Локализация и относительное количественное определение углеродных нанотрубок в клетках с помощью проточной цитометрии с мультиспектральной визуализацией

Краткое содержание

В этом исследовании основной целью было наблюдение за поглощением клетками и возможным экзоцитозом углеродных нанотрубок (УНТ). С этой точки зрения мы предложили уникальный метод с использованием проточной цитометрии с мультиспектральной визуализацией, позволяющий количественно оценить и локализовать УНТ в статистически значимом числе клеток.

Аннотация

Углеродные наноматериалы, такие как углеродные нанотрубки (УНТ), относятся к этому типу наночастиц, которые очень трудно отличить от богатых углеродом клеточных структур, и де-факто до сих пор нет количественного метода для оценки их распределения на клеточном и тканевом уровнях. Здесь мы предлагаем инновационный метод, позволяющий обнаруживать и количественно определять УНТ в клетках с помощью проточного цитометра с мультиспектральной визуализацией (ImageStream, Amnis). Это недавно разработанное устройство объединяет в себе как высокую пропускную способность клеток, так и визуализацию с высоким разрешением, обеспечивая таким образом изображения для каждой клетки непосредственно в потоке и, следовательно, статистически значимый анализ изображений. Изображение каждой клетки получают по светлопольным (BF), темнопольным (DF) и флуоресцентным каналам, что дает доступ соответственно к уровню и распределению поглощения света, рассеянного света и флуоресценции для каждой клетки. Затем анализ состоит в попиксельном сравнении каждого изображения из 7000-10000 клеток, полученных для каждого условия эксперимента. Локализация и количественное определение УНТ стали возможными благодаря некоторым особым свойствам, присущим УНТ: сильному поглощению и рассеянию света; действительно, УНТ проявляются как сильно поглощенные темные пятна на ДФ и яркие пятна на ДФ с точной колокализацией.

Эта методология может оказать значительное влияние на исследования взаимодействий между наноматериалами и клетками, учитывая, что этот протокол применим для большого количества наноматериалов, поскольку они способны поглощать (и/или рассеивать) достаточно сильный свет.

Введение

За последние десятилетия место наночастиц приобрело важное значение в широком спектре применений. В частности, углеродные нанотрубки (УНТ) все больше и больше исследуются в качестве наноинструментов для различных диагностических и терапевтических применений; Благодаря своим особым электрическим, термическим и спектроскопическим свойствам, УНТ могут выступать в качестве средств доставки различных лекарств или контрастных веществ, а также могут быть задействованы в тканевой инженерии^.

Тем не менее, опасения по поводу потенциальной токсичности таких наноматериалов все еще обсуждаются, в основном потому, что судьба УНТ в организме остается очень спорной. Действительно, отсутствуют подходящие методы для их обнаружения и количественной оценки в живых клетках и тканях: например, были предложены такие методы, как рамановская спектроскопия, фотоакустическая и фотолюминесцентная визуализация в ближнем инфракрасном диапазоне, но каждый метод имеет ограничения в зависимости от типа нанотрубок и/или их окружения^2-8.

Здесь предложенный метод может быть применим для обнаружения и количественного определения наночастиц в клетках. Это стало возможным благодаря использованию ImageStream — устройства, сочетающего в себе проточную цитометрию и визуализацию с высоким разрешением. Он сочетает в себе преимущества получения большого количества клеток (до 5000 событий/сек) и преимущества статистических данных и изображений с высоким разрешением каждой клетки одновременно (пространственное разрешение 0,5 мкм). Как правило, изображения собираются с помощью ПЗС-камеры и представляют собой двухмерное изображение ячейки в шкале серого. Свет количественно определяется для каждого пикселя на изображении и идентифицирует как интенсивность, так и расположение флуоресценции или компонентов с субклеточным размером (например, в BF), что позволяет различать клетки на основе их внешнего вида^9,10.

Цель заключалась в том, чтобы разработать нанометрологический метод, который позволил бы количественно оценить распределение и поведение УНТ в клетках. В частности, этот метод был разработан для изучения клеточного поглощения, процессинга и экзоцитоза УНТ клетками. Мы доказали, во-первых, сложный клеточный транспорт УНТ и, во-вторых, перенос этих наноматериалов между клетками: интернализованные клетками УНТ покидают клетки-хозяева при стрессе, распространяются за пределы внеклеточного пространства и реинтернализуются наивными клетками, будь они гомотипическими или гетеротипическими

.

