Методическая статья

Измерение экономического роста и динамика экспрессии генов опухолей, ориентированные

DOI:

10.3791/50540

⸱

6 июля 2013 г.

 ,  ,  , 
1Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego , 3Biocircuits Institute, University of California, San Diego , 4Molecular Biology Section, Division of Biological Science, University of California, San Diego , 5Broad Institute of Harvard and MIT, 6Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 7Electrical Engineering and Computer Science and David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 8Howard Hughes Medical Institute

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этих экспериментов является получение количественных временных данных курса на рост и динамику экспрессии гена ослабленного С. Typhimurium Бактериальных колоний, выросших внутри опухолей. Это видео покрывает опухоли клеточный препарат и имплантацию, бактерии подготовки и инъекции, всего животного люминесценции изображений, удаления опухоли и бактериальных подсчетом колонии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этих экспериментов является получение количественных временных данных курса на рост и динамику экспрессии генов ослабленных С. Typhimurium бактериальных колоний, выросших внутри опухолей.

Мы создали модель ксенотрансплантатом опухолей у мышей путем подкожной инъекции линии человеческих клеток рака яичников, OVCAR-8 (NCI УСПД Опухоль репозиторий, Фредерик, MD).

Мы превратили ослабленные штаммы S. Typhimurium бактерий (ELH430: SL1344 phoPQ-1) с конститутивной выразил люциферазы (luxCDABE) плазмиды для визуализации 2. Эти штаммы специально колонизировать опухолей, оставаясь по существу невирулентного к мыши 1.

После измеримых опухолей были созданы, бактерии вводили внутривенно через хвостовую вену с различной дозировкой. Опухоль локализованный, бактериальной экспрессии гена контролировать в реальном времени в течение 60 часов с использованиемВ естественных изображений системы (IVIS). В каждый момент времени, опухоли вырезали, гомогенизировали и высевают на чашки с количественной бактериальных колоний для корреляции с данными экспрессии генов.

Вместе эти данные дает количественную меру в естественных условиях роста и динамика экспрессии генов бактерий, растущих внутри опухолей.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синтетическая биология шло быстрыми темпами в течение последнего десятилетия и в настоящее время намеревается повлиять важных проблем в энергии и здоровья. Тем не менее, экспансия в клинической практике была замедлена проблемы безопасности и отсутствие разработки проектно критериев в естественных генетических схем. Высокочастотное ускоряющее воздействие медицинских приложений потребует использования методов, которые взаимодействуют напрямую с медицинской инфраструктуры, генетических схем, которые функционируют за пределами контролируемых условиях лаборатории, и безопасным и клинически принято микробными хозяевами.

Число штаммов были исследованы для лечения рака из-за их способности расти преимущественно в опухолях. К их числу относятся C. Новый, кишечная палочка, В. cholorae, Б. лонгум и С. Typhimurium 3-8. С. Typhimurium вызвал особый интерес, поскольку они выставлены безопасности и толерантности в ряде клинических испытаний на человеке 9-12. Эти bacteri первоначально показали создать противоопухолевый эффект посредством стимуляции иммунной системы хозяина и истощением питательных веществ, необходимых для рака клеточного метаболизма. Производство лечебно груза была добавлена ​​позднее с помощью генной модификации. Хотя эти исследования представляют важные достижения в использовании бактерий для лечения опухолей, большинство существующих усилий полагались на высоком уровне выражения, которое обычно приводит к поставке высоких дозах, и от ворот эффекты и развитие устойчивости хозяина 13-16 .

