Методическая статья

Выделение, очистка и маркировки Мышь нейтрофилов костного мозга для функциональных исследований и приемных Эксперименты Трансфер

63.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50586

⸱

10 июля 2013 г.

 , 
1Fungal Pathogenesis Unit, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH

В этой статье

Краткое содержание

Мы опишем протокол для выделения и очистки нейтрофилов из костного мозга мыши центрифугированием в градиенте плотности и нейтрофилов мечение с применением CellTracker красителей. Это представляет собой простой, быстрый, воспроизводимые и экономичный способ получения большого количества нейтрофилов для последующих функциональных исследований или экспериментов приемных передачи и отслеживания.

Аннотация

Нейтрофилы являются критическими эффекторные клетки врожденной иммунной системы. Они быстро набраны на участках острое воспаление и оказывают защитное или патогенных эффектов в зависимости от воспалительной среде. Тем не менее, несмотря на незаменимую роль нейтрофилов в иммунитете, детальное понимание молекулярных факторов, которые обеспечивают нейтрофилов и эффекторные immunopathogenic эффектов в различных инфекционных заболеваний и воспалительных заболеваний по-прежнему отсутствует, отчасти потому, что их короткий период полураспада, трудности с обработкой этих клеток и отсутствием надежных экспериментальных протоколов для получения достаточного количества нейтрофилов ниже по течению функциональных исследований и экспериментов приемных передачи. Таким образом, простой, быстрый, экономичный и надежный методы являются очень желательными для сбора достаточного количества нейтрофилов мыши для оценки функции, такие как фагоцитоз, убийства, продукция цитокинов, дегрануляцию и торговли людьми. С этой целью,Мы представляем воспроизводимый центрифугирования в градиенте плотности на основе протокола, который может быть адаптирован в любой лаборатории изолировать большое количество нейтрофилов из костного мозга мышей с высокой степенью чистоты и жизнеспособности. Кроме того, предложен простой протокол, который использует CellTracker красителей для обозначения изолированных нейтрофилов, которые затем могут быть адаптивно переносили в мышей-реципиентов и отслеживаться в некоторых тканях, по крайней мере, 4 ч после передачи с использованием проточной цитометрии. Используя этот подход, дифференциальные маркировки нейтрофилов из дикого типа и генов-дефицитных мышей с различными красителями CellTracker может быть успешно использован для выполнения конкурентоспособных исследований репопуляцию для оценки непосредственную роль определенных генов в торговле нейтрофилов из крови в ткани-мишени в естественных условиях .

Введение

Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов у людей. Они являются основным клеточным компонентом врожденной иммунной системы и выступают в качестве первой линии защиты от вторжения микроорганизмов. Пациенты с приобретенными нейтропения и первичных иммунодефицитов, которые влияют нейтрофилов номера и / или функции развиваются угрожающие жизни инвазивных бактериальных и грибковых инфекций, подчеркнув важность этих клеток в иммунной защиты 1. Иммунный признание вторжения патогенных микроорганизмов на инфекцию сайта, их родственными распознавания рецепторами приводит к индукции организованной врожденный иммунный ответ, что приводит к секреции хемоаттрактанты которые генерируют градиента хемотаксических способны вербовку нейтрофилов из крови в воспаленную ткань 2 . После нейтрофилов ввести инфекцию сайт, они активизируются, что приводит к цитокинов и хемокинов, патоген поглощение, и убивают через окислительную и неокислительный меняchanisms 3. Кроме того, их хорошо узнаваемая роль во врожденном иммунитете, нейтрофилы также недавно было показано, играют важную роль в качестве инициаторов эффективной адаптивного иммунного ответа 4. С другой стороны, помимо их роли в защитный иммунитет, нейтрофилы могут также посредником повреждение тканей и иммунопатологии из-за чрезмерного накопления и / или активации на участках воспаления, как показано в различных инфекционных и аутоиммунных заболеваний 5-7.

