Проточной цитометрии анализа флуоресценции Бимолекулярные Комплементация обеспечивает высокую пропускную количественный метод для изучения белок-белковых взаимодействий. Эта методика может применяться для отображения сайтов связывания белков и скрининга факторов, которые регулируют белок-белкового взаимодействия.
Среди методов изучения белок-белковых взаимодействий внутри клеток, Бимолекулярные Комплементация флуоресценцию (BiFC) является относительно простым и чувствительным. BiFC основан на производство флуоресценции с использованием двух нефлуоресцентные фрагменты флуоресцентный белок (Венерой, желтый флуоресцентный вариант белка, используется здесь). Номера флуоресцентный Венера фрагментов (VN и VC) сливают с двух взаимодействующих белков (в данном случае, AKAP-Lbc и PDE4D3), что дает флуоресценции из-за VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 взаимодействие и формирование функциональный флуоресцентный белок внутри клеток.
BiFC предоставляет информацию о внутриклеточной локализации белковых комплексов и сила белковых взаимодействий на основе интенсивности флуоресценции. Тем не менее, BiFC анализа с использованием микроскопии для количественной оценки силы белок-белковых взаимодействий отнимает много времени и несколько субъективным из-за гетерогенности экспрессии белка и взаимодействия. Объединяя проточной цитометрииАнализ с методологией BiFC, BiFC флуоресцентный белок-белковое взаимодействие сигнал может быть точно измерена для большого количества клеток в течение короткого времени. Здесь мы демонстрируем применение этой методологии для сопоставления регионов PDE4D3, которые необходимы для взаимодействия с AKAP-Lbc. Эта высокая пропускная способность методика может быть применена к скрининг факторов, которые регулируют белок-белкового взаимодействия.
650 000 белок-белковых взаимодействий, по оценкам, существуют в человеческом интерактома, играющих важнейшую роль в поддержании нормальной функции клеток 1,2. Кроме того коиммунопреципитации (со-IP) золотым стандартом для изучения белок-белковых взаимодействий от клеточного лизата, несколько анализов фрагмент белка дополнения (СПС) были разработаны для повышения чувствительности для обнаружения белок-белковых взаимодействий внутри клеток 3. Методы включают Ферстер резонансный перенос энергии (лад), биолюминесценция резонансный перенос энергии (BRET) и флуоресценции Бимолекулярные Комплементация (BiFC) 4,5. BiFC основана на облегченных объединение двух фрагментов флуоресцентный белок (здесь используется Венеры вариант YFP), которые каждый слитый с потенциальными партнерами взаимодействующих белков (в данном примере мы используем AKAP-Lbc и PDE4D3). Взаимодействие этих двух белков интерес внутри клеток приводит к функциональным флуоресценции, которые могут быть визуализированы еluorescence микроскопии с использованием прямой трансляции или в фиксированных клетках 6,7,8. По сравнению с другими СПС, BiFC чувствительны и менее технически сложных, с потенциалом для изучения клеточной локализации в живых клетках. Основным недостатком этого метода, однако, что как только образуется, флуоресцентный комплекс белок не может быть отменено. Поэтому это не является хорошим методом для изучения динамических белок-белкового взаимодействия. В данной работе мы используем BiFC для отображения взаимодействия сайтах PDE4D3 с AKAP-Lbc путем мониторинга интенсивности флуоресценции Венеры. По сравнению с традиционным анализом с помощью флуоресцентной микроскопии, которое является длительным и трудоемким (если не осуществляется с использованием автоматизированной машины высокой пропускной способностью), проточной цитометрии обеспечивает простой количественного анализа тысяч клеток в гетерогенную популяцию в течение короткого времени 9, 10. Здесь, путем проведения бок-о-бок сравнение проточной цитометрии-BiFC анализ и традиционных со-IP, мы показали, что две мethods представления сопоставимых данных, однако, проточной цитометрии BiFC анализ менее трудоемким и требует меньше материала, который может быть более полезным, когда клетки интерес ограничены.
1. Трансфекции клеток
24-луночный планшет (нг) | 6-луночный планшет (нг) | |
CFP-вектор | 10 | 50 |
В.Н. N-AKAP-Lbc | 200 | 1000 |
VC-N PDE4D3-ФЗ (полнометражный PDE4D3) | 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 | 100 |
VC N-PDE4D3-UCR1 (PDE4D3 N-концевого фрагмента, содержащего UCR1 домен) | 100 | |
VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (PDE4D3 С-концевой фрагмент, содержащий UCR2 и каталитические домены) | 100 |
2. Подготовка клеток для проточной цитометрии, вестерн-блот и Иммунофлуоресценция
3. Проточной цитометрии и иммунофлюоресцентную микроскопию
4. Анализ данных (выполняется с помощью программного обеспечения саммита)
BiFC является простой и чувствительный метод для изучения белок-белковых взаимодействий. Этот метод не может быть использован для идентификации новых белок-белковых взаимодействий, однако, это особенно удобно, чтобы подтвердить белок-белковых взаимодействий внутри клетки и изучать функциональные свойства, такие, как внутриклеточной локализации белковых комплексов, отображение белок-белкового взаимодействия сайтов, а также для скрининга малых молекул / пептидов, которые могут модулировать белок-белкового взаимодействия. Потому В.Н. и VC фрагменты нефлуоресцентных, фоновой флуоресценции низкий, способствуя таким образом чувствительность этого анализа. Необходимо время для созревания / стабилизации VN-протеин-VC-белкового взаимодействия, при этом происходит задержка визуализации белок-белковых взаимодействий и оптимальное моменты времени могут, следовательно, должны быть определены эмпирически. Следует также отметить, что VN-протеин-VC-белкового взаимодействия не является обратимым, следовательно, к сожалению с текущим Венера BiFC строит этом анализе не подходит тО динамическом исследовании кинетики взаимодействия белок-белок.
