Проточной цитометрии анализа флуоресценции Бимолекулярные Комплементация обеспечивает высокую пропускную количественный метод для изучения белок-белковых взаимодействий. Эта методика может применяться для отображения сайтов связывания белков и скрининга факторов, которые регулируют белок-белкового взаимодействия.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Проточной цитометрии бимолекулярного флуоресценции Комплементация: Высокая пропускная способность Количественный метод изучения взаимодействия белок-белок
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Среди методов изучения белок-белковых взаимодействий внутри клеток, Бимолекулярные Комплементация флуоресценцию (BiFC) является относительно простым и чувствительным. BiFC основан на производство флуоресценции с использованием двух нефлуоресцентные фрагменты флуоресцентный белок (Венерой, желтый флуоресцентный вариант белка, используется здесь). Номера флуоресцентный Венера фрагментов (VN и VC) сливают с двух взаимодействующих белков (в данном случае, AKAP-Lbc и PDE4D3), что дает флуоресценции из-за VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 взаимодействие и формирование функциональный флуоресцентный белок внутри клеток.
BiFC предоставляет информацию о внутриклеточной локализации белковых комплексов и сила белковых взаимодействий на основе интенсивности флуоресценции. Тем не менее, BiFC анализа с использованием микроскопии для количественной оценки силы белок-белковых взаимодействий отнимает много времени и несколько субъективным из-за гетерогенности экспрессии белка и взаимодействия. Объединяя проточной цитометрииАнализ с методологией BiFC, BiFC флуоресцентный белок-белковое взаимодействие сигнал может быть точно измерена для большого количества клеток в течение короткого времени. Здесь мы демонстрируем применение этой методологии для сопоставления регионов PDE4D3, которые необходимы для взаимодействия с AKAP-Lbc. Эта высокая пропускная способность методика может быть применена к скрининг факторов, которые регулируют белок-белкового взаимодействия.
Введение
650 000 белок-белковых взаимодействий, по оценкам, существуют в человеческом интерактома, играющих важнейшую роль в поддержании нормальной функции клеток 1,2. Кроме того коиммунопреципитации (со-IP) золотым стандартом для изучения белок-белковых взаимодействий от клеточного лизата, несколько анализов фрагмент белка дополнения (СПС) были разработаны для повышения чувствительности для обнаружения белок-белковых взаимодействий внутри клеток 3. Методы включают Ферстер резонансный перенос энергии (лад), биолюминесценция резонансный перенос энергии (BRET) и флуоресценции Бимолекулярные Комплементация (BiFC) 4,5. BiFC основана на облегченных объединение двух фрагментов флуоресцентный белок (здесь используется Венеры вариант YFP), которые каждый слитый с потенциальными партнерами взаимодействующих белков (в данном примере мы используем AKAP-Lbc и PDE4D3). Взаимодействие этих двух белков интерес внутри клеток приводит к функциональным флуоресценции, которые могут быть визуализированы еluorescence микроскопии с использованием прямой трансляции или в фиксированных клетках 6,7,8. По сравнению с другими СПС, BiFC чувствительны и менее технически сложных, с потенциалом для изучения клеточной локализации в живых клетках. Основным недостатком этого метода, однако, что как только образуется, флуоресцентный комплекс белок не может быть отменено. Поэтому это не является хорошим методом для изучения динамических белок-белкового взаимодействия. В данной работе мы используем BiFC для отображения взаимодействия сайтах PDE4D3 с AKAP-Lbc путем мониторинга интенсивности флуоресценции Венеры. По сравнению с традиционным анализом с помощью флуоресцентной микроскопии, которое является длительным и трудоемким (если не осуществляется с использованием автоматизированной машины высокой пропускной способностью), проточной цитометрии обеспечивает простой количественного анализа тысяч клеток в гетерогенную популяцию в течение короткого времени 9, 10. Здесь, путем проведения бок-о-бок сравнение проточной цитометрии-BiFC анализ и традиционных со-IP, мы показали, что две мethods представления сопоставимых данных, однако, проточной цитометрии BiFC анализ менее трудоемким и требует меньше материала, который может быть более полезным, когда клетки интерес ограничены.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Трансфекции клеток
- Пластина клеток за день до трансфекции, покрытие меньше клеток для иммунофлюоресценции.
- Для иммунофлюоресценции: в 6-луночный планшет, пальто скользит стеклянной крышкой (1 на лунку) с 0,02% желатина при 37 ° С в течение не менее 4 часов, мыть один раз средой, и для каждой скважины, знаки 1 х 10 5 НЕК 293Т клеток в 2 мл полной среды роста [среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с 10% FBS].