Теперь, синтетическая биология может добавить производство программируемых грузов за счет использования вычислительных разработанные генетические схемы, которые могут выполнять расширенный зондирования и доставки 17-20. Эти схемы могут быть разработаны, чтобы действовать в качестве системы доставки, которые воспринимают опухоли специфические стимулы и саморегулирование груз производства по мере необходимости. Тем не менее, изучение функций этих схем в естественных условиях до сих пор было сложно.

ve_content "> Поскольку плазмиды общей основы для синтетических схем, мы опишем метод для характеристики динамики на основе плазмиды экспрессии генов в естественных условиях использования модели мыши. Эти методы используют покадровой визуализации люминесценции и количественного измерения биораспределении. Вместе эти подходы обеспечивают основу для изучения на основе плазмиды сетей в естественных условиях для клинического применения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка клеток

  1. Прохождение клеточных линий с использованием стандартных методов культуры клеток. В этом эксперименте мы использовали OVCAR-8 клеток (NCI УСПД Опухоль репозиторий, Фредерик, MD). Рост клеток в целевой слияния 80 - 100%.
  2. Клетки инкубируют с 5 мл трипсина в течение 5 мин, затем добавляют 5 мл RPMI среда + FBS для инактивации трипсина.
  3. Урожай и граф клеток на гемоцитометра. Ресуспендируют в фенолового красного DMEM в целевой концентрации 5 × 10 7 клеток / мл или приблизительно 200 мкл на колбу.
  4. Добавьте 15% скидкой Матригель фактора роста (BD Biosciences) и держать клеточной суспензии на льду до имплантации.

2. Имплантации опухоли

  1. Обезболить 4-недельных самок на NCR / Nu мышей с использованием 3% изофлурана и ждать примерно 5 мин для обеспечения глубокого наркоза. Используйте ветеринару мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
  2. Загрузите клеток (100 мкл на опухоль) в 1 мл шприц и присоединить 27 1/ 2 иглы.
  3. Для каждого из двух двусторонних задних инъекции сайты фланг, снять кожу осторожно пинцетом, чтобы сделать палатку и вводят клетки у основания. Будьте осторожны, не проникает слишком глубоко, производства крови. Используйте пинцет, чтобы мягко удалить шприц без брызг.
  4. Мониторинг роста опухоли ежедневно в течение 10 - 20 дней, пока опухоль диаметром 2 - 4 мм не будет достигнута.

3. Бактерии подготовка

  1. Начать ночной культуры бактерий в 3 мл LB + ампициллин СМИ от -80 C со морозильнике или в холодильнике тарелку. В этом эксперименте мы использовали С. Typhimurium штамм ELH430 (SL1344 PhoPQ-AroA-).
  2. Утром, развести 1:100 культуры в фильтруется LB и вырасти до OD 600 0,4 - 0,6.
  3. Спин вниз и промыть 3 раза в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) и ресуспендируют в конечной OD600 0,1 (приблизительно 1 × 10 7 клеток / мл).

4. Бактерии инъекций

  1. Обезболить животныхD положение на боку с хвостом по направлению к своей доминирующей рукой. Используйте ветеринару мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
  2. Разбавить хвостовую вену использованием теплой воды или тепла лампы.
  3. Загрузите бактерий (100 мкл на мышь) в 1 мл шприц и согнуть кончик чуть менее 90 градусов.
  4. Совместите наконечник шприца с хвостовой вены, проникают на небольшую глубину (не должен чувствовать никакого сопротивления), и ввести бактерий. Соблюдайте кровотока смещения для успешной инъекции.

5. Мышь изображений

  1. Обезболить животных в индукции камеры затем поместить каждую мышь на изображение платформы. Используйте ветеринару мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом. Поддержание точного позиционирования для обеспечения количественных результатов между временными точками.
  2. Изображения животных с использованием спектра IVIS изображений (суппорт Life Sciences). Если изображение более 1 животного, место световые барьеры между ними, чтобы предотвратить перекрестное иллюзиюДИСКРИМИНАЦИИ. Животные должны быть отображены первые на брюшной стороне, чтобы подтвердить локализацию бактерий.
  3. Изображение животных дорсально использованием IVIS каждые 2 ч в течение продолжительности эксперимента (36 часов). Создание временной ход для данной ROI.

