Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Проточной цитометрии анализа флуоресценции Бимолекулярные Комплементация обеспечивает высокую пропускную количественный метод для изучения белок-белковых взаимодействий. Эта методика может применяться для отображения сайтов связывания белков и скрининга факторов, которые регулируют белок-белкового взаимодействия.

Abstract

Среди методов изучения белок-белковых взаимодействий внутри клеток, Бимолекулярные Комплементация флуоресценцию (BiFC) является относительно простым и чувствительным. BiFC основан на производство флуоресценции с использованием двух нефлуоресцентные фрагменты флуоресцентный белок (Венерой, желтый флуоресцентный вариант белка, используется здесь). Номера флуоресцентный Венера фрагментов (VN и VC) сливают с двух взаимодействующих белков (в данном случае, AKAP-Lbc и PDE4D3), что дает флуоресценции из-за VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 взаимодействие и формирование функциональный флуоресцентный белок внутри клеток.

BiFC предоставляет информацию о внутриклеточной локализации белковых комплексов и сила белковых взаимодействий на основе интенсивности флуоресценции. Тем не менее, BiFC анализа с использованием микроскопии для количественной оценки силы белок-белковых взаимодействий отнимает много времени и несколько субъективным из-за гетерогенности экспрессии белка и взаимодействия. Объединяя проточной цитометрииАнализ с методологией BiFC, BiFC флуоресцентный белок-белковое взаимодействие сигнал может быть точно измерена для большого количества клеток в течение короткого времени. Здесь мы демонстрируем применение этой методологии для сопоставления регионов PDE4D3, которые необходимы для взаимодействия с AKAP-Lbc. Эта высокая пропускная способность методика может быть применена к скрининг факторов, которые регулируют белок-белкового взаимодействия.

Introduction

650 000 белок-белковых взаимодействий, по оценкам, существуют в человеческом интерактома, играющих важнейшую роль в поддержании нормальной функции клеток ^1,2. Кроме того коиммунопреципитации (со-IP) золотым стандартом для изучения белок-белковых взаимодействий от клеточного лизата, несколько анализов фрагмент белка дополнения (СПС) были разработаны для повышения чувствительности для обнаружения белок-белковых взаимодействий внутри клеток ^3. Методы включают Ферстер резонансный перенос энергии (лад), биолюминесценция резонансный перенос энергии (BRET) и флуоресценции Бимолекулярные Комплементация (BiFC) ^4,5. BiFC основана на облегченных объединение двух фрагментов флуоресцентный белок (здесь используется Венеры вариант YFP), которые каждый слитый с потенциальными партнерами взаимодействующих белков (в данном примере мы используем AKAP-Lbc и PDE4D3). Взаимодействие этих двух белков интерес внутри клеток приводит к функциональным флуоресценции, которые могут быть визуализированы еluorescence микроскопии с использованием прямой трансляции или в фиксированных клетках ^6,7,8. По сравнению с другими СПС, BiFC чувствительны и менее технически сложных, с потенциалом для изучения клеточной локализации в живых клетках. Основным недостатком этого метода, однако, что как только образуется, флуоресцентный комплекс белок не может быть отменено. Поэтому это не является хорошим методом для изучения динамических белок-белкового взаимодействия. В данной работе мы используем BiFC для отображения взаимодействия сайтах PDE4D3 с AKAP-Lbc путем мониторинга интенсивности флуоресценции Венеры. По сравнению с традиционным анализом с помощью флуоресцентной микроскопии, которое является длительным и трудоемким (если не осуществляется с использованием автоматизированной машины высокой пропускной способностью), проточной цитометрии обеспечивает простой количественного анализа тысяч клеток в гетерогенную популяцию в течение короткого времени ^{9, 10.} Здесь, путем проведения бок-о-бок сравнение проточной цитометрии-BiFC анализ и традиционных со-IP, мы показали, что две мethods представления сопоставимых данных, однако, проточной цитометрии BiFC анализ менее трудоемким и требует меньше материала, который может быть более полезным, когда клетки интерес ограничены.