.

Предыдущее исследование показало, что различные механизмы поглощения клеток, активные или пассивные, могут возникать в зависимости от функционализации и состояния агрегации УНТ¹². Здесь многостенные УНТ были функционализированы с помощью 1,3-дипольного циклоприсоединения и амидирования, а затем дериватизированы с помощью флуоресцентного зонда, флуоресцентного в изотиоцианате (FITC). При просвечивающей электронной микроскопии они, по-видимому, интернализуются клетками либо по отдельности с цитозольной локализацией, либо в виде пучков, в основном обнаруживаемых в эндосомальных и лизосомальных компартментах¹¹. На ImageStream кластеризованные УНТ отображаются с высокой корреляцией в виде темных пятен на BF и светлых пятен на DF, что позволяет провести четкое различие между метками с меткой CNT и контрольными клетками. С другой стороны, распределение флуоресцентного сигнала, испускаемого флуоресцентным маркером, функционализированным с помощью УНТ, не было столь хорошо колокализовано: действительно, вероятно, из-за явления гашения, зеленые флуоресцентные пятна не обязательно совпадают с пятнами на BF и DF. Это указывает на то, что, во-первых, флуоресцентный зонд не является обязательным для обнаружения УНТ с помощью ImageStream, а во-вторых - тем более - что он не является полностью репрезентативным как для количественной оценки, так и для локализации УНТ.

Помимо статистической относительной количественной оценки наночастиц, этот метод также предоставляет информацию о локализации УНТ в клетках, что означает, что он различает, например, УНТ внутри клетки от тех, которые связаны с плазматической мембраной. Возможность локализации УНТ на изображениях клеток явно преодолевает ограничения традиционного анализа проточной цитометрии¹³. Процедура была разработана здесь путем создания масок, подходящих под определенные участки клетки, а также выбора темных пятен, соответствующих нагруженным УНТ.

Вообще говоря, этот метод может быть применен для большого диапазона экспериментов, требующих визуализации или количественной оценки в клетках, при условии, что используемые наночастицы способны сильно поглощать (и/или рассеивать) свет.

Протокол

1. Получение водных диспергируемых углеродных нанотрубок (УНТ)

1. Диспергируйте первые УНТ в воде для клеточных культур, а затем обрабатывайте их ультразвуком в течение 20 мин в ультразвуковом аппарате для ванны при температуре 20 °C. Если УНТ функционализируются флуоресцентным зондом, максимально защищайте их от света на протяжении всего эксперимента.

2. Маркировка ячеек с помощью УНТ

1. Выращивайте эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) (например) на пластинах площадью 25 см² в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина стрептомицина.
2. Готовят растворы УНТ в концентрациях 0, 10, 20 и 50 мкг/мл в полной среде и инкубируют клетки при 37 °С в течение 20 ч или при 4 °С в течение 20 ч (2 мл суспензии УНТ на планшет площадью 25 см²).

3. Фиксация клеток

1. После этого удалите инкубационную среду; промойте клетки PBS, трипсинизируйте и ресуспендируйте клетки в полной среде DMEM. Центрифуга в течение 5 минут при 1 200 об/мин.
2. Замените среду сначала параформальдегидом 4% на 1 час при 4 °C, затем PBS для их сохранения. При необходимости клетки могут храниться на этом этапе процесса при температуре 4 °C в течение нескольких дней до проведения цитометрического анализа.
3. Каждый образец должен содержать около 10⁶ клеток, сконцентрированных в 50 мкл PBS. Правильно подвешивайте их, чтобы избежать скопления агрегатов во время анализа, и фильтруйте их через сетчатый морилку толщиной 50 мкм.
   Примечание: Каждый шаг должен быть выполнен очень аккуратно, чтобы сохранить клетки.

4. Получение ImageStream

Используйте многоспектральный проточный цитометр ImageStream для получения изображений клеток.
Некоторые моменты должны быть соблюдены:

1. Выберите адаптированное увеличение (здесь используется объектив 40X).
2. Если используются флуорохромы:
   - Подготовить контрольный образец без флюорохрома.
   - Подготовка клеток с одноцветным положительным контролем для каждого флуорохрома, используемого в
   Дополнение к вашим образцам.
3. Используйте лазер 488 нм для возбуждения FITC и канал 02 для сбора флуоресцентного излучения (полоса пропускания 480-560 нм). Кроме того, используйте также каналы 01 и 06 для светлого поля (BF) и темного поля (DF) соответственно.