6. Количественная Бактериальные Биораспределение

  1. Усыпить животных с использованием CO 2 и место на спине с помощью абсорбирующих подгузников.
  2. Поверните животных, чтобы выставить двух задних фланг подкожных опухолей. Вырезать окружающие ткани кожи для отделения и удаления опухолей. Холдинг опухоли с помощью пинцета, удалить кожу с помощью обратного движения ножницами. Когда большинство кожи был отделен, полностью удалить опухоль с помощью пинцета.
  3. Поместите органов в предварительно взвешенный микроцентрифужные пробирки. Поскольку масса эти трубы могут существенно важно предварительно взвешивают для количественных результатов.

7. Количественная Бактериальные Биораспределение

  1. Для каждого момента времени, акцизов и весят опухолей.
  2. Добавить 500 мкл PBS + 15% глицерина и гомогенизировать использованием Tissue-Tearor (BioSpec). Промыть 3 раза гомогенизатором с этанолом между выборками.
  3. Создать серийные разведения и пластины для подсчета бактериальных колоний. К пластине нескольких разведений на одной пластине использовать предварительно секционного пластин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя этот протокол, мы можем сгенерировать данные в естественных условиях экономического роста и динамика экспрессии генов опухолевой целевых бактерий. Общий рабочий процесс приведены на рисунке 1.

На первом этапе мы вводим бактерий (зеленый) и изображение животного с использованием IVIS для измерения экспрессии генов с свечения (синий) в качестве репортера.

Затем, на втором этапе акцизной, гомогенизации, и пластина опухолей для под...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя эту процедуру, мы способны генерировать время курсов для роста и динамики экспрессии генов бактерий колонизации опухолей. В то время как эти измерения выполняются в плановом порядке в пробирке в периодической культуре или микрофлюидики устройств, они гораздо труднее выполнять в естественных условиях.

Есть несколько модификаций, которые могут быть применены к этих методов. В то время как мы использовали OVCAR-8 клеточной линии для получения нашей модели мыши, ряд д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Х. Флеминг критического чтения и редактирования рукописи. Эта работа была поддержана Misrock Докторантура стипендий (TD) и NDSEG стипендий (AP). ШНБ следователь HHMI.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шприц 1 млBD Biosciences309602
3/10 мл Инсулиновый шприцBD Biosciences309301
иглой PrecisionGlide BD Biosciences301629
RPMI Medium 1640 (1X), жидкий, с L-глутаминомInvitrogen11875-119
АмпициллинSigma AldrichA0166-5G
LB Агар БульонSigma AldrichL2897
Бульон Лурия-БертаниBD Biosciences244610

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers. Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).
  2. Leschner, S., et al. Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha. Plos One. 4 (8), (2009).
  3. Min, J. J., et al. Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals. Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).
  4. Min, J. J., et al. Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli. Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).
  5. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).
  6. Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).
  7. Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).
  8. Ozbudak, E. M., et al. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).
  9. Elowitz, M. B., et al. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
  10. Toso, J. F., et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).
  11. Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).
  12. Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).
  13. Guo, H., et al. Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi. Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).
  14. Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).
  15. Nguyen, V. H., et al. Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer. Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).
  16. Zhao, M., et al. Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice. Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).
  17. Danino, T., et al. A synchronized quorum of genetic clocks. Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).
  18. Anderson, J. C., et al. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
  19. Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
  20. Prindle, A., et al. A sensing array of radically coupled genetic 'biopixels'. Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).
  21. Xu, D. Q., et al. Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy. Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).
  22. Zheng, L. M., et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector. Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).
  23. Kim, K., et al. A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS. Plos One. 8 (3), e60511(2013).
  24. Prindle, A., et al. Genetic Circuits in Salmonella typhimurium. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  25. Danino, T., et al. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  26. Zhao, M., et al. Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vivoIVIS

Похожие статьи