Мы описываем рассечение нервной системы морской морской заяц Aplysia После наркоза, изоляция нейронов на короткий срок-культуре тканей, и записи одной ячейки ионных токов через технику зажим патч.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Морских брюхоногих моллюсков Aplysia саЩогтса имеет почтенную историю как модель нервной системы, при этом особое значение в исследованиях обучения и памяти. Типичные препараты для таких исследований являются те, в которых сенсорных и двигательных нейронов остаются нетронутыми в минимально расчлененный животного или технически сложные нейронные совместное культивирование индивидуальных сенсорных и моторных нейронов. Менее распространенной является изолированной нейронной препарат, в котором небольшие группы номинально однородные нейроны распадается на отдельные клетки в краткосрочной перспективе культуры. Такие изолированные клетки могут быть использованы для биофизические характеристики ионного тока использованием патч зажим методы, а также целевые модуляции этих проводимостей. Методике получения таких культур описано. Протокол использует легко идентифицировать глутаматергические сенсорными нейронами плевральной и щечной ганглиев, и описывает их диссоциации и минимальное техническое обслуживание яРусская культура в течение нескольких дней без сыворотки.
Введение
Морских моллюсков opistobranch, Aplysia, был полезный нейробиологическое модели на протяжении многих десятилетий. Он является самым известным в качестве модели привыкания и классического кондиционирования 7, 8. Исследования в области обучения и памяти в этой модели получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 2000 году Эрик Р. Кандель, в выигрыше он поделился с Арвид Карлссон и Пол Грингард 10. Исследования с участием электрических записей с пониженной препараты, в которых элементы нервной системы беспозвоночных этого расчленены от животного с нервами и мышцами оставлена на устройстве, помогли выяснения роли отдельных нейрон....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка клеток
- В день 1 взвесить и обезболить животное.
- Взвесить 30 г-1 кг животного. Обезболить в 5-10 объемами животное 1:01 морской воды: изотонический MgCl. 6H 2 0 в течение 1 ч при аэрации, такие как электрический воздушный насос аквариум с прикрепленными распылитель.
- Подготовьте рассечение поставок.
- Соберите чистых рассечение лоток из нержавеющей стали прямые контакты, такие как ткани булавками. Сборка несколько чашек Петри содержащие искусственной морской воде (ASW; см. таблицы 1 и 3) + пенициллина / стрептомицина (P / S).
- Подготовьте низкого силового ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Места расположения сенсорных нейронов в ганглии, которые ориентированы в данном протоколе, КБС и ПВХ нейронов показаны на рисунке 1. BSC нейронов расположены в 2 симметричных овальных кластеров на брюшной стороне ротовой ганглий, поверхность, которая обращена от щечной массы в неповрежденной ганглиев (рис. 1А). ПВХ нейроны формируют двусторонние, V-формы кластеров, которые обертывают вокруг спинной поверхности плевральных ганглиев к центральной оси (рис. 1В). Эти сенсор.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Диссоциации описанные здесь методы получения сенсорных нейронов культур содержащие 50-100 изолированных нейронов перемежаются с небольшими числами глии и других неустановленных клеток. Наиболее важным шагом в протоколе являются время ганглии оставаться в растворе фермента, и щелкая, диссоциацию расщепленной кластеры клеток разбиваются на части кластера на отдельные клетки. Фермент пищеварение (шаг 1.8) должны быть оптимизированы на доступные температуре. При 23 ° С при медленном встряхивании 13 часов достаточно для пере.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Финансируемых NIH P40 OD010952, Korein Фонда, Университета Майами стипендий для SLC и Maytag стипендию ATK. Авторы выражают благодарность сотрудникам Национального Ресурс для Aplysia, а также Лорен Simonitis и Ханна Пек, который предоставил микрофотографии для фигуры.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Искусственная морская вода ASW | Sigma-Aldrich | ассорти | (мМ): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7,6 |
| Внутриклеточный раствор | Sigma | ассорти | (мМ): 450 KCl, 2,9 CaCl<суб>2 (2 H<суб>2O), 2,5 MgCl<суб>2 (6 H<суб>2O), 5 Na<суб>2АТФ, 10 EGTA и 40 HEPES-KOH, pH 7,4 |
| поли-D-лизин | Sigma | P6407 | |
| пенициллин/стрептомицин добавлен в ASW в 1:100 | Lonzo Walkersville, Inc. | 17-603E | 5 000 ЕД/мл пенициллин плюс 5 000 мг/мл стрептомицина |
| нейтральная диспаза II | Roche Diagnostics | 10165859001 | |
| гиалуронидаза | Sigma-Aldrich | H4272 | |
| коллагеназа типа XI | Sigma-Aldrich | C9407 | |
| L-глутамат (L-Glu) | Sigma-Aldrich | 49601-100G | |