Несмотря на незаменимую роль нейтрофилов в монтаже эффективной врожденного иммунного ответа и их плейотропную эффекторных функций многих инфекционных заболеваний и воспалительных состояний, технические трудности с обработкой этих клеток и отсутствием надежных экспериментальных протоколов препятствовал исследование с нейтрофилов в течение последних десятилетий. Таким образом, использование воспроизводимых анализов для выделения нейтрофилов должно облегчить дальнейшее исследование нейтрофилов-опосредованного immunoloческие функции бывших естественных условиях и в естественных условиях. На сегодняшний день несколько методов были описаны для выделения нейтрофилов, такие как центрифугирование в градиенте плотности крови человека и мыши крови или костного мозга 8,9, положительный или отрицательный иммуномагнитного обогащение нейтрофилов из крови мыши или костного мозга 10,11, и сбор нейтрофилов из брюшной полости мышей после внутрибрюшинной инъекции тиогликолята или других противовоспалительных агентов 12. Хотя нейтрофилов может быть легко выделено в больших количествах из крови человека, этот метод является оптимальным у мышей из-за ограниченного объема крови мышей, что исключает выделение достаточного нейтрофилов для функциональных исследований или приемные экспериментов передачи 13. Кроме того, хотя выход тиогликолята-вызывали клетки из брюшной полости больше по сравнению с крови мышей, чистота нейтрофилов в воспалительном перитонеального лаважа изменяется между60-90%, а изолированный нейтрофилы проявляют активированный фенотип. Таким образом, клетки собирали с использованием этого метода может быть использован только для выполнения функциональных исследований активированных но не стимулированных нейтрофилов, как мышь брюшную полость имеет несколько нейтрофилов в стационарном состоянии 12. Вместо этого, костный мозг является удобным резервуар для сбора большого количества или стимулированных или активированный 11,14 нейтрофилы, которые затем могут быть использованы для последующих функциональных исследований, таких как фагоцитоз, убийства и дегрануляции или для приемных передачи в получатель мышей.

Здесь мы описываем простой и быстрый (~ 2 ч) протокол, который обеспечивает высокий выход (~ 6-12 × 10 6 нейтрофилов / неинфицированных мышей, или до 30-40 × 10 6 нейтрофилов / инфицированные мыши) чистого (80 -95%) нейтрофилов> 95% жизнеспособность из костного мозга. Этот метод использует коммерчески доступные Histopaque, которые в градиенте плотности ячейки отдельнорацион сред, состоящих из Ficoll и натрий диатризоат, отделить нейтрофилов из костного мозга мышей. Этот метод дает значительно большее количество нейтрофилов на мышь по сравнению с полостью крови или перитонеального, он может быть использован для сбора нейтрофилов у мышей и в стационарном состоянии или после инфекции и легче слое по сравнению с центрифугирование в градиенте плотности метод, который использует прерывистый перколлом градиенты, состоящий из 55% / 65% / 75% Percoll в PBS 9. Кроме того, время и ресурсы, необходимые для сбора чистой нейтрофилов значительно снизился по сравнению с выделения нейтрофилов с помощью флуоресцентной-Активированный сортировки клеток. Кроме того, поскольку этот способ не включать иммуномагнитного шаг обогащения, это более экономически эффективным, и это позволяет избежать воздействия на клетки магнитного колонку и антитела, таким образом уменьшая вероятность активации нейтрофилов.

В дополнение к выполнению функциональных исследований изолированной neutrophшек исключая виво и приемных передачи клеток в мышей-реципиентов, этот протокол также описывает способ маркировки изолированных нейтрофилов с использованием различных красителей CellTracker. Дифференциальный маркировки нейтрофилов у мышей различных генетических фоны могут быть адаптированы в конкурентных исследований репопуляцию для отслеживания переданных нейтрофилов в тканях мышей-реципиентов с использованием проточной цитометрии, которые могут обеспечить механистической представление о непосредственной роли определенных генов в торговле нейтрофилов из крови в целевые воспаленных органов 6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Выделение клеток костного мозга мыши