- Для проточной цитометрии и Вестерн-блоттинг: пластина 1,2 х 10 5 НЕК-293Т клеток / лунку в 2 мл полной среды роста в 6-луночный планшет (0,3 х 10 5 НЕК-293Т в 0,5 мл полной среды роста на лунку в 24-луночный планшет ).
- Подготовка ДНК для трансфекции в соответствии с протоколом изготовителя: Effectene (Qiagen) используется для иммунофлюоресценции. Транзит-LT1 (Mirus) используется для проточной цитометрии и Западной блоттинга. Количество ДНК использовали приведена ниже.
Трансфекция использованием Effectene (6-а)24-луночный планшет (нг) 6-луночный планшет (нг) CFP-вектор 10 50 В.Н. N-AKAP-Lbc 200 1000 VC-N PDE4D3-ФЗ (полнометражный PDE4D3) 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 100 VC N-PDE4D3-UCR1 (PDE4D3 N-концевого фрагмента, содержащего UCR1 домен) 100 VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (PDE4D3 С-концевой фрагмент, содержащий UCR2 и каталитические домены) 100 - Добавить указанным количеством плазмидной ДНК + 4 мкл энхансера к 100 мкл буфера EC, перемешивают, и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 5 мкл Effectene, перемешать, и инкубировать в течение 10 мин прикомнатной температуре. Добавить по каплям к клеткам.
- Добавить указанным количеством плазмидной ДНК в 250 мкл μl/50 Opti-MEM I бессывороточной среде в стерильную пробирку.
- Добавить Транзит-LT1 реагента к разбавленной смеси ДНК и пипеткой осторожно перемешать. (Транзит-LT1 реагент: ДНК соотношение 3 мкл Транзит-LT1 реагента на 1 мкг ДНК).
- Выдержите в течение 30 мин при комнатной температуре и добавляют по каплям к клеткам.
2. Подготовка клеток для проточной цитометрии, вестерн-блот и Иммунофлуоресценция
- 24 ч после трансфекции, проверьте флуоресценции под микроскопом эпифлуоресцентной до уборки клеток.
- Сотовые подготовки к проточной цитометрии:
- Вымойте клеток с 0,5 мл / 2 мл ледяной PBS для пластин 24-well/6-well.
- Отделить клетки с использованием 50 мкл μl/250 0,05% трипсина.
- Нейтрализовать трипсин 200 мкл / 1 мл DMEM среде.
- Collect 250 мкл клеток (как для 24-и и 6-луночный планшет) центрифугированием при 500 х г в течение 5 мин, используя оставшиеся клетки (1 мл) в течение Вестерн-блоттинга.
- Ресуспендируют клеток в 250 мкл буфера FACS [PBS + 0,5% (вес / объем) БСА + 2 мМ ЭДТА], хранить на льду в течение проточной цитометрии. Клетки также может быть установлена в 1% параформальдегида (в ФБР), если анализ проточной цитометрии не будет немедленным.
- Клеточный препарат для вестерн-блоттинга: осуществляется параллельно с подготовкой к клетке анализа потока цитометрии.
- Мытье клетки 1x с 2 мл ледяного PBS, клетки лизируют путем добавления 100 мкл буфера для лизиса клеток [10 мМ натрий-фосфатным буфером, рН 6,95, 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 5 мМ EGTA, 1% Тритон Х-100] .
- Сбор клеточного лизата центрифугированием в течение 10 мин при 21000 х г при 4 ° С.
- Количественно концентрации белка с помощью анализа на протеин по Брэдфорду, нагрузка равные количества белка на полосу для SDS-PAGE и перенос т на нитроцеллюлозные для иммуноблоттинга.
- Сотовые подготовка к иммунофлюоресценции.
- Промыть клетки 3 раза по 2 мл PBS, фиксируют клеток в 1 мл 3,7% параформальдегида (в PBS) в течение 10 мин при комнатной температуре, затем промывают 3 раза по 2 мл PBS в течение 5 мин.
- Установить крышку скольжения на предметное стекло, используя монтажную среду. Печать покровного края, используя лак для ногтей, если необходимо.
- Хранить слайды при 4 ° С до экзамена.
3. Проточной цитометрии и иммунофлюоресцентную микроскопию
- Проточная цитометрия выполняется с использованием Beckman Coulter Cyan ADP, оснащенный 488 нм, 405 нм и 642 нм твердотельные лазеры. Саммит программное обеспечение используется для сбора и анализа.
- Калибровка проточной цитометрии с использованием стандартных бисером.
- Участок прямого рассеяния (FSC) / бокового рассеяния (SSC) в линейном масштабе для стробирования живой клеточной популяции.
