Методическая статья

Руководство Выделение полученные из жировой ткани стволовые клетки из человека Lipoaspirates

DOI:

10.3791/50585

⸱

26 сентября 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1Cytori Therapeutics Inc, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Orthopedic Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Regenerative Bioengineering and Repair Laboratory, David Geffen School of Medicine at UCLA

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В 2001 году исследователи из UCLA описано изоляция популяции взрослых стволовых клеток, называется полученные из жировой ткани стволовые клетки или ИСС, из жировой ткани. В этой статье описываются изоляцию ИСС от lipoaspirates использованием ручной, ферментативный протокол пищеварения с использованием коллагеназы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В 2001 году исследователи из Университета Калифорнии в Лос-Анджелесе, описано выделение новой популяции взрослых стволовых клеток из liposuctioned жировой ткани, что они изначально называется, Обработанные липоаспирата клеток или PLA клетки. С тех пор, эти стволовые клетки были переименованы в жировой ткани стволовых клеток или ИСС и пошли дальше, чтобы стать одним из самых популярных групп населения взрослые стволовые клетки в области исследования стволовых клеток и регенеративной медицины. Тысячи статей теперь описано использование ИСС в различных регенеративных животных моделях, в том числе регенерации костной ткани, периферической нервной ремонта и сердечно-сосудистых техники. Последние статьи начали описывают множество применений для ИСС в клинике. Протокол показано в этой статье описывается основная процедура для вручную и ферментативно изоляции ИСС от больших количеств lipoaspirates полученных из косметических процедур. Этот протокол может быть легко масштабируется вверх или вниз для Accommodели объем липоаспирата и могут быть адаптированы, чтобы изолировать ИСС из жировой ткани, полученные через abdominoplasties и других подобных процедур.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В 2001 году предполагаемый население мультипотентными стволовых клеток из жировой ткани была описана в журнале Tissue Engineering 1. Эти клетки получили название Обработано липоаспирата или PLA клетки из-за их выводе из обработанного липоаспирата ткани, полученные с помощью косметической хирургии. Метод изоляции описано в этой статье было основано на существующих ферментативных стратегий изоляции стромальных сосудистой фракции (SVF) от жировой ткани 2. SVF была определена как минимально обработанного населения эритроцитов, фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки гладкой мускулатуры, перицитами и преадипоцитов, которые еще ​​придерживаются культуры ткани подложки 2, 3. Культивирование этого SVF течением времени предлагается устранить многие из этих загрязняющих клеточных популяций и привести к прикрепленной, фибробластов населения. Эти фибробласты были определены в литературе за последние 40 лет, как быть предварительноадипоциты. Тем не менее, наша исследовательская группа показала, что эти клетки обладают мезодермального мультипотентность и переименовал приверженцем SVF население в НОАК клеток. Последующие исследования многих других исследовательских групп добавили к этому потенциалу, предполагая, как энтодермальных и эктодермальные потенциалов (см. обзор 4). С того времени, многочисленные дополнительные условия для этих клеток появились в литературе. В целях обеспечения некоторый тип консенсуса, термин полученные из жировой ткани стволовые клетки или ИСС была принята на й ежегодной конференции 2 IFATS. Таким образом, термин ASC будет использоваться в этой статье.