5. Постобработка - программное обеспечение для анализа IDEAS (версия 4.0)

1. Среди всех полученных событий анализ должен быть сначала ограничен популяцией отдельных ячеек: используйте бипараметрическую точечную диаграмму, представляющую «соотношение сторон» (т.е. ширину/высоту) в зависимости от «площади ячейки» (параметры, применяемые к ячейкам на BF) (рис. 1). Одиночные клетки, включенные в интересующую область со стандартной площадью и соотношением сторон, близким к 1, затем различаются по многоклеточным событиям (большая площадь и малая сторона соотношения) и мусору (чрезвычайно малая площадь).
2. Чтобы выбрать ячейки в сфокусированной плоскости, используйте бипараметрическую точечную диаграмму, адаптированную для высококонтрастных ячеек, помеченных CNT: постройте график «контраста» в зависимости от «среднеквадратичного градиента» (который измеряет качество резкости изображения) на изображении BF - это позволяет исключить несфокусированные ячейки, показывающие как низкий среднеквадратичный градиент, так и низкий контраст в их изображениях BF (рис. 1).
3. 1. Определите параметр, который обеспечивает наилучшее статистическое разделение между помеченными и непомеченными ячейками, с помощью функции «Найти лучший признак». В нашем исследовании признаком объекта среднего пикселя является параметр, который является наиболее подходящим (рис. 2).
   2. Проследите гистограмму с использованием этого параметра в зависимости от нормализованной частоты, чтобы сравнить количество поглощенных УНТ для исследуемых концентраций (рис. 3).
   3. Проведите трассировку бипараметрического графика «среднее значение объекта в пикселях на BF» (обозначение: Mean Pixel_Object (M01,Ch01,Tight)_Ch01) в зависимости от «интенсивности на DF» (Intensity_MC_Ch06), чтобы изучить корреляцию между этими двумя параметрами (рис. 4).
4. Количественная оценка также оценивается с помощью масок:
   1. Поскольку УНТ выглядят как сильно поглощающие темные пятна на BF, сначала создайте пороговую маску, которая точно им подходит, выбрав ограниченный диапазон пикселей с низкой интенсивностью, составляющий от 0 до 533 в этом исследовании (Маска 1, обозначение: Intensity(M01, BF, 0-533)) (Рисунок 5). Выбор пороговой интенсивности производится на меченых клетках по сравнению с контрольными.
   2. И наоборот, создайте подгонку маски с пикселями высокой интенсивности (150-4095 в данном случае) DF (Маска 2, обозначение: Интенсивность (M06, DF, 150-4095)) (Рисунок 6).
   3. Постройте график с использованием площади маски (1 или 2; (обозначение: Area_Intensity(M01, BF, 0-533) для маски 1): это обеспечит относительную количественную оценку интернализации УНТ при различных концентрациях (рис. 7).
   4. Проверьте степень корреляции между этими двумя масками (благодаря бипараметрическому графику «площадь маски 1» в сравнении с «площадью маски 2») (рис. 7).
5. Создайте другие маски для локализации УНТ в ячейках:
   1. Маска, прилегающая к внутренней части ячейки: Erode(M01, 7) - соответствует маске всей ячейки (M01) (рисунок 8), которая дополнительно эродируется на 7 пикселей (рисунок 9).
   2. Маска, прилегающая к мембране только с использованием булевого уравнения: M01, а не Erode(M01,7) - маска всей клетки (M01), вычитаемая из внутренней части (Erode(M01,7)) (рис. 10).
   3. Чтобы рассмотреть темные пиксели на мембране (соответствующие УНТ), затем создайте маску: Интенсивность(M01, а не Erode(M01, 7), BF, 0-533) (Рисунок 11).
   4. Визуализируйте различные маски, примененные к коллекции ячеек, чтобы проверить их релевантность (рис. 12) для помеченных и непомеченных ячеек.
   5. Нанесите характерную область на маску, выделив черные пиксели на мембране 'Area_Intensity(M01 and not Erode(M01, 7), BF, 0-533)', так называемую черную область. Это позволит количественно определять количество УНТ на мембране.
      
      Чтобы наконец отличить УНТ, которые были интернализованы, от тех, которые адсорбированы только на мембране, построите график между черной областью на мембране и черной областью на всей клетке (т.е. «Area_ интенсивность (M01, а не Erode(M01, 7), BF, 0-533» против «интенсивности Area_ (M01, BF, 0-533)»).
      