  1. Усыпить мышей с использованием уход за животными учреждения Комитета, утвержденных протоколом и распылить животного поверхность с 70% этанола.
  2. Сделайте надрез кожи в середине живота и удалить кожу от дистальной части мыши в том числе кожного покрова нижних конечностей.
  3. Отрежьте от мышц нижних конечностей с помощью ножниц и тщательно вывихнуть вертлужной впадины от тазобедренного сустава, в то время как избежать нарушения бедренной кости головы.
  4. Удалите оставшиеся мышцы бедра и голени с помощью скальпеля и ножниц и отделите от бедренной кости голени в коленном суставе работы следите, чтобы не нарушить концами кости. Поместите кости в чашку Петри, содержащую ледяную RPMI 1640 1X с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина.
  5. Переходим к следующему шагу под капот культуры ткани. Принять дополнительные меры предосторожности для поддержания строгих стерильных методов, чтобы избежать neutrophiL активации.
  6. Промыть каждую кость с 70% этанола (в чашке Петри), а затем трех последующих промывок в ледяной стерильной PBS (в чашках Петри), чтобы смыть этанола с поверхности костей.
  7. Внутри чистые стерильные чашки Петри, отрезать эпифизов костей и держать их в сторону.
  8. Использование игла 25-и 12 мл шприц с RPMI с добавлением 10% FBS и 2 мМ ЭДТА, и промыть клетки костного мозга с обоих концов кости валов на 50 мл с завинчивающейся крышкой трубки сокола оснащена 100 мкм процедить. Для того чтобы эффективно удалить все клетки, очистить внутреннюю поверхность кости использованием 25-иглы.

Примечание: Бланширование костей показывает, что клетки были достаточно соскабливают.

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте примерно 10 мл среды для промывки бедра / голени пары. Добавление ЭДТА в среду важно предотвратить слипание клеток.

  1. Разрежьте эпифизов костейв небольших 0,5-1 мм 3 шт с помощью скальпеля и разбить их через 100 мкм фильтр, используя заднюю часть 2,5 мл Eppendorf Combitip Plus Biopur пипетки.
  2. Центрифуга при 1400 оборотов в минуту в течение 7 минут при 4 ° C.
  3. Лизируйте эритроцитов путем ресуспендирования осадка клеток в 20 мл 0,2% NaCl в течение приблизительно 20 сек с последующим добавлением 20 мл 1,6% NaCl. (Критический: не превышает 20-30 сек гипотонического лизиса, чтобы избежать клеток костного мозга смерти использование гипотонических NaCl для лизиса рекомендуется вместо ACK буфера лизирующие поскольку последний имеет потенциал, чтобы активировать нейтрофилы.).
  4. Центрифуга в течение 7 минут при 1400 оборотов в минуту при 4 ° С дл сбора клеток.
  5. Мытье клеток RPMI 1640 1X с добавлением 10% FBS и 2 мМ ЭДТА и центрифугируют, как в пункте 1.12.
  6. Выход клеток костного мозга с помощью этого метода составляет примерно 60-80 млн. долл. США в неинфицированных 8-12 недельных C57BL / 6 мыши.

2. Разделение нейтрофилыцентрифугированием в градиенте плотности

  1. Граф клеток костного мозга и ресуспендируют в 1 мл ледяной стерильной PBS.
  2. Добавьте 3 мл Histopaque 1119 (плотность 1,119 г / мл) в 15 мл коническую трубку.
  3. Наложение 3 мл Histopaque 1077 (плотность 1,077 г / мл) в 3 мл Histopaque 1119.

Примечание: Histopaque 1119 и 1077 Histopaque следует нагревают до 18-26 ° С перед использованием.

Важнейший шаг: Подготовка градиенты непосредственно перед использованием в качестве подготовки градиент заранее приведет к диффузии между двумя слоями и субоптимальные нейтрофилов чистотой и выходом.

Важнейший шаг: Наложение Histopaque 1077 по 1119 должно быть сделано медленно, чтобы избежать смешивания двух плотностей, которая исключает разделения клеток во время центрифугирования.

  1. Перекрытие клетки костного мозга подвески на верхней части Histopaque 1077.

Важнейший шаг: OverlАйинг клетки костного мозга надстройка над Histopaque 1077 должно быть сделано медленно, чтобы не потревожить интерфейс между клетками и Histopaque 1077.

Примечание: ресуспендирования клеток костного мозга от неинфицированных мышей в 1 мл PBS дает нейтрофилов чистоту> 90%. Однако объединение многие образцы костного мозга компрометирует нейтрофилов чистоты, например, суспендированием 300 × 10 6 клеток в 3 мл PBS нейтрофилов снижает чистоту от> 90% до ~ 80%. Таким образом, следователи должны выполнить пилотные эксперименты для определения идеального клеток / объем условия для их конкретных экспериментов

  1. Центрифуга течение 30 минут при 2000 оборотов в минуту при 25 ° С без тормоза.