Протокол, описанный в этой статье, относительно простая процедура, которая требует стандартный лабораторного оборудования и использует простые реагенты, такие как фосфо-солевом буфере, стандартных для культивирования тканей СМИ реагентов и коллагеназы. Он может производить большое количество ИСС в зависимости от количества исходного объема ткани жировой и последующее Culture время. Однако обработка такого большого количества жировой ткани может представить некоторые физические проблемы, которые могут быть уменьшены до такой степени, используя этот протокол. Кроме того, этот протокол требует стерильных культуры ткани объектов и утвержденные капюшоны биобезопасности, возникает необходимость использования утвержденного культуры объекте ткани. Это требование может также уменьшить полезность населения ASC в клинической практике, если они не изолированы в надлежащей производственной практики (GMP), одобренные устройства, предназначенные для изоляции и расширения материалов для клинического использования. В качестве альтернативы, автоматизированные системы, которые могут изолировать ИСС в замкнутой системе в операционной избежал бы этого ключевого вопроса и создать условия для немедленного использования ИСС без какой-либо необходимости в последующей экспансии в пробирке. На сегодняшний день существует шесть автоматизированных систем, которые доступны в продаже для выделения клеток из тканей человека. Эти системы могут сделать возможным изолироватьЗначительное число ИСС из большого количества жировой ткани сразу после его урожай. Эти ИСС может затем быть вновь в организм пациента для различных восстановительных целях без пациента покидая операционную. В дополнение к этому протоколу, описывающей ручной изоляцию ИСС, протокол для автоматизированного выделения ИСС использованием Celution система также приведены в сопутствующей статье.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол показано здесь описывает ручной изоляцию ИСС от lipoaspirates, полученных с помощью косметических процедур с использованием ферментативного пищеварения и дифференциального центрифугирования. Этот протокол был впервые опубликован в журнале тканевой инженерии в 2001 году 1, где полученные клетки называется Обработанные клетки липоаспирата или PLA клетки из-за их изоляции от lipoaspirates. Однако термин НОАК клеток в настоящее время заменен с термином полученные из жировой ткани стволовые клетки или ИСС, чтобы дать области какую-то соответствии с точки зрения номенклатуры. Клетки, выделенные через этот протокол, как было показано многими обладать мезодермального потенциал как в пробирке и в естественных (см. обзор 4). Кроме того, эктодермальном и энтодермальные потенциалы ASC были также исследованы четыре. Техника изоляции прост и понятен и требует приблизительно один час, чтобы закончить. Полученный клеточныйс культивируют в стандартных условиях культивирования тканей. Со временем культура, население ASC становится более однородным, состоит из фибробластов клетки, которые расширяют легко и показывают хорошую жизнеспособность в долгосрочной перспективе в области культуры.

Примечание: Следующие части оборудования, которые необходимы перечислены в конце этой статьи. Все изделия из стекла, средства массовой информации и реагенты должны быть стерилизованы через автоклаве или фильтруют через 0,22 мкм фильтры. Асептические тканевых культур следует придерживаться во все времена. Чтобы обеспечить это, все материалы, размещенные в корпусе биологической должны быть стерилизованы путем распыления с 70%-ным раствором этанола и протиранием чистой бумажными полотенцами.

1. До урожая, подготовить следующие:

  1. Стерильные 1X фосфо-буферный солевой раствор (PBS) для промывки lipoaspirates. Подготовка приблизительно 1 л 1x PBS на каждые 100 мл липоаспирата. Автоклав с PBS и всеOW остыть до комнатной температуры перед использованием. Как вариант, антибиотик / противогрибковым могут быть добавлены к окончательной концентрации: 100 МЕ / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2,50 мкг / мл амфотерицина один раз PBS остынет.
  2. Стерильная 0.075-0.1% Тип коллагеназы И.А. (от Clostridium histolyticum) для ферментативного переваривания липоаспирата. Концентрация будет зависеть от качества и источника коллагеназы - то есть сырой против очистке. Другие коллагеназы типа могут быть использованы (тип например коллагеназы II или IV) при аналогичных концентрациях. Подготовка в 1х PBS и стерильный фильтр с использованием системы фильтрации 1000 мл 0,22 мкм фильтр (фиг.1А). Тем не менее, также могут быть использованы стерильные стеклянные бутылки, снабженные верхним фильтром бутылки. Подготовить и использовать при комнатной температуре. Коллагеназы решения могут храниться в течение краткосрочной перспективе при 4 ° С до использования. Не замораживать коллагеназы решение, как это может уменьшить свою деятельность.
  3. Стерильная управления Средний (CM) для коллагеназы инактивации и культивирования населения ASC. Для 500 мл CM, комбинировать следующим образом: 500 мл DMEM (4,5 г / л глюкозы, с L-глутамина), 50 мл фетальной бычьей сыворотки (инактивированной нагреванием), 5 мл пенициллина / стрептомицина (10000 МЕ пенициллин, 10000 мкг / мл стрептомицин). Как вариант, также могут быть добавлены 5 мл амфотерицина В (250 мкг / мл амфотерицина B). Стерильная фильтрация этом СМИ не требуется, если используются нестерильные реагенты. Поместите см в 37 ° С водяной бане 30 мин до использования, чтобы нагреть среду.
  4. Стерильная посуда и Пластик для изоляции. Автоклав стеклянную мензурку 1000 мл и дайте ему остыть до комнатной температуры перед использованием. Кроме того, имеет место следующая Пластик готов: асептический серологические пипетки (5 мл, 10 мл и 25 мл), 50 мл центрифужные пробирки и культуры ткани обработанных чашки для культивирования.