      заметка: Тот же тип процедуры применяется и с флуоресцентным сигналом FITC: сравните увеличение интенсивности флуоресценции FITC с уменьшением среднего пиксельного сигнала на BF или колокализацией между темными пятнами на BF и интенсивностью флуоресценции FITC. В нашем случае этот тип анализа не актуален, поскольку сигнал флуоресценции неправильно согласуется с темными пятнами на ДЧ, с одной стороны, и с ярким полем на ДЧ, с другой стороны, показывая, что внутренние свойства УНТ (поглощение и рассеяние света) более адекватны, чем сигнал, связанный с флуоресцентным зондом.
6. После того, как все графики будут созданы по одному экспериментальному условию, создайте "шаблон статистического отчета", сохраните шаблон в виде файла .ast и упакуйте все файлы данных.

Результаты

Обзор принципа работы устройства ImageStream представлен на Рисунке 1. Прибор делает несколько изображений каждой клетки в потоке с высоким разрешением, включая светлое поле (BF), темное поле (DF или боковое рассеяние света) и канал(ы) флуоресценции, что продемонстрировано на Рисунке 2 на примере трех различных клеток, меченных CNTs. Также показаны наложения этих каналов, которые на первый взгляд иллюстрируют корреляцию.

Поскольку весь последующий анализ основан на визуализации клеток, выбор сфокусированных клеток имеет решающее значение для исследования (Рисунок 3). Фактически, присутствие CNT вызывает изменения как контрастности, так и градиента по сравнению с немаркированными клетками: сфокусированные клетки, интернализовавшие значительное количество CNT, имеют тенденцию к низкому среднеквадратичному (rms) градиенту (который обычно является единственным параметром, используемым для разграничения сфокусированных и несфокусированных клеток), но при этом обладают высокой контрастностью; это объясняет, почему необходим двухпараметрический график. На Рисунке 3 показано разграничение между несфокусированными (желтая область) и сфокусированными клетками (синяя область).

Интернализованные клетками CNT четко различимы — в частности, на BF они выглядят как сильно поглощающие темные пятна (см. влияние различных концентраций метки, Рисунок 4). Кроме того, был проанализирован средний сигнал пикселей на BF, что позволило провести относительную количественную оценку поглощения: графики на Рисунке 5 демонстрируют его значительное увеличение при повышении концентрации CNT-метки (результаты для примерно 7 000 клеток на каждое экспериментальное условие).

Во-вторых, количественное определение CNT также возможно с помощью использования масок, применяемых либо к ограниченному диапазону темных пикселей в BF, либо к пикселям высокой интенсивности в DF (см. примеры на Рисунке 6), которые соответствуют пятнам, возникающим в результате присутствия CNT. Таким образом, построение графика площади этих масок позволяет выделить, а также продемонстрировать увеличение поглощения (приведено в примере на Рисунке 7 для площади маски в BF с выбором пикселей в диапазоне 0-533).

Кроме того, корреляцию между пятнами в BF и DF можно оценить, построив график зависимости интенсивности DF от среднего сигнала пикселя в BF (как на Рисунке 8) (анализ, не зависящий от маски) или площади маски в BF (Маска 1) от площади в DF (Маска 2).

Что касается процедуры, разработанной для локализации CNTs внутри клеток, на Рисунке 9A показаны созданные различные маски. Обратите внимание, что надежность масок локализации (основанных на эрозии маски клетки по умолчанию) необходимо визуально проверить на совокупности меченых и немеченых клеток. Одни и те же маски используются для всех образцов.

Построение графика зависимости общей площади черных пятен на клеточной мембране от их площади на всей клетке позволяет определить степень интернализации для клеток, инкубированных в течение 20 ч при 37 °C, по сравнению с инкубацией в течение 2 ч при 4 °C (см. Рисунок 9B); это указывает на то, что при 4 °C CNTs располагаются преимущественно на мембране, тогда как при 37 °C CNTs интернализируются более чем в 90% клеток.

Наконец, что касается флуоресценции, этот параметр не использовался в качестве индикатора для количественного определения CNT из-за слишком низкой корреляции между флуоресцентными пятнами и пятнами на BF (и DF). В действительности, корреляция между интенсивностью FITC и средним значением пикселя в светлом поле соответствует коэффициенту корреляции Пирсона -0,2. На Рисунке 10 проиллюстрированы два случая, в которых сигнал флуоресценции либо должным образом совпадает, либо не совпадает с черным пятном в светлом поле.