- Участок FSC / напряжения длительностью импульса стробирования неагрегированного живой клеточной популяции.
- Участок count/FL6 (СФП fluorescencе, 405 нм) по логарифмической шкале для стробирования неагрегированного живой CFP-положительных клеток.
- Участок count/FL1 (YFP флуоресценции, 488 нм) по логарифмической шкале для BiFC интенсивности.
- Выполнить YFP-CFP-двойных отрицательных образцов, отрегулируйте FSC, SSC, и FL1 FL6 ФЭУ (ФЭУ) напряжения для установки порога для каждого сигнала.
- Запуск одного положительного (как YFP + + и CFP) образцы для будущих автономно компенсации
- Приобрести не менее 10 000 закрытых мероприятиях (неагрегированного живой CFP + клеток) для анализа.
- Иммунофлуоресценция микроскопия выполняется с использованием Zeiss LSM 510 конфокальной микроскопии. Примечание: важно, чтобы все настройки (такие как зум, Пинхол, детектор усиления, смещения усилителя, размер кадра, скорость сканирования, сканирования среднего и лазерной мощности) между последовательной Образцы для правильного сравнение всех данных.
4. Анализ данных (выполняется с помощью программного обеспечения саммита)
- Настройка анализа протокола, аналогичного, что для acquisitиона с надлежащей стробирования:
Gate 1 в FSC / SSC точка участка для живых клеток.
Gate 2 в FSC / ширина импульса для ворот 1 неагрегированного живых клеток.
Gate 3 в подсчет / CFP Ворот 3 для неагрегированного CFP + живые клетки. - Компенсировать YFP и CFP сигнала с использованием YFP + + и CFP одного положительного клеток.
- Повторного определения отключения линий для CFP / YFP-позитивных клеток.
- Экспорт YFP средней интенсивности флуоресценции (MFI) из CFP + клеток в Excel для построения данных.
- Нормализация YFP MFI на уровни экспрессии AKAP-Lbc, PDE4D3 и управления загрузкой α-тубулина, как определено Вестерн-блоттинга.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
AKAP-Lbc PDE4D3 и конструкции (рис. 1Б) были слиты с В.Н. и VC фрагменты, соответственно. Взаимодействие AKAP-Lbc PDE4D3 и приводит к функциональным YFP флуоресценции (рис. 1А). Здесь мы используем метод BiFC к карте AKAP-Lbc-связывающие сайты в PDE4D3. Upstream консервативная область 1 (UCR1), вверх по течению консервативной области 2 (UCR2) и каталитической области (КПП) являются консервативными ФДЭ4 белков семейства, поэтому, полная длина (Флорида), UCR1 и UCR2 Plus Кат были использо...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
BiFC является простой и чувствительный метод для изучения белок-белковых взаимодействий. Этот метод не может быть использован для идентификации новых белок-белковых взаимодействий, однако, это особенно удобно, чтобы подтвердить белок-белковых взаимодействий внутри клетки и изучать функциональные свойства, такие, как внутриклеточной локализации белковых комплексов, отображение белок-белкового взаимодействия сайтов, а также для скрининга малых молекул / пептидов, которые могут модулировать белок-белкового взаимодействия. ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы благодарим O'Bryan лаборатории в МСЖД для критических экспериментальной оценки и обсуждения. Эта работа выполнена при поддержке Американской Ассоциации Сердца Грант 11SDG5230003 в ГКЦ и Национальный центр Продвижение Поступательное науки - МСЖД Центр клинических и трансляционных наук Грант UL1TR000050.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’ s модифицированный Eagle’ s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strephip), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag антитело | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA антитело | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-тубулин | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP антитела | Clontech | 632569 | |
| Клеточные культуральные планшеты, 6-луночная культура тканей обработана | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T клетки | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep набор для очистки плазмид, высокоскоростной | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’ s Фосфатно-солевой буфер (DPBS), стерильный 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Трипсин-ЭДТА, 0,05% (по массе) | Gibco | 25300 | |
| Полистирольные трубки с круглым дном для окрашивания FACS | BD Biosciences | 352052 | |
| параформальдегидом | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Продлить действие золотого реагента против выцветания с DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost плюс предметные стекла для микроскопа | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest премиальное защитное стекло | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| EQUIPMENT | |||
| CO2 инкубатор с воздушной рубашкой | NuAIR DH автопоточный | ||
| конфокальный микроскоп LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Устройство для электрофореза и переноса | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter |
Ссылки
- Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
- Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
- Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
- Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
- Wong, K. A., O'Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643(2011).
- Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
- Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429(2010).
- Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11(2008).
- Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
- Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