2. Выделение ИСС от Lipoaspirates

Большинство lipoaspirates собирают в контейнер аспирации (см. рисунок 1b) и может состоять из трех отдельных слоев: 1) верхний слой масла за счет лизиса зрелых адипоцитов, 2) средний слой жировой ткани и 3) дно, жидкость нижний слой, содержащий солевой раствор и загрязнение типы клеток, такие как красных кровяных телец (эритроцитов). Верхний слой масло не может присутствовать в значительных количествах. Если присутствует, он должен быть атмосферный как загрязнение масла полученной культуры ASC может повлиять на жизнеспособность культуры. В нижней нижний слой должен быть удален до обработки, чтобы минимизировать загрязнение ASC культур с БС. Это оставит середину, жировой слой ткани, которые затем будут мыть и ферментативно переваривается, чтобы освободить свой ​​сотовый, стромы сосудистого фракцию (НВФ).

  1. Мытье липоаспирата: Откройте липоаспирата контейнер в культуре ткани чООД и тщательно слейте липоаспирата в стерильный 1 л стеклянный стакан. Позвольте липоаспирата слои отделить пока жировая слой ткани не хорошо разделены (рис. 1b).
    1. Аспирируйте от слоя масла (если присутствует) с помощью стерильной пипетки, стекло и нижнюю солевой нижний слой с использованием 10 мл серологической пипеткой. Это позволит удалить большую большинство загрязняющих красных кровяных клеток и физиологический раствор.
    2. Оценить объем полученной жировой ткани слоем и добавить стерильный 1X PBS в равном объеме. Размешайте аспирируйте с пипетки, используемой для аспирации для того, чтобы смешать липоаспирата с PBS. Разрешить эти два слоя, чтобы обосноваться. Как отмечалось выше, 1X PBS может быть дополнена антибиотик / противогрибковых средств.
    3. Аспирируйте нижний слой с использованием 10 мл серологической пипеткой.
    4. Продолжайте промывать долю жировой ткани, как описано в пунктах 2.1.2. и 2.1.3. пока жировая слой не имеет желтый / золотой цвет. Аспирируйте йэ нижний слой в последний раз, в результате чего часть жировой ткани в стеклянный стакан. Для обеспечения достаточной удаление нижний слой, позволяют липоаспирата слои урегулировать в течение 5 мин после последней промывки и перед заключительной аспирации.
  2. Ферментативного расщепления из липоаспирата: Подготовка стерильного раствора коллагеназы 1A, как описано выше в блоке фильтра. Подготовка объем, равный тому из жировой фракции и стерильный фильтр.
    1. После фильтрации раствора коллагеназы, отбросить верхний блок фильтра, осторожно влить промытого жировой фракции в коллагеназы решение и плотно закрыть бутылку.
    2. Поместите коллагеназа / жировой смеси в водяной бане при 37 ° и переварить при 37 ° С в течение 30 мин. Аккуратно водоворот коллагеназы / жировой смеси через каждые 5-10 мин и поместите обратно в водяной бане. Жировая слой ткани должны взять на себя "гладкой" внешний вид (Figurэ 1B) в качестве пищеварения доходов. Дополнительные раз пищеварения (т.е. до 2 часов) может быть использована, если жировая слой ткани еще, кажется, есть твердые кусочки жира в нем.
  3. Выделение ИСС: Место переваривается коллагеназы / жировая смесь обратно в шкаф биобезопасности. Обязательно стерилизуйте блок фильтра с 70% этанола до размещения обратно в шкаф.
    1. Пипеток 25 мл аликвоты нижний слой, содержащего СФДВ в стерильные 50 мл центрифужные пробирки.
    2. Добавить 25 мл CM в каждую пробирку. Разрешить CM для инактивации коллагеназы путем инкубации при комнатной температуре в шкафу в течение 5 мин.
    3. Центрифуга течение 10 мин при 1200 х г собирать СФДВ как таблетки.
    4. В кабинете биобезопасности, аспирации супернатант из каждой пробирки. Убедитесь, что верхний слой масла и любые плавающие адипоциты атмосферный с этим супернатанта ( фиг.1В).
    5. Объедините SVF гранул в одной центрифуге трубки, используя 30 мл CM и разделить поровну на две новые 50 мл центрифужные пробирки. Центрифуга, как в пункте 2.3.3. и аспирации супернатанты от двух СФДВ гранул (не показаны на рисунке).
      ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Если РБК лизис желательно, ресуспендируют каждый SVF осадок в 10 мл в буфере для лизиса РБК (160 мм NH 4 Cl) и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин. Центрифуга, как в пункте 2.3.3. и аспирации супернатанты уступить СФДВ гранулы (не показаны на рисунке).
    6. Объедините две SVF гранул в одну новую пробирку для центрифугирования с использованием 5-10 мл CM (рис. 1В).
    7. Чтобы отфильтровывать крупные частицы ткани, пипетки ресуспендировали осадок на SVF сетки фильтра 100 мкм размещенного в верхней части новой 50 мл центрифужную пробирку и позволяют фильтровать самотеком.
    8. Внесите аликвоты ресуспендировали(И фильтруют) SVF осадок, содержащий ИСС на тканевых культур, обработанных чашек для культивирования. Дополнение каждое блюдо с соответствующим объемом CM.
    9. Культуры клеток в КМ в течение 3-4 дней при 37 ° С, 5% СО 2 без изменения массовой информации.