Рисунок 1. Обзор общего принципа работы ImageStream. Мультиспектральная система визуализации регистрирует до 12 изображений на одну клетку в трех различных режимах: в светлом поле, в темном поле и в режиме флуоресценции. Установка включает 5 лазеров возбуждения, в том числе с длинами волн 405, 488, 560 и 658 nm. Свет от клеток, протекающих через кювету, собирается с помощью различных объективов (в данном исследовании использовался объектив 40X) и передается на элемент спектрального разложения, который представляет собой набор длинноволновых фильтров, расположенных в угловом массиве. ПЗС-камера, регистрирующая изображения клеток, работает по методу интеграции с временной задержкой (time-delay-integration) во избежание размытия изображений. Доступна опция расширенной глубины резкости (EDF).

Рисунок 2. Галерея изображений клеток, маркированных углеродными нанотрубками (50 μg/mL), полученных с помощью ImageStream в различных каналах (светлое поле (BF), темное поле (DF), флуоресценция (FITC) и их совмещение). УНТ, локализованные внутри внутриклеточных лизосом, выглядят как крупные черные пятна на изображениях в светлом поле. Напротив, на изображениях в темном поле и флуоресцентных изображениях они создают яркие пятна.

Рисунок 3. Отбор клеток, находящихся в фокусе. Двумерная точечная диаграмма зависимости среднеквадратичного значения (RMS) градиента от контрастности на изображениях в светлом поле (BF) позволяет исключить расфокусированные клетки. Здесь желтой областью обозначены расфокусированные клетки, а синей — клетки, находящиеся в фокусе. Расфокусированные клетки характеризуются как низкой контрастностью, так и низким RMS градиента на изображении в светлом поле. Помимо RMS градиента, для дифференциации фокусированных клеток после их маркировки CNTs требуется параметр контрастности.

Рисунок 4. Дозозависимое поглощение CNT, визуализированное с помощью ImageStream. Количество и площадь черных пятен на изображениях в светлом поле увеличиваются с ростом дозы CNT во время инкубации с клетками (в диапазоне от 0-50 µg/ml). Обратите внимание, что контрольные клетки не содержат черных пятен.

Рисунок 5. Относительный количественный анализ поглощения CNT на основе изображений в светлом поле. Гистограммы средней интенсивности пикселей, примененные к маске «object», охватывающей всю клетку, четко демонстрируют дозозависимый характер, который может быть использован для количественного определения. Диапазон R9 охватывает CNT-положительные клетки.

Рисунок 6. Создание масок для выбора темных пятен на изображениях BF и светлых пятен на изображениях DF. Поскольку УНТ выглядят как сильно поглощающие темные пятна на изображении BF, создается пороговая маска для выбора ограниченного диапазона пикселей с низкой интенсивностью, которая в данном исследовании составляет 0-533 (Маска 1, обозначение: Intensity(M01, BF, 0-533)). И наоборот, маска, соответствующая пикселям с высокой интенсивностью (в данном случае 150-4095) на изображении DF (Маска 2, обозначение: Intensity (M06, DF, 150-4095)), используется для выбора светлых пятен на DF, соответствующих областям с высоким рассеянием.

Рисунок 7. Дозозависимое поглощение CNT демонстрируется путем количественного определения площади черных пятен на BF-изображениях. При использовании пороговой маски (mask 1), примененной к BF, можно количественно определить площадь черных пятен для каждой клетки, что демонстрирует дозозависимое распределение.

Рисунок 8. Корреляция методов количественного определения CNT на основе изображений в BF (абсорбция) и DF (рассеяние). Слева: среднее значение пикселя на BF-изображении в зависимости от интенсивности на DF-изображении демонстрирует хорошую корреляцию для клеток, меченных CNTs (50 µg/ml) (коэффициент корреляции Пирсона r = -0.68). Справа: площадь маски, соответствующей темным пятнам в BF, в зависимости от площади маски, соответствующей светлым пятнам в DF, для клеток, меченных CNTs (50 µg/ml). Коэффициент корреляции Пирсона r = -0.83. На графиках представлены значения для 7 000 клеток.

