Method Article

Выделение сенсорных нейронах Aplysia саЩогтса Для патч зажим Recordings глутаматергической Токи

DOI:

10.3791/50543

⸱

July 10th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Division of Marine Biology and Fisheries, Rosenstiel School of Marine and Atmospheric Sciences, University of Miami

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем рассечение нервной системы морской морской заяц Aplysia После наркоза, изоляция нейронов на короткий срок-культуре тканей, и записи одной ячейки ионных токов через технику зажим патч.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Морских брюхоногих моллюсков Aplysia саЩогтса имеет почтенную историю как модель нервной системы, при этом особое значение в исследованиях обучения и памяти. Типичные препараты для таких исследований являются те, в которых сенсорных и двигательных нейронов остаются нетронутыми в минимально расчлененный животного или технически сложные нейронные совместное культивирование индивидуальных сенсорных и моторных нейронов. Менее распространенной является изолированной нейронной препарат, в котором небольшие группы номинально однородные нейроны распадается на отдельные клетки в краткосрочной перспективе культуры. Такие изолированные клетки могут быть использованы для биофизические характеристики ионного тока использованием патч зажим методы, а также целевые модуляции этих проводимостей. Методике получения таких культур описано. Протокол использует легко идентифицировать глутаматергические сенсорными нейронами плевральной и щечной ганглиев, и описывает их диссоциации и минимальное техническое обслуживание яРусская культура в течение нескольких дней без сыворотки.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Морских моллюсков opistobranch, Aplysia, был полезный нейробиологическое модели на протяжении многих десятилетий. Он является самым известным в качестве модели привыкания и классического кондиционирования 7, 8. Исследования в области обучения и памяти в этой модели получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 2000 году Эрик Р. Кандель, в выигрыше он поделился с Арвид Карлссон и Пол Грингард 10. Исследования с участием электрических записей с пониженной препараты, в которых элементы нервной системы беспозвоночных этого расчленены от животного с нервами и мышцами оставлена ​​на устройстве, помогли выяснения роли отдельных нейрон....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка клеток