После этого начального периода культуры, культура СМИ может быть атмосферный и любые загрязняющие эритроциты мягко удаляют промыванием стерильной 1XPBS. Замените CM и продолжают культуры в ИСС по мере необходимости. Тип ткани чашки для культивирования, используемой как и ресуспендировали осадок СФДВ разделена среди этих блюд будет зависеть от числа клеток, требуемых следующее обычной тканевой культуры.

3. Характеристика ASC Население: проточной цитометрии и мультилинейной Дифференциация

После выделения характеристика населения ASC должны быть выполнены. Традиционные подходы для этого включают потока цитометрия охарактеризовать клеточной поверхности CD антиген профиля клеток и дифференциации в пробирке для подтверждения их способности мультилинейной дифференциации. В то время как множественные клоны могут быть оценены в ИСС, этот протокол описывает дифференциацию ИСС в клетки адипогенной, остеогенные и хондрогенных линий как средство подтверждения мультилинейной мезодермальные потенциалы 5.

В пробирке нескольких клонов дифференциации ИСС

  1. Остеогенной дифференцировки из ИСС: До индукции остеогенной подготовить Средний (OM) следующим образом: К одному 500 мл бутылку DMEM (4,5 г / мл глюкозы) добавить 25,0 мл FBS (5,0% конечная концентрация) и 5,0 мл пенициллина / стрептомицина (10000 МЕ / мл и конечные концентрации 10000 мг / мл, соответственно). Для этого добавьте следующие остеогенных индукционных агентов с получением указанной конечной концентрации: дексаметазон (0,1 мкМ окончательный), L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата (50,0 мкМ конечные) И β-глицерофосфат (10,0 мМ конечной).
    1. До индукции, урожай и пластины культивированные ИСС в нужное блюдо культуры ткани таким образом, что сплошности из примерно 50% достигается. Для каждого экспериментального блюдо покрытием, пластины дополнительный блюдо для не-индуцированной контроля. Культура ночь в СМ.
      Примечание: 50% слияния рекомендуется для того, чтобы обеспечить продолжение пролиферации, которые могут возникнуть в течение индукции
    2. В день индукции, удалить среды и добавьте следующий: OM к желаемым остеогенных экспериментальных скважин и СМ в контрольных лунках. Объем носителей, используемых будет зависеть от размера блюдо культуры ткани. В течение 12-луночные планшеты, 1,0 мл среды на лунку является достаточным. За 6 блюд также, 2,0 мл СМИ на лунку достаточно. Для 100 мм чашках, следует использовать 10,0 мл среды на чашку.
    3. Культура клетки в течение как минимум 14 дней с изменениями соответствующей среде каждый 3-4дней. Высоко остеогенные населения ASC может показать признаки внеклеточного отложения минералов уже в 7 дней индукции.
    4. Остеогенной дифференцировки (т.е. внеклеточного минеральная осаждение) может быть подтверждено с помощью гистологического пятно фон Косса для фосфата кальция. Это пятно будет производить черно-коричневый осадок, идентифицирующий наличие внеклеточного фосфата кальция (см. рисунок 2).
      Чтобы окрасить с фон Kossa реагента:
      1. Извлеките ОМ из экспериментальных клеток и см от контрольных клеток
      2. Fix клетки в течение 60 мин в 4,0% параформальдегиде подготовлен в 1x PBS.
      3. Промывают клетки два раза 1х PBS.
      4. Инкубируйте клетки с 2,0% нитрата серебра (полученного в воде) в темноте в течение 30 мин.
      5. Снимите нитрат серебра, мыть два раза дистиллированной водой и воздушно-сухих клеток.
      6. Expose клетки к воздействию ультрафиолетового излучения в течение 60 мин, чтобы развивать калбилирубина фосфат осадок.
      7. Вымойте клетки несколько раз 1XPBS.
      8. Контрастирующая ячейку гематоксилином если это необходимо.
  1. Адипогенной Дифференциация ИСС: До индукции, подготовить Adipogenic Средний (AM) следующим образом: Для одного 500 мл бутылку DMEM (4,5 г / мл глюкозы) добавить 50,0 мл FBS (10,0% конечной концентрации) и 5,0 мл пенициллина / стрептомицина (10000 МЕ / мл и 10000 конечные концентрации мкг / мл, соответственно). Для этого добавьте следующие Adipogenic индукционные агентов, чтобы дать указанные конечные концентрации: дексаметазона (1,0 мкМ финал), 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX - 0,5 мм Конечная), индометацин (0.2 мм окончательные) и инсулин (10,0 мкмоль финал ).
    1. До индукции, урожай и пластины культивированные ИСС в нужное блюдо культуры ткани таким образом, что сплошности около 80% достигается. Для каждого экспериментального блюдо покрытием, пластины дополнениеаль блюдо для не-индуцированной контроля. . Культура ночь в СМ Примечание: адипогенной дифференциация ИСС представляется более эффективным с повышенным слияния.
    2. В день индукции, удалить среды и добавить следующее: AM к желаемым остеогенных экспериментальных скважин и СМ в контрольных лунках. Объем носителей, используемых будет зависеть от размера блюдо культуры ткани. За 12-луночные планшеты, 1.0.ml СМИ на лунку достаточно. За 6 блюд также, 2,0 мл СМИ на лунку достаточно. Для 100 мм чашках, следует использовать 10,0 мл среды на чашку.
    3. Культуры клеток в течение как минимум 14 дней с изменениями соответствующей среде каждые 3-4 дней. Высоко Adipogenic населения ASC может показать признаки формирования липидного вакуолей уже в 7 дней индукции.
    4. ИСС, проходящие Adipogenic дифференциацию будет развиваться несколько вакуолей липидов, которые могут быть легко визуализированы под световым микроскопом. Кроме того, адипогенной дифференциация можетбыть подтверждена с помощью гистологического пятно нефти Красный O, которая будет аккумулировать в этих вакуолей (см. рисунок 2).
      Чтобы окрасить с нефтяной Красной O:
      1. Извлеките носитель из экспериментальных и контрольных клеток и исправить их в течение 60 мин с использованием 10% официального фиксатором кальция. Для подготовки этого фиксатором, объединить следующим образом: 1,0 г CaCl 2, 25,0 мл 16% параформальдегида (4,0% финал) и 75,0 мл дистиллированной воды.
      2. Промыть клетки два раза 1х PBS.
      3. Вымойте клетки кратко с 70% этанола.