| D-аспартат (D-ASP) | Sigma-Aldrich | 11200-10G | |
| N-метил-D-аспартат (NMDA) | Biomol | 100002-268 | |
| L-ASP | Sigma | A6683-25G | |
| альфа-амино-3-гидроксил-5-метил-4-изоксазол-пропионовая кислота (AMPA) | Sigma | A6816-5MG | |
| Антагонисты L-Glu R | различные | различные | |
| Агар | |||
| кинуренат | Сигма-Олдрич | 61250 | |
| APV | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| DL-2-амино-5-фосфонопентановая кислота (антагонист NMDAR) | |||
| 2-пропанол | ВВРСП | BDH1133 | |
| Раствор хлора | Sigma | ассорти | 25 г FeCl3 + 25 мл концентрированный HCl + 50 мл H2O |
| Силикон 2-х компонентный полимер | World Precision Instruments (WPI) | SYL184 | Обеспечивает поверхность распиновки для небольших посудин для препарирования |
| микроскоп с 0-40-кратным увеличением для препарирования | Wild | ||
| Волоконно-оптический осветитель Techniquip 150 Вт | микрооптики Флориды | TQ FOI-150 | |
| RotoMix 50800 | |||
| Инвертированный фазово-контрастный микроскоп Nikon Diaphot с объективами 4x, 20x (опционально) и 40x | SR Research Ltd. | Eyelink II | |
| Цифровой осциллограф Tektronix | SR Research Ltd. | ||
| Программное обеспечение для сбора и анализа данных pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| ПК с операционной системой Windows XP или выше | Решения | для ПК Thinkserver с твердотельными жесткими дисками (80 ГБ) и мониторами с низким уровнем шума | |
| Flaming/Brown P87 микропипетка | Sutter Instruments, Novato, CA | ||
| Axon Instruments Axopatch 200B зажимной усилитель с диапазоном компенсации емкости 1-1000 пФ; предусилитель | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ||
| Axon instruments электрододержатель в сборе для предусилителя Axopatch 200B | Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния | CV203BU | |
| Digidata 1200 Аналого-цифровой преобразователь | Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния | ||
| Picospritzer, работающий от N2, регулируемый по давлению и продолжительности | Parker Hannifin, Cleveland, OH | ||
| TMC Micro-G Виброизоляционный стол | Ametek | ||
| Фарадея | на заказ | ||
| пьезоэлектрические раскладушки, микроманипуляторы | Burleigh, инструменты; Thorlabs | в настоящее время PCS-5000; -6000 series + крепления | |
| Narishige M-152 ручные манипуляторы (для перфузионных систем и пикоспритцеров) | Narishige США | ||
| Стекло для пипетки с нитью, внешний диаметр 1,5 мм, внутренний диаметр 0,84 мм - | WPI | 1B150-3 | |
| Длина | |||
| Ag/AgCl полуклеточный | WPI | EP4 | |
| Центрифужные пробирки 15 мл, 35-2097 BD Falcon* Центрифужные пробирки | VWRSP | 21008-918 | |
| Угловые ножницы | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| Тонкие щипцы Dumostar | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Чашки для культуры тканей сокола 35 мм | VWRSP | 25382-064 | |
| Чашки для культивирования тканей falcon 150 x 25 мм; 1013 | VWRSP | 1013 | также могут быть изготовлены в небольшие чашки для препарирования с помощью sylgard |
| sylgard | WPI | SYL184 | |
| Лоток для вскрытия животных | различный | ||
| Центрифужные пробирки 15 мл, 35-2097 BD Falcon | VWRSP | 21008-918 | Для 6-литровой перфузионной системы с гравитационной подачей |
| Алюминиевые зажимы с винтовыми отверстиями на концах | хозяйственного магазина | Для перфузионной системы | |
| иглы 23 калибра (вручную подпиливайте точки) | VWRSP | Для перфузионной системы | |
| Полиэтиленовая трубка 0,022"ID x 0,042"OD; 427411 | Becton-Dickinson | Для перфузионная система | |
| H-7 подставка/держатель для пипетки microcap perfusion array | Narishige США | Для перфузионной системы | |
| односторонние клапаны | Для перфузионной системы | ||
| Drummond Microcaps 1 μ l | VWRSP | Для перфузионной системы | |
| иглы 18 калибра для отсасывания (подпиленные точки) | |||
| Полиэтиленовая трубка | Cole Parmer | 4.27436E+11 | |
| штифты для тонкого препарирования | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| капиллярные трубки | Kimble 71900-100 | отполированные огнем и-образные в пламени горелки Бунзена и заполненные 3% агаром в | |
| лепки из пластилина | |||
| держатель чашки для предметного столика с изолированной ванной | |||
| на заказ пастеровские пипетки | VWRSP | 14672-412 | |
| лампы для пипеток | VWRSP | 53283-911 | |
| акродисковые шприцевые фильтры | VWRSP | 28144-040 | |
| толстостенное боросиликатное стекло диаметром 1,5 мм | WPI | 1B150F-3 | |
| Баллон с азотом высокой чистоты и разветвляющий регулятор | |||
Tables 1-3. Перечни реактивов, материалов и оборудования. |
Ссылки
- Buttner, N., Siegelbaum, S. A. Antagonistic modulation of a hyperpolarization-activated Cl(-) current in Aplysia sensory neurons by SCP(B) and FMRFamide. J. Neurophysiol. 90 (2), 586-598 (2003).
- Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
