Методическая статья

Выделение, очистка и маркировки Мышь нейтрофилов костного мозга для функциональных исследований и приемных Эксперименты Трансфер

DOI:

10.3791/50586

⸱

10 июля 2013 г.

 , 
1Fungal Pathogenesis Unit, Laboratory of Clinical Infectious Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы опишем протокол для выделения и очистки нейтрофилов из костного мозга мыши центрифугированием в градиенте плотности и нейтрофилов мечение с применением CellTracker красителей. Это представляет собой простой, быстрый, воспроизводимые и экономичный способ получения большого количества нейтрофилов для последующих функциональных исследований или экспериментов приемных передачи и отслеживания.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейтрофилы являются критическими эффекторные клетки врожденной иммунной системы. Они быстро набраны на участках острое воспаление и оказывают защитное или патогенных эффектов в зависимости от воспалительной среде. Тем не менее, несмотря на незаменимую роль нейтрофилов в иммунитете, детальное понимание молекулярных факторов, которые обеспечивают нейтрофилов и эффекторные immunopathogenic эффектов в различных инфекционных заболеваний и воспалительных заболеваний по-прежнему отсутствует, отчасти потому, что их короткий период полураспада, трудности с обработкой этих клеток и отсутствием надежных экспериментальных протоколов для получения достаточного количества нейтрофилов ниже по течению функциональных исследований и экспериментов приемных передачи. Таким образом, простой, быстрый, экономичный и надежный методы являются очень желательными для сбора достаточного количества нейтрофилов мыши для оценки функции, такие как фагоцитоз, убийства, продукция цитокинов, дегрануляцию и торговли людьми. С этой целью,Мы представляем воспроизводимый центрифугирования в градиенте плотности на основе протокола, который может быть адаптирован в любой лаборатории изолировать большое количество нейтрофилов из костного мозга мышей с высокой степенью чистоты и жизнеспособности. Кроме того, предложен простой протокол, который использует CellTracker красителей для обозначения изолированных нейтрофилов, которые затем могут быть адаптивно переносили в мышей-реципиентов и отслеживаться в некоторых тканях, по крайней мере, 4 ч после передачи с использованием проточной цитометрии. Используя этот подход, дифференциальные маркировки нейтрофилов из дикого типа и генов-дефицитных мышей с различными красителями CellTracker может быть успешно использован для выполнения конкурентоспособных исследований репопуляцию для оценки непосредственную роль определенных генов в торговле нейтрофилов из крови в ткани-мишени в естественных условиях .

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов у людей. Они являются основным клеточным компонентом врожденной иммунной системы и выступают в качестве первой линии защиты от вторжения микроорганизмов. Пациенты с приобретенными нейтропения и первичных иммунодефицитов, которые влияют нейтрофилов номера и / или функции развиваются угрожающие жизни инвазивных бактериальных и грибковых инфекций, подчеркнув важность этих клеток в иммунной защиты 1. Иммунный признание вторжения патогенных микроорганизмов на инфекцию сайта, их родственными распознавания рецепторами приводит к индукции организованной врожденный иммунный ответ, что приводит к секреции хем....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выделение клеток костного мозга мыши

  1. Усыпить мышей с использованием уход за животными учреждения Комитета, утвержденных протоколом и распылить животного поверхность с 70% этанола.
  2. Сделайте надрез кожи в середине живота и удалить кожу от дистальной части мыши в том числе кожного покрова нижних конечностей.
  3. Отрежьте от мышц нижних конечностей с помощью ножниц и тщательно вывихнуть вертлужной впадины от тазобедренного сустава, в то время как избежать нарушения бедренной кости головы.
  4. Удалите оставшиеся мышцы бедра и голени с помощью скальпеля и ножниц и отделите от бедренной кости голени в коленном суставе работы следите, чтоб....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол оптимизирован для сбора клеток костного мозга у мышей и последующее разделение нейтрофилов из этих клеток центрифугированием в градиенте плотности с использованием коммерчески доступных Histopaque раздела сред клетки. Нейтрофилы выделяли, используя этот метод может быть использован для различных функциональных вниз по течению естественных бывший исследований и экспериментов для приемных передачи в получатель мышей.