      4. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 5 мин с раствором масла Red вывода. Для приготовления раствора масла Red O, растворить 2,0 г масла Red O порошка в 50,0 мл 70%-ного этанола и 50,0 мл ацетона.
      5. Промывают клетки с 70% этанола и затем водопроводной водой.
      6. Визуализация клеток вскоре после окрашивания из-за угасания пятно со временем.
  1. Хондрогенной Дифференцирование ИСС: хондрогенной дифференциация достигается за счет техники культуры высокой плотности именуемого "Micromass культуры». До культуры, подготовить хондрогенной Средний (МП) следующим образом: К одному 500 мл бутылку DMEM (4,5 г / мл глюкозы) добавить 5,0 мл FBS (1% конечная концентрация) и 5,0 мл пенициллина / стрептомицина (10000 МЕ / мл и 10000 мкг / мл конечные концентрации, соответственно). Для этого добавьте следующие хондрогенной индукционные агентов, чтобы дать указанные конечные концентрации: L-аскорбиновая-2-фосфат (50,0 мкг / мл конечная), инсулина (6,25 мкг / мл конечная), трансферрина (6.25 мкг / мл конечная) и TGF 1 (10,0 нг / мл).
    1. Урожай ИСС и центрифуги в течение 5 мин при 1200 мкг в для осаждения клеток. Граф клеток, чтобы определить плотность клеточной суспензии.
    2. Для приготовления Micromass гранулы, подготовить две клеточные суспензии: один экспериментальный суспензии, приготовленной в ChM при плотности 1 × 10 7 клетокS / мл и один элемент управления Суспензию, полученную в СМ при плотности 1 × 10 7 клеток / мл.
      1. Наведите 10,0 мкл "капельки" из суспензии клеток в отдельные лунки блюдо с несколькими хорошо. Разрешить придерживаться в течение 2-3 часов при температуре 37 ° С.
      2. Аккуратно наложения пластинчатые капли с либо ChM или CM стараясь не отделить клетки.
      3. Культуры клеток на срок до 14 дней в ChM или CM с изменениями в среде каждые 3-4 дней. Клеток, культивируемых в ChM будет конденсироваться за это время сформировать высокой плотности Micromass шарик с практически нет клеток в окружающей монослоя. Контрольные клетки, культивируемые не претерпит этой конденсации и многие будут найдены в виде монослоя.
      4. Чтобы подтвердить, хондрогенез, исправить гранулы в течение 15 мин в 4,0% параформальдегида (полученного в 1х PBS) при комнатной температуре. Пятно на наличие сульфатированных протеогликанов использованием альциановым голубым гистологическое пятно.
        Чтобы окрасить с помощью альциановым Blue:
        1. Вымойте годовыхraformaldehyde фиксированной гранулы раз в 1x PBS.
        2. Инкубируйте гранулы в 0,1 N НСl (рН 1,0) в течение 5 мин, чтобы снизить рН.
        3. Снимите HCl и добавить 1% альциановым синий реагента (подготовленный в 0,1 N HCl, рН 1,0). Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
        4. Снимите альциановым синий реагент и мыть гранул 0,1 н HCl (рН 1,0), чтобы удалить лишнюю пятно.
        5. Дополнительные моет с использованием водопроводной воды может быть использован для уменьшения фоновое окрашивание.
        6. В качестве альтернативы, Micromass гранулы могут быть собраны, фиксировали в течение ночи в 10% формалине, заливали в парафин и срезы окрашивали на альциановым голубым.