Примечание: центрифугирование градиента при комнатной температуре является критическим и необходимы для эффективного разделения нейтрофилов.

  1. Собирают нейтрофилов на границе Histopaque 1119 и 1077 Histopaque слоев.
  2. Промыть собранных нейтрофилов дважды средой RPMI 1640 1X с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина и центрифуге при 1400 оборотов в минуту в течение 7 минут при 4 ° C.
  3. Подсчитайте нейтрофилов и определения их жизнеспособности.

Примечание: Нейтрофилы обычно> 95% жизнеспособных и> 90% чистоты, как определено с помощью анализа FACS. Типичный выход нейтрофилов из костного мозга (например, 2 бедра и голени 2 костей) из неинфицированных 8-12 недельной мыши C57BL / 6 составляет ~ 6-12 миллионов клеток. Это число существенно больше, когда нейтрофилы собирают из костного мозга зараженных животных. Следовательно, ~ 30-40 миллионов нейтрофилов / мышь были восстановлены, когда Candida-инфицированных мышей использовали для сбора клеток 6.

3. Маркировка нейтрофилы Использование CellTracker Красители

  1. Ресуспендируйте нейтрофилов в 5 х 10 6 клеток / мл в PBS, предварительно нагретой при 37 ° С.
  2. Добавить CellTracker красителя в конечной концентрациирацион 5 мкм.

ПРИМЕЧАНИЕ: CellTracker Зеленый (CMFDA (5-Chloromethylfluorescein Диацетат) и CellTracker Оранжевый (CMTMR (5 - (а-6)-4-амино Chloromethyl бензоила тетраметилродамина) была использована в данном протоколе к дифференциально маркировать нейтрофилов из дикого типа и генов-дефицитных мышами.

ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда Подготовка исходного раствора 10 мМ CellTracker зеленый и оранжевый CellTracker, аликвоты и хранят при температуре -80 ° C до дня эксперимента.

  1. Инкубируют нейтрофилов с 5 мкМ соответствующего красителя CellTracker течение 10 мин при 37 ° С при встряхивании на водяной бане в темноте.
  2. Мытье клетки дважды с ледяной RPMI 1640 1X с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина.

ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективная промывка клеток после маркировки шаг с CellTracker красителя необходимо, чтобы избежать красителя перекрестного загрязнения перед смешиванием дифференциально меченных популяции нейтрофилов для паденияTream конкурентоспособных исследований заселение.

4. Приемные Передача нейтрофилов у мышей и анализа передаваемой нейтрофилов с использованием проточной цитометрии

  1. Ресуспендируют нейтрофилов в охлажденном льдом PBS при концентрации 25 × 10 6 клеток / мл и вводят 200 мкл суспензии в латеральную хвостовую вену так, что 5 × 10 6 нейтрофилов передаются на мышь. Конкурентные исследования нейтрофилов заселение, смешивать дикого типа и ген-дефицитных нейтрофилов в соотношении 1:1 и вводят в общей сложности 5 × 10 6 нейтрофилов на мышь, как описано выше.

ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере, до 10 х 10 6 нейтрофилов может быть восприимчиво переданы на мышь без явного немедленного Токсичность по отношению к животным.

  1. В разное время после приемных передачи (например, 1, 2, 3 или 4 часа после передачи), усыпить мышей и урожай крови и / или костного мозга и / или другие органы-мишени (ы) интересов.
  2. Подготовьте сиngle клеточные суспензии из этих тканей для количественного и качественного анализа восприимчиво переданы помечены нейтрофилов с использованием опубликованных протоколов 6,15.
  3. После живой / мертвый окрашивания жизнеспособность и блокады Fc, этикетки клеток с CD45 (клон 30-F11), Ly6G (клон 1A8) и CD11b (клон М1/70) и ворота на живых CD45 + Ly6G CD11b + + нейтрофилов. Нейтрофилы в этом затвор включает родной нейтрофилов получателем мыши, а также восприимчиво переданы помечены нейтрофилы, которые FITC + (если помечены CellTracker зеленый) или PE + (если помечены сотовых Отслеживание оранжевый).