Типичный выход сбора клеток костного мозга из бедренно.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы приводим надежный, простой, быстрый и экономичный протокол для выделения большого количества нейтрофилов из костного мозга мышей с высокой чистотой и выживаемость с помощью центрифугирования в градиенте плотности подхода. Когда этот протокол выполняется правильно, ~ 6-12 × 10 6 нейтрофилов может быть извлечен из неинфицированных мыши и целых ~ 30-40 × 10 6 нейтрофилов может быть выделен из мышей после заражения 6. Выделенную нейтрофилы 80-95% чистого и> 95% жизнеспособность. .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие интересы.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана отделом очной исследований Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID), Национального института здоровья (NIH), США.

Все Мышей содержали в американской ассоциации по аккредитации лабораторий Animal Care аккредитованных вивария при Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) и размещены в соответствии с процедурами, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных под эгидой протоколом, утвержденным уходу и использованию животных комитета NIAID.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
 <сильно>Реагенты
RPMI 1640 1X с L-глутамином и 25 мМ HEPESCellgro10-041-CV 
Фетальная бычья сыворотка (инактивированная при нагревании)GemCell100500 
Пенициллин/стрептомицин (10 000 единиц пенициллина / 10 000 мг/мл стрептококка)GIBCO15140 
0,5 м ЭДТАQuality Biological Inc351-027-101 
0,2% и 1,6% натрия хлоридJT Baker3624Растворы хлорида натрия приготовленные с использованием дистиллированной воды и стерильно отфильтрованные
Стерильные фильтрованные Histopaque 1077Sigma10771Histopaque 1077 необходимо довести до 18-26 градусов; C перед применением
Стерильный фильтрованный Histopaque 1119 Sigma11191Histopaque 1119 нужно довести до 18-26 градусов; C перед применением
Фосфатно-солевой буфер (PBS) без кальция и магнияCellgro210-40-CV 
Этиловый спирт (200 проба)The Warner Graham Company64-17-5 
CellTracker Green (CMFDA, 5-хлорметилфлуоресцеин диацетат)InvitrogenC-7025Делайте стоковые растворы по 10 мМ в ДМСО, аликвоте и храните при -80 °°; C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(и 6)-4-хлорметилбензоил амино тетраметилродамин)InvitrogenC-2927Сделайте стоковые растворы по 10 мМ в ДМСО, аликвоте и храните при -80 °°; C
Антимышиный CD45 (клон 30-F11)eBioscience170451-82 
Антимышиный Ly6G (Клон 1A8)BD Pharmingen551461 
Антимышиный Ly6G (Клон 1A8)BD Pharmingen560599 
Антимышиный CD11b (клон M1/70)eBioscience47-0112-82 
Антимышиный CD16/CD32 (мышиный блок BD Fc)BD Pharmingen553141Использование при разведении 1:100
LIVE/DEAD Фиксируемый набор для окрашивания синими мертвыми клеткамиМолекулярные зондыL-23105Использование при разведении 1:1000
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma67-68-5 
Раствор параформальдегида, 4% в PBSUSB Corporation19943 
 Таблица 1. Реагенты для выделения, мечения и слежения за адоптивно перенесенными нейтрофилами.
 Materials
C57BL/6 мышейTaconic 
Центрифужные пробирки 15 млCorning430053 
Центрифужные пробирки 50 млBD Falcon352070 
Серологические пипетки 25 млCelltreat229225B 
Серологические пипетки 10 млCelltreat229210B 
Серологические пипетки 5 млCelltreat229205B 
Пастеровские пипетки (3 мл)BD Falcon357575 
Шприцы 12 млKendall monoject512878 
25 г x 5/8 дюйма Иглы (прецизионные скользящие иглы)BD305122 
Сетчатые фильтры 100 ммBD Falcon352360 
Бактерицидные чашки ПетриBD Falcon351029 
Combitips Plus BiopurEppendorf2249608-5 
Инструменты для препарирования мышей (ножницы, щипцы, скальпель)Инструменты для биомедицинских исследований10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000Инструменты стерилизованы перед использованием
;Equipment
Tissue Culture hoodThe Baker CompanySG403 
Охлаждаемая центрифугаThermo Fischer Scientific75004521 
37 ° C встряхивающая водяная баняThermo Fischer Scientific3166721 
 <сильный>Таблица 2. Список материалов и оборудования, используемых в данном протоколе.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
  2. Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Cell TrackerHistopaque

Похожие статьи