  1. В день 1 взвесить и обезболить животное.
    1. Взвесить 30 г-1 кг животного. Обезболить в 5-10 объемами животное 1:01 морской воды: изотонический MgCl. 6H 2 0 в течение 1 ч при аэрации, такие как электрический воздушный насос аквариум с прикрепленными распылитель.
  2. Подготовьте рассечение поставок.
    1. Соберите чистых рассечение лоток из нержавеющей стали прямые контакты, такие как ткани булавками. Сборка несколько чашек Петри содержащие искусственной морской воде (ASW; см. таблицы 1 и 3) + пенициллина / стрептомицина (P / S).
    2. Подготовьте низкого силового ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Места расположения сенсорных нейронов в ганглии, которые ориентированы в данном протоколе, КБС и ПВХ нейронов показаны на рисунке 1. BSC нейронов расположены в 2 симметричных овальных кластеров на брюшной стороне ротовой ганглий, поверхность, которая обращена от щечной массы в неповрежденной ганглиев (рис. 1А). ПВХ нейроны формируют двусторонние, V-формы кластеров, которые обертывают вокруг спинной поверхности плевральных ганглиев к центральной оси (рис. 1В). Эти сенсор.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Диссоциации описанные здесь методы получения сенсорных нейронов культур содержащие 50-100 изолированных нейронов перемежаются с небольшими числами глии и других неустановленных клеток. Наиболее важным шагом в протоколе являются время ганглии оставаться в растворе фермента, и щелкая, диссоциацию расщепленной кластеры клеток разбиваются на части кластера на отдельные клетки. Фермент пищеварение (шаг 1.8) должны быть оптимизированы на доступные температуре. При 23 ° С при медленном встряхивании 13 часов достаточно для пере.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансируемых NIH P40 OD010952, Korein Фонда, Университета Майами стипендий для SLC и Maytag стипендию ATK. Авторы выражают благодарность сотрудникам Национального Ресурс для Aplysia, а также Лорен Simonitis и Ханна Пек, который предоставил микрофотографии для фигуры.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Искусственная морская вода ASWSigma-Aldrichассорти(мМ): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7,6
Внутриклеточный растворSigmaассорти(мМ): 450 KCl, 2,9 CaCl<суб>2 (2 H<суб>2O), 2,5 MgCl<суб>2 (6 H<суб>2O), 5 Na<суб>2АТФ, 10 EGTA и 40 HEPES-KOH, pH 7,4
поли-D-лизинSigmaP6407 
пенициллин/стрептомицин добавлен в ASW в 1:100Lonzo Walkersville, Inc.17-603E5 000 ЕД/мл пенициллин плюс 5 000 мг/мл стрептомицина
нейтральная диспаза IIRoche Diagnostics10165859001 
гиалуронидазаSigma-AldrichH4272 
коллагеназа типа XISigma-AldrichC9407 
L-глутамат (L-Glu)Sigma-Aldrich49601-100G 
D-аспартат (D-ASP)Sigma-Aldrich11200-10G 
N-метил-D-аспартат (NMDA)Biomol100002-268 
L-ASPSigmaA6683-25G 
альфа-амино-3-гидроксил-5-метил-4-изоксазол-пропионовая кислота (AMPA)SigmaA6816-5MG 
Антагонисты L-Glu Rразличныеразличные 
Агар 
кинуренатСигма-Олдрич61250 
APVSigma-AldrichA5282 
DL-2-амино-5-фосфонопентановая кислота (антагонист NMDAR) 
2-пропанолВВРСПBDH1133 
Раствор хлораSigmaассорти25 г FeCl3 + 25 мл концентрированный HCl + 50 мл H2O
Силикон 2-х компонентный полимерWorld Precision Instruments (WPI)SYL184Обеспечивает поверхность распиновки для небольших посудин для препарирования
микроскоп с 0-40-кратным увеличением для препарированияWild 
Волоконно-оптический осветитель Techniquip 150 Втмикрооптики ФлоридыTQ FOI-150 
RotoMix 50800 
Инвертированный фазово-контрастный микроскоп Nikon Diaphot с объективами 4x, 20x (опционально) и 40xSR Research Ltd.Eyelink II 
Цифровой осциллограф TektronixSR Research Ltd. 
Программное обеспечение для сбора и анализа данных pClamp 10Molecular Devices 
ПК с операционной системой Windows XP или вышеРешениядля ПК Thinkserver с твердотельными жесткими дисками (80 ГБ) и мониторами с низким уровнем шума
Flaming/Brown P87 микропипеткаSutter Instruments, Novato, CA 
Axon Instruments Axopatch 200B зажимной усилитель с диапазоном компенсации емкости 1-1000 пФ; предусилительMolecular Devices, Sunnyvale, CA 
Axon instruments электрододержатель в сборе для предусилителя Axopatch 200BMolecular Devices, Саннивейл, КалифорнияCV203BU 
Digidata 1200 Аналого-цифровой преобразовательMolecular Devices, Саннивейл, Калифорния
Picospritzer, работающий от N2, регулируемый по давлению и продолжительностиParker Hannifin, Cleveland, OH 
TMC Micro-G Виброизоляционный столAmetek 
Фарадеяна заказ
пьезоэлектрические раскладушки, микроманипуляторыBurleigh, инструменты; Thorlabsв настоящее время PCS-5000; -6000 series + крепления
Narishige M-152 ручные манипуляторы (для перфузионных систем и пикоспритцеров)Narishige США 
Стекло для пипетки с нитью, внешний диаметр 1,5 мм, внутренний диаметр 0,84 мм -WPI1B150-3 
Длина 
Ag/AgCl полуклеточныйWPIEP4 
Центрифужные пробирки 15 мл, 35-2097 BD Falcon* Центрифужные пробиркиVWRSP21008-918 
Угловые ножницыFine Science Tools15006-09 
Тонкие щипцы DumostarFine Science Tools11295-00 
Чашки для культуры тканей сокола 35 ммVWRSP25382-064 
Чашки для культивирования тканей falcon 150 x 25 мм; 1013VWRSP1013также могут быть изготовлены в небольшие чашки для препарирования с помощью sylgard
sylgardWPISYL184 
Лоток для вскрытия животныхразличный 
Центрифужные пробирки 15 мл, 35-2097 BD FalconVWRSP21008-918Для 6-литровой перфузионной системы с гравитационной подачей
Алюминиевые зажимы с винтовыми отверстиями на концаххозяйственного магазинаДля перфузионной системы
иглы 23 калибра (вручную подпиливайте точки)VWRSPДля перфузионной системы
Полиэтиленовая трубка 0,022"ID x 0,042"OD; 427411Becton-DickinsonДля перфузионная система
H-7 подставка/держатель для пипетки microcap perfusion arrayNarishige СШАДля перфузионной системы
односторонние клапаныДля перфузионной системы
Drummond Microcaps 1 μ lVWRSPДля перфузионной системы
иглы 18 калибра для отсасывания (подпиленные точки) 
Полиэтиленовая трубкаCole Parmer4.27436E+11 
штифты для тонкого препарированияFine Science Tools26002-20 
капиллярные трубкиKimble 71900-100отполированные огнем и-образные в пламени горелки Бунзена и заполненные 3% агаром в
лепки из пластилина 
держатель чашки для предметного столика с изолированной ванной
на заказ пастеровские пипеткиVWRSP14672-412 
лампы для пипетокVWRSP53283-911 
акродисковые шприцевые фильтрыVWRSP28144-040 
толстостенное боросиликатное стекло диаметром 1,5 ммWPI1B150F-3 
Баллон с азотом высокой чистоты и разветвляющий регулятор 

Tables 1-3. Перечни реактивов, материалов и оборудования.

Орбитальный смеситель Клетка , 3 дюйма магазине ECS, изготовленные

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
  2. Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sensory Neuron IsolationAplysia CalifornicaPatch Clamp RecordingsGlutamatergic CurrentsGanglion DissectionEnzymatic DigestionCell DissociationCulture Dish PreparationVoltage ClampingNeural Culture Maintenance

Related Articles