Protocol

1. Трансфекции клеток

1. Пластина клеток за день до трансфекции, покрытие меньше клеток для иммунофлюоресценции.
   1. Для иммунофлюоресценции: в 6-луночный планшет, пальто скользит стеклянной крышкой (1 на лунку) с 0,02% желатина при 37 ° С в течение не менее 4 часов, мыть один раз средой, и для каждой скважины, знаки 1 х 10 ⁵ НЕК 293Т клеток в 2 мл полной среды роста [среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с 10% FBS].
   2. Для проточной цитометрии и Вестерн-блоттинг: пластина 1,2 х 10 ⁵ НЕК-293Т клеток / лунку в 2 мл полной среды роста в 6-луночный планшет (0,3 х 10 ⁵ НЕК-293Т в 0,5 мл полной среды роста на лунку в 24-луночный планшет ).
2. Подготовка ДНК для трансфекции в соответствии с протоколом изготовителя: Effectene (Qiagen) используется для иммунофлюоресценции. Транзит-LT1 (Mirus) используется для проточной цитометрии и Западной блоттинга. Количество ДНК использовали приведена ниже. <tD>

   24-луночный планшет (нг)	6-луночный планшет (нг)
   CFP-вектор	10	50
   В.Н. N-AKAP-Lbc	200	1000
   VC-N PDE4D3-ФЗ (полнометражный PDE4D3)	2,5, 5, 10, 20, 40, 80	100
   VC N-PDE4D3-UCR1 (PDE4D3 N-концевого фрагмента, содержащего UCR1 домен)		100
   VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (PDE4D3 С-концевой фрагмент, содержащий UCR2 и каталитические домены)		100

   Трансфекция использованием Effectene (6-а)
   1. Добавить указанным количеством плазмидной ДНК + 4 мкл энхансера к 100 мкл буфера EC, перемешивают, и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.
   2. Добавьте 5 мкл Effectene, перемешать, и инкубировать в течение 10 мин прикомнатной температуре. Добавить по каплям к клеткам.
   Трансфекции с использованием транзитного LT1 (6-well/24-well):
   1. Добавить указанным количеством плазмидной ДНК в 250 мкл μl/50 Opti-MEM I бессывороточной среде в стерильную пробирку.
   2. Добавить Транзит-LT1 реагента к разбавленной смеси ДНК и пипеткой осторожно перемешать. (Транзит-LT1 реагент: ДНК соотношение 3 мкл Транзит-LT1 реагента на 1 мкг ДНК).
   3. Выдержите в течение 30 мин при комнатной температуре и добавляют по каплям к клеткам.

2. Подготовка клеток для проточной цитометрии, вестерн-блот и Иммунофлуоресценция

1. 24 ч после трансфекции, проверьте флуоресценции под микроскопом эпифлуоресцентной до уборки клеток.
2. Сотовые подготовки к проточной цитометрии:
   1. Вымойте клеток с 0,5 мл / 2 мл ледяной PBS для пластин 24-well/6-well.
   2. Отделить клетки с использованием 50 мкл μl/250 0,05% трипсина.
   3. Нейтрализовать трипсин 200 мкл / 1 мл DMEM среде.
   4. Collect 250 мкл клеток (как для 24-и и 6-луночный планшет) центрифугированием при 500 х г в течение 5 мин, используя оставшиеся клетки (1 мл) в течение Вестерн-блоттинга.
   5. Ресуспендируют клеток в 250 мкл буфера FACS [PBS + 0,5% (вес / объем) БСА + 2 мМ ЭДТА], хранить на льду в течение проточной цитометрии. Клетки также может быть установлена ​​в 1% параформальдегида (в ФБР), если анализ проточной цитометрии не будет немедленным.
3. Клеточный препарат для вестерн-блоттинга: осуществляется параллельно с подготовкой к клетке анализа потока цитометрии.
   1. Мытье клетки 1x с 2 мл ледяного PBS, клетки лизируют путем добавления 100 мкл буфера для лизиса клеток [10 мМ натрий-фосфатным буфером, рН 6,95, 150 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 5 мМ EGTA, 1% Тритон Х-100] .
   2. Сбор клеточного лизата центрифугированием в течение 10 мин при 21000 х г при 4 ° С.
   3. Количественно концентрации белка с помощью анализа на протеин по Брэдфорду, нагрузка равные количества белка на полосу для SDS-PAGE и перенос т на нитроцеллюлозные для иммуноблоттинга.
   </OL>
   4. Сотовые подготовка к иммунофлюоресценции.
      1. Промыть клетки 3 раза по 2 мл PBS, фиксируют клеток в 1 мл 3,7% параформальдегида (в PBS) в течение 10 мин при комнатной температуре, затем промывают 3 раза по 2 мл PBS в течение 5 мин.
      2. Установить крышку скольжения на предметное стекло, используя монтажную среду. Печать покровного края, используя лак для ногтей, если необходимо.
      3. Хранить слайды при 4 ° С до экзамена.

