invitrogen	17504-044
Эпидермальный фактор роста человека	Технология стволовых клеток	2633
Фактор роста фибробластов	Sigma	F0291
Нейротрофический фактор мозга	Клеточная сигнализация	3897S
Фактор роста нервов	Invitrogen	13257-019
Дибутирилциклический АМФ	Sigma	D-0627
поли-L-лизин	Sigma	P-5899
Мышиный ламинин	Sigma	L-2020
Ретиноевая кислота	Sigma	R-2625
Антитело STAT3	Клеточная сигнализация	9132
GFAP антитело	Клеточная сигнализация	3670
GAP43	антитела Трансдукция лабораторий	612262
Антитело BDNF	Millipore	AB1534SP
Антитело к ацетилхолинэстеразе	Santz cruz	Sc-11409
Антитело к синаптофизину	Abcam	ab18008-50
Антитело NeuN	Chemicon	MAB377
Антитело к синапсину	Novus	NB300-104
Антитело к мышам FITC	Jackson Immuno	115-095-146
	Исследовательские лаборатории
Anti Rabbit Cy3	Jackson Immuno	711-165-152
	Исследовательские лаборатории
BSA	Sigma	A1653
Triton-X 100	Acros	21568-2500
Paraformaldehye	Fisher	4042
Покровное покрытие (Большое круглое покровное покрытие)	Fisherbrand	12-545-102
Монтажный материал (Prolong Gold)	Invitrogen	P36930
Pen мембрана	Применяемые биосистемы	LCM0521
Histogene LCM набор для окрашивания замороженных секций	Применяемые биосистемы	KIT0401
Набор для амплификации РНК RiboAmp Набор для амплификации РНК	Применяемые биосистемы	KIT0201
Набор для выделения РНК Picopure	Прикладные биосистемы	KIT0202
капсулы CapsureMacro LCM	Прикладные биосистемы	LCM0211