Рисунок 9. Локализация УНТ в клетках с использованием специфических масок. (A) Маски создаются в соответствии с определенной областью клетки, а именно слева направо: вся клетка, только мембрана и внутренняя часть клетки. Другая маска выделяет черные пятна благодаря пороговой интенсивности (Маска 1, обозначение: Intensity(M01, BF, 0-533)). (B) Оценку локализации УНТ можно получить путем измерения площади черных пятен в различных областях клеток с использованием масок локализации, описанных в пункте A. Инкубация с УНТ (50 µg/ml) проводилась как при 37 °C, так и при 4 °C для ингибирования пути интернализации. График зависимости площади черных пятен на мембране от площади черных пятен во всей клетке показывает дозозависимую абсорбцию УНТ на мембране при 4 °C, в то время как полная интернализация УНТ эффективно происходит при 37 °C.

Рисунок 10. Колокализация индуцированных CNT черных точек в светлом поле (BF) с яркими флуоресцентными точками на изображении FITC. Яркие флуоресцентные точки не всегда колокализованы с черными точками в BF. Они точно совпадают для первых двух представленных клеток, но не для двух последних.

Обсуждение

1. Модификация и устранение неполадок

В этом исследовании первой целью была оценка количества и локализации УНТ в клетках. Конфокальная микроскопия могла бы быть априори золотым методом оценки внутриклеточного распределения УНТ, функционализированных флуоресцентным маркером FITC^8,14. Однако основным недостатком является ограниченность визуализации отдельных клеток и, следовательно, отсутствие статистически значимых данных. ImageStream позволяет преодолевать эти препятствия: действительно, проверяя большое количество клеток (5 000-10 000) за короткое время (< минут), он дает статистически надежные результаты, которые также усиливаются визуализацией с высоким разрешением, которая предоставляет изображения для каждой клетки с субклеточным разрешением (0,5 мкм). Это дает возможность анализировать большой объем данных на основе анализа одного изображения.

По сравнению с обычной проточной цитометрией, уникальным преимуществом ImageStream является получение мультиспектральных изображений каждой клетки и попиксельное сравнение интенсивности сигнала. Таким образом, ImageStream сочетает в себе статистическую мощность высокопроизводительной проточной цитометрии с аналитическими преимуществами конфокальной визуализации для каждой анализируемой клетки. Это имеет решающее значение для количественного определения относительного количества и локализации УНТ в клетках без меток.

2. Важнейшие шаги в рамках Протокола

Критический шаг состоит из выбора параметров, наиболее подходящих для каждого исследования. В нашем случае лучшим способом было основывать анализ на свойствах поглощения и рассеяния нанотрубок: хорошая корреляция между локализацией темных пятен на BF и светлых пятен на DF подтверждает, что разработанный метод актуален и надежен – и, возможно, был бы невозможен без визуализации клеток.

3. Ограничения методики

Необходимо подчеркнуть, что визуализация УНТ в клетках была возможна только потому, что они имеют тенденцию накапливаться в эндосомальных внутриклеточных везикулах, а затем выступать в виде сильных абсорбирующих и рассеивающих пятен. Отдельные нанотрубки не должны быть обнаружены на основе этого метода, в то время как в конечном итоге он может быть обнаружен на флуоресценции, что представляет собой явное ограничение. Во-вторых, количественное определение не является «абсолютным», а относительным для различных меченых концентраций и по сравнению с контрольными немечеными клетками. Некоторые количественные признаки (средний пиксель, интенсивность и т.д.) являются абсолютными параметрами, тогда как другие зависят от выбора масок (пороговая маска, маски локализации).

4. Значимость по отношению к существующим методам

Что касается флуоресценции, анализ ImageStream подчеркивает плохую колокализацию кластеров CNT между ярким сигналом FITC и пятнами на других каналах. Таким образом, представляется, что флуоресценция не является надежным индикатором для количественного определения и локализации УНТ. Тем не менее, преодолевая ограничения традиционной проточной цитометрии, которая в основном основана на количественном определении флуоресценции, мультиспектральный высокопроизводительный ImageStream открывает путь к статистическому количественному определению без меток , обеспечивая при этом локализацию углеродных нанотрубок внутри клеток.

5. Будущие приложения

Этот высокопроизводительный статистический метод нанометрологии может быть обобщен на любые наноматериалы, которые демонстрируют высокое поглощение и рассеяние света при взаимодействии с клетками. Таким образом, он может иметь важное применение для исследований нано-биоинтерфейса, нанотоксикологии и наномедицины.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ImageStream	Amnis