Примечание: Нейтрофилы могут быть отслежены в крови, костного мозга и почек Candida-инфицированных мышей в течение 4 ч после перевода.

Примечание: Фиксация 2% параформальдегидом в PBS, не оказывает отрицательного влияния средней интенсивности флуоресценции нейтрофилов помечен CellTracker Grееп или CellTracker оранжевой течение как минимум 48 часов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол оптимизирован для сбора клеток костного мозга у мышей и последующее разделение нейтрофилов из этих клеток центрифугированием в градиенте плотности с использованием коммерчески доступных Histopaque раздела сред клетки. Нейтрофилы выделяли, используя этот метод может быть использован для различных функциональных вниз по течению естественных бывший исследований и экспериментов для приемных передачи в получатель мышей.

Типичный выход сбора клеток костного мозга из бедренно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы приводим надежный, простой, быстрый и экономичный протокол для выделения большого количества нейтрофилов из костного мозга мышей с высокой чистотой и выживаемость с помощью центрифугирования в градиенте плотности подхода. Когда этот протокол выполняется правильно, ~ 6-12 × 10 6 нейтрофилов может быть извлечен из неинфицированных мыши и целых ~ 30-40 × 10 6 нейтрофилов может быть выделен из мышей после заражения 6. Выделенную нейтрофилы 80-95% чистого и> 95% жизнеспособность. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие интересы.

Благодарности

Эта работа была поддержана отделом очной исследований Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID), Национального института здоровья (NIH), США.

Все Мышей содержали в американской ассоциации по аккредитации лабораторий Animal Care аккредитованных вивария при Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) и размещены в соответствии с процедурами, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных под эгидой протоколом, утвержденным уходу и использованию животных комитета NIAID.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
 <сильно>Реагенты
RPMI 1640 1X с L-глутамином и 25 мМ HEPESCellgro10-041-CV 
Фетальная бычья сыворотка (инактивированная при нагревании)GemCell100500 
Пенициллин/стрептомицин (10 000 единиц пенициллина / 10 000 мг/мл стрептококка)GIBCO15140 
0,5 м ЭДТАQuality Biological Inc351-027-101 
0,2% и 1,6% натрия хлоридJT Baker3624Растворы хлорида натрия приготовленные с использованием дистиллированной воды и стерильно отфильтрованные
Стерильные фильтрованные Histopaque 1077Sigma10771Histopaque 1077 необходимо довести до 18-26 градусов; C перед применением
Стерильный фильтрованный Histopaque 1119 Sigma11191Histopaque 1119 нужно довести до 18-26 градусов; C перед применением
Фосфатно-солевой буфер (PBS) без кальция и магнияCellgro210-40-CV 
Этиловый спирт (200 проба)The Warner Graham Company64-17-5 
CellTracker Green (CMFDA, 5-хлорметилфлуоресцеин диацетат)InvitrogenC-7025Делайте стоковые растворы по 10 мМ в ДМСО, аликвоте и храните при -80 °°; C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(и 6)-4-хлорметилбензоил амино тетраметилродамин)InvitrogenC-2927Сделайте стоковые растворы по 10 мМ в ДМСО, аликвоте и храните при -80 °°; C
Антимышиный CD45 (клон 30-F11)eBioscience170451-82 
Антимышиный Ly6G (Клон 1A8)BD Pharmingen551461 
Антимышиный Ly6G (Клон 1A8)BD Pharmingen560599 
Антимышиный CD11b (клон M1/70)eBioscience47-0112-82 
Антимышиный CD16/CD32 (мышиный блок BD Fc)BD Pharmingen553141Использование при разведении 1:100
LIVE/DEAD Фиксируемый набор для окрашивания синими мертвыми клеткамиМолекулярные зондыL-23105Использование при разведении 1:1000
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma67-68-5 
Раствор параформальдегида, 4% в PBSUSB Corporation19943 
 Таблица 1. Реагенты для выделения, мечения и слежения за адоптивно перенесенными нейтрофилами.
 Materials
C57BL/6 мышейTaconic 
Центрифужные пробирки 15 млCorning430053 
Центрифужные пробирки 50 млBD Falcon352070 
Серологические пипетки 25 млCelltreat229225B 
Серологические пипетки 10 млCelltreat229210B 
Серологические пипетки 5 млCelltreat229205B 
Пастеровские пипетки (3 мл)BD Falcon357575 
Шприцы 12 млKendall monoject512878 
25 г x 5/8 дюйма Иглы (прецизионные скользящие иглы)BD305122 
Сетчатые фильтры 100 ммBD Falcon352360 
Бактерицидные чашки ПетриBD Falcon351029 
Combitips Plus BiopurEppendorf2249608-5 
Инструменты для препарирования мышей (ножницы, щипцы, скальпель)Инструменты для биомедицинских исследований10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000Инструменты стерилизованы перед использованием
;Equipment
Tissue Culture hoodThe Baker CompanySG403 
Охлаждаемая центрифугаThermo Fischer Scientific75004521 
37 ° C встряхивающая водяная баняThermo Fischer Scientific3166721 
 <сильный>Таблица 2. Список материалов и оборудования, используемых в данном протоколе.