   3. Проточной цитометрии и иммунофлюоресцентную микроскопию

   1. Проточная цитометрия выполняется с использованием Beckman Coulter Cyan ADP, оснащенный 488 нм, 405 нм и 642 нм твердотельные лазеры. Саммит программное обеспечение используется для сбора и анализа.
      1. Калибровка проточной цитометрии с использованием стандартных бисером.
      2. Участок прямого рассеяния (FSC) / бокового рассеяния (SSC) в линейном масштабе для стробирования живой клеточной популяции.
      3. Участок FSC / напряжения длительностью импульса стробирования неагрегированного живой клеточной популяции.
      4. Участок count/FL6 (СФП fluorescencе, 405 нм) по логарифмической шкале для стробирования неагрегированного живой CFP-положительных клеток.
      5. Участок count/FL1 (YFP флуоресценции, 488 нм) по логарифмической шкале для BiFC интенсивности.
      6. Выполнить YFP-CFP-двойных отрицательных образцов, отрегулируйте FSC, SSC, и FL1 FL6 ФЭУ (ФЭУ) напряжения для установки порога для каждого сигнала.
      7. Запуск одного положительного (как YFP + + и CFP) образцы для будущих автономно компенсации
      8. Приобрести не менее 10 000 закрытых мероприятиях (неагрегированного живой CFP + клеток) для анализа.
   2. Иммунофлуоресценция микроскопия выполняется с использованием Zeiss LSM 510 конфокальной микроскопии. Примечание: важно, чтобы все настройки (такие как зум, Пинхол, детектор усиления, смещения усилителя, размер кадра, скорость сканирования, сканирования среднего и лазерной мощности) между последовательной Образцы для правильного сравнение всех данных.

   4. Анализ данных (выполняется с помощью программного обеспечения саммита)

   1. Настройка анализа протокола, аналогичного, что для acquisitиона с надлежащей стробирования:
      Gate 1 в FSC / SSC точка участка для живых клеток.
      Gate 2 в FSC / ширина импульса для ворот 1 неагрегированного живых клеток.
      Gate 3 в подсчет / CFP Ворот 3 для неагрегированного CFP + живые клетки.
   2. Компенсировать YFP и CFP сигнала с использованием YFP + + и CFP одного положительного клеток.
   3. Повторного определения отключения линий для CFP / YFP-позитивных клеток.
   4. Экспорт YFP средней интенсивности флуоресценции (MFI) из CFP + клеток в Excel для построения данных.
   5. Нормализация YFP MFI на уровни экспрессии AKAP-Lbc, PDE4D3 и управления загрузкой α-тубулина, как определено Вестерн-блоттинга.

Representative Results

Discussion

BiFC является простой и чувствительный метод для изучения белок-белковых взаимодействий. Этот метод не может быть использован для идентификации новых белок-белковых взаимодействий, однако, это особенно удобно, чтобы подтвердить белок-белковых взаимодействий внутри клетки и изучать функциональные свойства, такие, как внутриклеточной локализации белковых комплексов, отображение белок-белкового взаимодействия сайтов, а также для скрининга малых молекул / пептидов, которые могут модулировать белок-белкового взаимодействия. Потому В.Н. и VC фрагменты нефлуоресцентных, фоновой флуоресценции низкий, способствуя таким образом чувствительность этого анализа. Необходимо время для созревания / стабилизации VN-протеин-VC-белкового взаимодействия, при этом происходит задержка визуализации белок-белковых взаимодействий и оптимальное моменты времени могут, следовательно, должны быть определены эмпирически. Следует также отметить, что VN-протеин-VC-белкового взаимодействия не является обратимым, следовательно, к сожалению с текущим Венера BiFC строит этом анализе не подходит тО динамическом исследовании кинетики взаимодействия белок-белок.