Надлежащего контроля важны для BiFC анализа. Подходящий отрицательный контроль включает не взаимодействующих белков или неспецифическими пептидами в соответствующих BiFC вектор, или, если возможно, мутант, который разрушает белок-белкового взаимодействия. Пустой вектор BiFC не является хорошим управления, как это приводит к неспецифической высокой фоновой флуоресценции. Если BiFC не наблюдается в двух взаимодействующих белков, экспрессия должна быть проанализирована. Кроме того, BiFC сигнала может изменяться в зависимости от белок-белкового взаимодействия сайтов. Следует отметить, что пространственной модуляции взаимодействием В. Н. и VC также может влиять на интенсивность флуоресценции, поэтому изначально важно проводить BiFC эксперименты с использованием как С-концевой и N-концевой VN / VC экспрессирующие конструкции. Например, BiFC не может произойти, если белок-белковое взаимодействие блоков повторного ассоциирования фрагментов Венеры. Таким образом, несколько комбинаций В.Н. и VC строит Shoulбы быть проверены (т.е. как C и N слияния терминала белка).
Интенсивность флуоресценции BiFC пропорциональна силе белок-белковых взаимодействий, с более высокой интенсивностью BiFC указывает сильное взаимодействие и нижний интенсивности флуоресценции предполагая слабое взаимодействие. BiFC MFI, следовательно, используется как индикатор для белок-белкового взаимодействия. Для точного анализа белок-белкового взаимодействия BiFC, очень важно, чтобы Вестерн-блот анализ выполняется для обеспечения равного экспрессии различных конструкций и что никакие деградации белка не происходит, что может мешать правильной анализа. Лизат из тех же образцов Поэтому предпочтительно для вестерн-блот анализ, чтобы определить аналогичный экспрессии белка для всех анализируемых образцов. Кроме того, очень важно, чтобы определить соответствующее количество плазмид для трансфекции чтобы обеспечить линейное выражение и взаимодействие белков и среди этого диапазона, взаимодействие белка коррелирует шй интенсивности флуоресценции BiFC сигнала.
Низкое количество CFP плазмиду использовали в качестве маркера для успешной трансфекции, так что только CFP положительные клетки анализировали здесь. Различные флуоресцентные белки, такие как RFP могут быть использованы, чтобы минимизировать проступание между цветами 11. Для проточной цитометрии, один позитивные клетки должны быть включены для компенсации. Если это возможно, по крайней мере 10000 CFP положительные клетки подсчитывают для обеспечения хорошего размера образца.
Таким образом, здесь показано, что соединение BiFC методологии с проточной цитометрии можно использовать как хороший показатель белок-белковых взаимодействий внутри клеток. Традиционный анализ BiFC использованием иммунофлуоресцентного микроскопа требует много времени, и размер выборки значительно ниже, чем соответствующий проточной цитометрии. Таким образом, соединение проточной цитометрии с BiFC может быть полезным для анализа белок-белкового взаимодействия, когда эффективность трансфекции является низким. В этомДоклад, мы воспользовались BiFC-проточной цитометрии для отображения взаимодействия сайтов в PDE4D3 за связывание с AKAP-Lbc. Эта техника может быть также распространена на экран для молекул или пептиды, которые могут нарушить или усилить взаимодействие белок-белок, для открытия новых лекарств 12. Этот метод также может быть использован для изучения определенных физиологических событий, таких как лиганд-индуцированной интернализации 13 GPCR автора.
The authors have nothing to disclose.
<strong>REAGENTS</strong> | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
Anti-Flag antibody | Sigma | M2, F1804 | |
Anti-HA antibody | Covance | 16B12, MMS-101R | |
α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
Anti-GFP antibody | Clontech | 632569 | |
Cell culture plates, 6-well tissue culture treated | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
Maxiprep plasmid purification kit, high speed | Qiagen | 12663 | |
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining | BD Biosciences | 352052 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
Prolong gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
Superfrost plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Fisherfinest premium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
<strong>EQUIPMENT</strong> | |||
CO<sub>2</sub> air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
Confocal microscope LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
Electrophoresis and transfer unit | Biorad | ||
Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter |