Лазерная Захват микродиссекция нейронов от Дифференцированный человека нейрональные клетки в культуре

Summary

Клетки человека нейрональные (NPC) были расширены под пролиферирующих условиях. НПС дифференцировались в нейронных богатых культур в присутствии комбинации нейротропинов. Нейронные маркеры были обнаружены иммунофлуоресцентного окрашивания. Чтобы изолировать чистую популяцию нейронов, НПС были дифференцированы на PEN мембранных горками и лазерная захвата микродиссекции была выполнена.

Abstract

Нейрональные клетки-предшественники (НПК), выделенные из головного мозга плода человека были расширены при пролиферативных условиях в присутствии эпидермального фактора роста (EGF) и фактор роста фибробластов (FGF), чтобы обеспечить избытке клеток. НПС дифференцировались в присутствии новой комбинации фактора роста нервов (NGF), головного мозга нейротрофический фактор (BDNF), дибутирил цАМФ (DBC) и ретиноевой кислоты на чашки, покрытые поли-L-лизин и мыши ламинин, чтобы получить нейрон богатых культур. НПС также дифференцированы в отсутствие нейротропинов, DBC и ретиноевой кислоты и в присутствии цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), получая астроцитов богатых культур. Дифференцированные НПС характеризовались иммунофлюоресцентного окрашивания для панели нейронных маркеров, включая NeuN, synapsin, ацетилхолинэстеразы, синаптофизина и GAP43. Глиальных фибриллярный кислый белок (GFAP) и STAT3, астроцитов маркеры, были обнаружены в 10-15% дифференцированных NPC. Для облегчениякамерного типа конкретных молекулярная характеристика, лазерная захвата микродиссекции было проведено с целью изолировать нейроны культивировали на полиэтиленнафталата (PEN) мембранные горки. Методы, описанные в данном исследовании ценный инструмент для продвижения нашего понимания молекулярного механизма нейродегенерацией.

Introduction

Пожизненное нейрогенез как известно, происходит в субвентрикулярной зоне боковых желудочков и в субгранулярной слоем зубчатой ​​извилине взрослом мозге млекопитающих ^1. Нейрональные клетки (NPC), которые происходят из этих регионов мультипотентные клетки, которые могут дифференцироваться в нейроны, астроциты и олигодендроциты ^2. НПС породили интерес из-за их потенциала для пересадки у больных с различными нейродегенеративных расстройств, включая болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, инсульт и болезни Альцгеймера (БА) ^3. Исследования с НПС в целом направлены на этого угла трансплантации но потенциал NPC-производных нейро....

Protocol

1. Расширение человека НПС (рис. 1)

1. Оживить Замороженный исходный материал человека НПС из мозга плода (Lonza, Walkersville, MD, США) и культуры их в суспензии в Т-75 колб как нейросферы (рис. 1А) в Neurobasal среде, содержащей распространения добавки, EGF (10 нг / мл) и FGF (10 нг / мл).
2. После 3 дней в культуре, передавать нейросферы в 15 мл пробирку и центрифугируют при 500 оборотах в минуту в течение 5 мин.
3. Жидкость над осадком сливают, оставляя за ~ 100 мкл среды выше клеточного осадка и передавать в пробирку Эппендорфа. 100 мкл осадок клеток достаточно разделить на 2 Т-75 колб. Если меньше, уменьши....

Results

Расширение НПС (рис. 1)

Когда нейросферы разбита на суспензии отдельных клеток растиранием, наконечник пипетки должна касаться дна трубки так, чтобы было некоторое сопротивление, когда суспензию пипеткой вверх и вниз. Количество раз растирания будет варьироваться между отдельными лицами и должно быть принято решение методом проб и ошибок, изучив полученную суспензию клеток под микроскопом. Очень важно, чтобы обеспечить достаточную плотность клеточной суспензии, потому что распр.......

Discussion

Мы описываем в этом исследовании нейрона богатых модель клеточной культуры по дифференциации самообновляющихся нейрональных клеток человека и способ, чтобы изолировать чистую популяцию нейронов лазерным захвата микродиссекции. Мы использовали комбинацию NGF, BDNF, DBC и ретиноевой кислоты для нейронов дифференциации NPC. DBC используется для активации CREB, транскрипционный фактор, который усиливает нейрогенез ^12. Ретиноевой кислоты вызывает выход из клеточного цикла и снижает глиальных население ^13.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Нейропрогениторные клетки (NPC)	Lonza	PT-2599
Neurocult NS-A Человеческая базальная среда	Технология стволовых клеток	5750
Neurocult NS-A Пролиферационная добавка	Технология стволовых клеток	5753
Нейрокультовая добавка для дифференцировки NS-A Технология	стволовых клеток	5754
Добавка B-27 (50x)	Invitrogen	17504-044
Эпидермальный фактор роста человека	Технология стволовых клеток	2633
Фактор роста фибробластов	Sigma	F0291
Нейротрофический фактор мозга	Клеточная сигнализация	3897S
Фактор роста нервов	Invitrogen	13257-019
Дибутирилциклический АМФ	Sigma	D-0627
поли-L-лизин	Sigma	P-5899
Мышиный ламинин	Sigma	L-2020
Ретиноевая кислота	Sigma	R-2625
Антитело STAT3	Клеточная сигнализация	9132
GFAP антитело	Клеточная сигнализация	3670
GAP43	антитела Трансдукция лабораторий	612262
Антитело BDNF	Millipore	AB1534SP
Антитело к ацетилхолинэстеразе	Santz cruz	Sc-11409
Антитело к синаптофизину	Abcam	ab18008-50
Антитело NeuN	Chemicon	MAB377
Антитело к синапсину	Novus	NB300-104
Антитело к мышам FITC	Jackson Immuno	115-095-146
	Исследовательские лаборатории
Anti Rabbit Cy3	Jackson Immuno	711-165-152
	Исследовательские лаборатории
BSA	Sigma	A1653
Triton-X 100	Acros	21568-2500
Paraformaldehye	Fisher	4042
Покровное покрытие (Большое круглое покровное покрытие)	Fisherbrand	12-545-102
Монтажный материал (Prolong Gold)	Invitrogen	P36930
Pen мембрана	Применяемые биосистемы	LCM0521
Histogene LCM набор для окрашивания замороженных секций	Применяемые биосистемы	KIT0401
Набор для амплификации РНК RiboAmp Набор для амплификации РНК	Применяемые биосистемы	KIT0201
Набор для выделения РНК Picopure	Прикладные биосистемы	KIT0202
капсулы CapsureMacro LCM	Прикладные биосистемы	LCM0211