Надлежащего контроля важны для BiFC анализа. Подходящий отрицательный контроль включает не взаимодействующих белков или неспецифическими пептидами в соответствующих BiFC вектор, или, если возможно, мутант, который разрушает белок-белкового взаимодействия. Пустой вектор BiFC не является хорошим управления, как это приводит к неспецифической высокой фоновой флуоресценции. Если BiFC не наблюдается в двух взаимодействующих белков, экспрессия должна быть проанализирована. Кроме того, BiFC сигнала может изменяться в зависимости от белок-белкового взаимодействия сайтов. Следует отметить, что пространственной модуляции взаимодействием В. Н. и VC также может влиять на интенсивность флуоресценции, поэтому изначально важно проводить BiFC эксперименты с использованием как С-концевой и N-концевой VN / VC экспрессирующие конструкции. Например, BiFC не может произойти, если белок-белковое взаимодействие блоков повторного ассоциирования фрагментов Венеры. Таким образом, несколько комбинаций В.Н. и VC строит Shoulбы быть проверены (т.е. как C и N слияния терминала белка).

Интенсивность флуоресценции BiFC пропорциональна силе белок-белковых взаимодействий, с более высокой интенсивностью BiFC указывает сильное взаимодействие и нижний интенсивности флуоресценции предполагая слабое взаимодействие. BiFC MFI, следовательно, используется как индикатор для белок-белкового взаимодействия. Для точного анализа белок-белкового взаимодействия BiFC, очень важно, чтобы Вестерн-блот анализ выполняется для обеспечения равного экспрессии различных конструкций и что никакие деградации белка не происходит, что может мешать правильной анализа. Лизат из тех же образцов Поэтому предпочтительно для вестерн-блот анализ, чтобы определить аналогичный экспрессии белка для всех анализируемых образцов. Кроме того, очень важно, чтобы определить соответствующее количество плазмид для трансфекции чтобы обеспечить линейное выражение и взаимодействие белков и среди этого диапазона, взаимодействие белка коррелирует шй интенсивности флуоресценции BiFC сигнала.

Низкое количество CFP плазмиду использовали в качестве маркера для успешной трансфекции, так что только CFP положительные клетки анализировали здесь. Различные флуоресцентные белки, такие как RFP могут быть использованы, чтобы минимизировать проступание между цветами ^11. Для проточной цитометрии, один позитивные клетки должны быть включены для компенсации. Если это возможно, по крайней мере 10000 CFP положительные клетки подсчитывают для обеспечения хорошего размера образца.

Таким образом, здесь показано, что соединение BiFC методологии с проточной цитометрии можно использовать как хороший показатель белок-белковых взаимодействий внутри клеток. Традиционный анализ BiFC использованием иммунофлуоресцентного микроскопа требует много времени, и размер выборки значительно ниже, чем соответствующий проточной цитометрии. Таким образом, соединение проточной цитометрии с BiFC может быть полезным для анализа белок-белкового взаимодействия, когда эффективность трансфекции является низким. В этомДоклад, мы воспользовались BiFC-проточной цитометрии для отображения взаимодействия сайтов в PDE4D3 за связывание с AKAP-Lbc. Эта техника может быть также распространена на экран для молекул или пептиды, которые могут нарушить или усилить взаимодействие белок-белок, для открытия новых лекарств ^12. Этот метод также может быть использован для изучения определенных физиологических событий, таких как лиганд-индуцированной интернализации ¹³ GPCR автора.

Materials

<strong>REAGENTS</strong>
Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM)	Invitrogen	11965-092
Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x	Invitrogen	15070-063
Fetal Bovine Serum (FBS)	Invitrogen	16000-044
Anti-Flag antibody	Sigma	M2, F1804
Anti-HA antibody	Covance	16B12, MMS-101R
α-tubulin	Sigma	DM1A, T9026
Anti-GFP antibody	Clontech	632569
Cell culture plates, 6-well tissue culture treated	Thermo Fisher Scientific	130184
HEK 293T cells	ATCC	CRL-11268
Maxiprep plasmid purification kit, high speed	Qiagen	12663
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x	Invitrogen	14190-144
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v)	Gibco	25300
Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining	BD Biosciences	352052
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	S74337MF
Prolong gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P-36931
Superfrost plus Microscope slides	Fisher Scientific	12-550-15
Fisherfinest premium cover glass	Fisher Scientific	12-548-5P
<strong>EQUIPMENT</strong>
CO<sub>2</sub> air-jacketed Incubator	NuAIR DH autoflow
Confocal microscope LSM510 META	Carl Zeiss, Inc
Electrophoresis and transfer unit	Biorad
Cyan ADP Flow Cytometer	Beckman Coulter