Ссылки

  1. Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
  2. Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22, 891-928 (2004).
  3. Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu. Rev. Immunol. 30, 459-489 (2012).
  4. Blomgran, R., Ernst, J. D. Lung neutrophils facilitate activation of naive antigen-specific CD4+ T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. J. Immunol. 186 (12), 7110-7119 (2011).
  5. Narasaraju, T., Yang, E., et al. Excessive neutrophils and neutrophil extracellular traps contribute to acute lung injury of influenza pneumonitis. Am. J. Pathol. 179 (1), 199-210 (2011).
  6. Lionakis, M. S., Fischer, B. G., et al. Chemokine receptor Ccr1 drives neutrophil-mediated kidney immunopathology and mortality in invasive candidiasis. PLoS Pathog. 8 (8), (2012).
  7. Cascão, R., Rosário, H. S., Souto-Carneiro, M. M., Fonseca, J. E. Neutrophils in rheumatoid arthritis: More than simple final effectors. Autoimmun. Rev. 9 (8), 531-535 (2010).
  8. Denny, M. F., Yalavarthi, S., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J. Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  9. Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
  10. Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am. J. Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
  11. Hasenberg, M., Köhler, A., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314(2011).
  12. Gao, J. L., Lee, E. J., Murphy, P. M. Impaired antibacterial host defense in mice lacking the N-formylpeptide receptor. J. Exp. Med. 189 (4), 657-662 (1999).
  13. Pruijt, J. F., Verzaal, P., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (9), 6228-6233 (2002).
  14. Eash, K. J., Greenbaum, A. M., Gopalan, P. K., Link, D. C. CXCR2 and CXCR4 antagonistically regulate neutrophil trafficking from murine bone marrow. J. Clin. Invest. 120 (7), 2423-2431 (2010).
  15. Lionakis, M. S., Lim, J. K., Lee, C. C., Murphy, P. M. Organ-specific innate immune responses in a mouse model of invasive candidiasis. J. Innate. Immun. 3 (2), 180-199 (2011).
  16. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourié, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nüsse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J. Leukoc. Biol. 75 (4), 604-611 (2004).
  17. Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J. Exp. Med. 203 (4), 829-835 (2006).
  18. Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. J. Immunol. Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).
  19. Tosello Boari, J., Amezcua Vesely, M. C., et al. IL-17RA signaling reduces inflammation and mortality during Trypanosoma cruzi infection by recruiting suppressive IL-10-producing neutrophils. PLoS Pathog. 8 (4), e1002658(2012).
  20. Hattori, H., Subramanian, K. K., et al. Small-molecule screen identifies reactive oxygen species as key regulators of neutrophil chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (8), 3546-3351 (2010).
  21. Wan, W., Lionakis, M. S., Liu, Q., Roffê, E., Murphy, P. M. Genetic Deletion of Chemokine Receptor Ccr7 Exacerbates Atherogenesis in ApoE-deficient Mice. Cardiovasc. Res. 97 (3), 580-588 (2013).
  22. Ueda, Y., Kondo, M., Kelsoe, G. Inflammation and the reciprocal production of granulocytes and lymphocytes in bone marrow. J. Exp. Med. 201 (11), 1771-1780 (2005).
  23. Berkow, R. L., Dodson, R. W. Purification and functional evaluation of mature neutrophils from human bone marrow. Blood. 68 (4), 853-860 (1986).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Cell TrackerHistopaque

Похожие статьи