Проточной цитометрии бимолекулярного флуоресценции Комплементация: Высокая пропускная способность Количественный метод изучения взаимодействия белок-белок

Summary

Проточной цитометрии анализа флуоресценции Бимолекулярные Комплементация обеспечивает высокую пропускную количественный метод для изучения белок-белковых взаимодействий. Эта методика может применяться для отображения сайтов связывания белков и скрининга факторов, которые регулируют белок-белкового взаимодействия.

Abstract

Среди методов изучения белок-белковых взаимодействий внутри клеток, Бимолекулярные Комплементация флуоресценцию (BiFC) является относительно простым и чувствительным. BiFC основан на производство флуоресценции с использованием двух нефлуоресцентные фрагменты флуоресцентный белок (Венерой, желтый флуоресцентный вариант белка, используется здесь). Номера флуоресцентный Венера фрагментов (VN и VC) сливают с двух взаимодействующих белков (в данном случае, AKAP-Lbc и PDE4D3), что дает флуоресценции из-за VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 взаимодействие и формирование функциональный флуоресцентный белок внутри клеток.

BiFC предоставляет информацию о внутриклеточной локализации белковых комплексов и сила белковых взаимодействий на основе интенсивности флуоресценции. Тем не менее, BiFC анализа с использованием микроскопии для количественной оценки силы белок-белковых взаимодействий отнимает много времени и несколько субъективным из-за гетерогенности экспрессии белка и взаимодействия. Объединяя проточной цитометрииАнализ с методологией BiFC, BiFC флуоресцентный белок-белковое взаимодействие сигнал может быть точно измерена для большого количества клеток в течение короткого времени. Здесь мы демонстрируем применение этой методологии для сопоставления регионов PDE4D3, которые необходимы для взаимодействия с AKAP-Lbc. Эта высокая пропускная способность методика может быть применена к скрининг факторов, которые регулируют белок-белкового взаимодействия.

Introduction

650 000 белок-белковых взаимодействий, по оценкам, существуют в человеческом интерактома, играющих важнейшую роль в поддержании нормальной функции клеток ^1,2. Кроме того коиммунопреципитации (со-IP) золотым стандартом для изучения белок-белковых взаимодействий от клеточного лизата, несколько анализов фрагмент белка дополнения (СПС) были разработаны для повышения чувствительности для обнаружения белок-белковых взаимодействий внутри клеток ^3. Методы включают Ферстер резонансный перенос энергии (лад), биолюминесценция резонансный перенос энергии (BRET) и флуоресценции Бимолекулярные Комплементация (BiFC) ^4,5. BiFC основана на облегченных....

Protocol

1. Трансфекции клеток

1. Пластина клеток за день до трансфекции, покрытие меньше клеток для иммунофлюоресценции.
   1. Для иммунофлюоресценции: в 6-луночный планшет, пальто скользит стеклянной крышкой (1 на лунку) с 0,02% желатина при 37 ° С в течение не менее 4 часов, мыть один раз средой, и для каждой скважины, знаки 1 х 10 ⁵ НЕК 293Т клеток в 2 мл полной среды роста [среды Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с 10% FBS].
   2. Для проточной цитометрии и Вестерн-блоттинг: пластина 1,2 х 10 ⁵ НЕК-293Т клеток / лунку в 2 мл полной среды роста в 6-луночный планшет (0,3 х 10 ⁵ НЕК-293Т в 0,5 мл полной среды роста на лу....

Results

AKAP-Lbc PDE4D3 и конструкции (рис. 1Б) были слиты с В.Н. и VC фрагменты, соответственно. Взаимодействие AKAP-Lbc PDE4D3 и приводит к функциональным YFP флуоресценции (рис. 1А). Здесь мы используем метод BiFC к карте AKAP-Lbc-связывающие сайты в PDE4D3. Upstream консервативная область 1 (UCR1), вверх по течению консервативной области 2 (UCR2) и каталитической области (КПП) являются консервативными ФДЭ4 белков семейства, поэтому, полная длина (Флорида), UCR1 и UCR2 Plus Кат были использо.......

Discussion

BiFC является простой и чувствительный метод для изучения белок-белковых взаимодействий. Этот метод не может быть использован для идентификации новых белок-белковых взаимодействий, однако, это особенно удобно, чтобы подтвердить белок-белковых взаимодействий внутри клетки и изучать функциональные свойства, такие, как внутриклеточной локализации белковых комплексов, отображение белок-белкового взаимодействия сайтов, а также для скрининга малых молекул / пептидов, которые могут модулировать белок-белкового взаимодействия. .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Dulbecco’ s модифицированный Eagle’ s media (DMEM)	Invitrogen	11965-092
Penicilin-Streptomycin (pen/strephip), 100x	Invitrogen	15070-063
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Invitrogen	16000-044
Anti-Flag антитело	Sigma	M2, F1804
Anti-HA антитело	Covance	16B12, MMS-101R
α-тубулин	Sigma	DM1A, T9026
Anti-GFP антитела	Clontech	632569
Клеточные культуральные планшеты, 6-луночная культура тканей обработана	Thermo Fisher Scientific	130184
HEK 293T клетки	ATCC	CRL-11268
Maxiprep набор для очистки плазмид, высокоскоростной	Qiagen	12663
Dulbecco’ s Фосфатно-солевой буфер (DPBS), стерильный 1x	Invitrogen	14190-144
Трипсин-ЭДТА, 0,05% (по массе)	Gibco	25300
Полистирольные трубки с круглым дном для окрашивания FACS	BD Biosciences	352052
параформальдегидом	Fisher Scientific	S74337MF
Продлить действие золотого реагента против выцветания с DAPI	Invitrogen	P-36931
Superfrost плюс предметные стекла для микроскопа	Fisher Scientific	12-550-15
Fisherfinest премиальное защитное стекло	Fisher Scientific	12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 инкубатор с воздушной рубашкой	NuAIR DH автопоточный
конфокальный микроскоп LSM510 META	Carl Zeiss, Inc
Устройство для электрофореза и переноса	Biorad
Cyan ADP Flow Cytometer	Beckman Coulter