4. Цитометрический Характеристика ИСС

Характеристика клеточной поверхности CD профиль антигена может быть осуществлено посредством обычного цитометрии потока.

  1. Подготовка ИСС для проточной цитометрии: Доанализу, подготовить проточной цитометрии Buffer (FCB), состоящую из следующих действий: 1.0% БСА, 2,0% FBS и 0,025% сапонина, полученного в 1x PBS.
    1. Урожай ИСС и Центрифуга клетки в течение 5 мин при 1200 мкг в производить осадок.
    2. Ресуспендируют клеток в стерильной 1XPBS и считать клетки с помощью гемоцитометра. Определить плотность клеток в суспензии.
    3. Разделите подвеску вверх в аликвотам 5 х 10 5 клеток общего и центрифуг для осаждения.
    4. Удалить супернатант PBS и фиксации клеток в течение 60 мин при -20 ° С с избытком охлажденного льдом 70% этанола. При необходимости, эти клетки могут быть сохранены в этом 70% этанола в -20 ° C морозильник до необходимости.
    5. После фиксации, тщательно аспирата этанола и осторожно мыть осадок два раза с избытком FCB. Для мытья:
      1. Добавить избыток FCB и осторожно ресуспендируют осадок.
      2. Центрифуга в течение 5 мин при 1200 мкг в собирать клеткиса осадок.
      3. Тщательно аспирата супернатант FCB.
      4. Повторите.
    6. Удалить конечный FCB стирки супернатант из каждой аликвоты и ресуспендируют в 100 мкл FCB. Добавить нужный флуорохромом-сопряженных первичных антител с использованием предложенной разбавление производителя. Инкубируйте клетки на льду с антителом в течение 30 мин.
      Примечание: Если конъюгированное с флуорохромом первичные антитела не доступны, могут быть использованы несопр женные первичные антитела.
    7. Для каждого используемого флуорохромом (например, FITC, РЕ), инкубируют аликвоты клеток 100 мл FCB, содержащей изотипа IgG, в качестве отрицательного контроля.
    8. Выдержите один аликвоты в 100 мл FCB, не содержащей антител в качестве дополнительного контроля.
    9. Промойте каждую аликвоту клетки два раза FCB, как описано в шаге 4.1.5. После последней промывки ресуспендируйте аликвоты в 100 мл FCB и заполните анализа потока.
      Примечание: Если были использованы несопряженные первичные антитела: После этого мыть шаг инкубировать аликвоты на льду в течение 20 мин с FCB дополнен соответствующими флуорохромом-сопряженных вторичными антителами, используя предложенную разбавление производителя. Вымойте два раза как указано в пункте 4.1.5.
  2. Поток анализ ИСС: Для анализа потока, как минимум, 10000 событий следует учитывать. Неокрашенные и изотипу управления должны быть использованы для установки ворот на рассеяния вперед (FSC) и боковой разброс (SSC). Для этого, нет управления антител (т.е. неокрашенные) стадии 4.1.8 не должны использоваться для устранения мусора и мертвых ИСС. В изотипу IgG управления со стадии 4.1.7. следует использовать для установления области положительной флуоресценции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

План протокол выше описывает ручной, ферментативный способ выделения из SVF из большого объема образца липоаспирата. В рамках этой СФДВ многочисленные клеточные популяции, в том числе ASC. Многочисленные исследования предполагают, что культивирование этой СФДВ в стандартных условиях культивирования тканей выберет для сцепленным населения фибробластов, вероятно, будет в основном состоит из типа ASC. В соответствии с этим, мы показали, с помощью проточной цитометрии и иммунофлюоресценции, что культивируемые СФДВ гранулы с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Жировая ткань для выделения ИСС может прийти во многих формах: от цельных кусков ткани, полученных с помощью резекции или липосакции на более мелкие куски, полученных с помощью либо извлечения шприца или всасывания при содействии липосакции (т.е. липосакции). Если больше СФДВ клетки (и тем самым ИСС) может быть получено из резекции или отсасывали образцов жировой неясно, как конфликтующие исследования были представлены 16, 17. Вполне возможно, что либо форма жировой ткани больше подходит для изоляции...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы этой рукописи соавторы на патент принадлежащих регентов Калифорнийского университета и лицензию на Cytori Therapeutics.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы выразить признательность и поблагодарить тех дополнительных научных кадров, которые способствовали развитию описанного протокола и его изоляции ИСС, в том числе: д-р Х. Петер Лоренц, доктор медицинских наук, доктор Хироши Muzuno, доктор медицинских наук, доктор Джерри Хуанг, MD , д-р Адам Кац, доктор медицинских наук, доктор Уильям Футрелл, доктор медицинских наук, доктор Жун Чжан, доктор стоматологии, кандидат наук, доктор Лариса Родригес, доктор медицинских наук, доктор Зени Альфонсо, доктор философии, и д-р Джон Фрейзер, кандидат наук. Результаты, представленные финансировались, в частности, путем исследовательских грантов от Национального института здоровья, в том числе NIAMS и NIDCR институтов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Reagent
DMEM (Dulbecco’ s модификация Eagle’ MediatechCellgro10-013-CVс 4,5 г/мл глюкозы, L-глутамина, пирувата натрия
Пенициллин/стрептомицинMediatech Cellgro30-002-CI10,000 МЕ/мл пенициллина/10,000 μ г/мл стрептомицин
Амфотерицин BMediatech Cellgro30-003-CF250 μ г/мл амфотерицин B
10X PBS (фосфо-буферный физиологический раствор)Mediatech Cellgro25-053-CIбез кальция, без трипсина магния
/ЭДТАMediatech Cellgro20-031-CV0,25 % трипсин/2,21 мМ ЭДТА
коллагеназа типа IA (из Clostridium histolyticum)СигмаС2674сырой препарат; < 125 единиц переваривания коллагена/мг твердый
FBS (фетальная бычья сыворотка) термоинактивированныебиопродукты Gemini Bioproducts100106источника USDA, термоинактивированные
серологические пипетки 10 млGenesee Scientific12-104
серологические пипетки 25 млGenesee Scientific12-106
50 мл полипропиленовые центрифужные пробиркиGenesee Scientific21-106
100 мм чашки для культуры тканейGenesee Scientific25-202
150 мм чашки для культуры тканейGenesee Scientific25-203
500 мл Stericup Фильтрующие блокиMilliporeSCGPU05REмембрана PES, 0.22 μ m pore
Клеточные фильтрыFisherBrand22-363-549100 μ m нейлоновая сетка
дексаметазон - водорастворимыйSigmaD-2915
L-аскорбиновая кислота 2 фосфатSigmaA-8960
β-глицерофосфат динатриевая соль SigmaG-9422также известный как глицерофосфат
инсулинSigmaI-6634поджелудочной железы крупного рогатого скота
SigmaI-7378
апотрансферринSigmaT-4382
TGFβ 1R& D Systems240-B-002рекомбинантное человеческое
масло Red O SigmaO-0625
Alcian BlueSigmaA-5268
Нитрат серебраSigmaS-0319
Соляная кислотаFisherScientific A144
ПараформальдегидFisher Scientific30525-89-4поставляется в виде 16% запаса
[заголовок]
Требуется оборудование
Класс II A/B Колпак биобезопасностиThermo Scientificобеспечивает наличие вакуумных линий для аспирации
Настольная центрифугаHermle LabnetZ383Поворотно-откидной ротор для пробирок 50 мл требуется, способный работать на водяной бане 1200xg
Fisher Scientific IsotempS52602Qемкостью 5-10 л, способный выдерживать 37C
Автоматический пипеткаAids Drummond Pipette Aid XL4-000-105
CO2 инкубаторThermo ScientificForma 310с прямым нагревом или водяной рубашкой
изготовлен из индометацина

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
  2. Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).
  3. Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
  4. Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , in press (2012).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
  6. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  7. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
  8. Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
  9. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
  10. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
  11. Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
  12. Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
  13. Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
  14. Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
  15. Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
  16. Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
  17. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  18. Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J. 3rd, Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
  19. Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
  20. Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
  21. Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
  22. Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
  23. Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
  24. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  25. Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
  26. Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
  27. Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
  28. Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
  29. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
  30. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
  31. Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
  32. Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
  33. D'Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
  34. Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
  35. De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537(2009).
  36. Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи