Мы опишем протокол для выделения и очистки нейтрофилов из костного мозга мыши центрифугированием в градиенте плотности и нейтрофилов мечение с применением CellTracker красителей. Это представляет собой простой, быстрый, воспроизводимые и экономичный способ получения большого количества нейтрофилов для последующих функциональных исследований или экспериментов приемных передачи и отслеживания.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение, очистка и маркировки Мышь нейтрофилов костного мозга для функциональных исследований и приемных Эксперименты Трансфер
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нейтрофилы являются критическими эффекторные клетки врожденной иммунной системы. Они быстро набраны на участках острое воспаление и оказывают защитное или патогенных эффектов в зависимости от воспалительной среде. Тем не менее, несмотря на незаменимую роль нейтрофилов в иммунитете, детальное понимание молекулярных факторов, которые обеспечивают нейтрофилов и эффекторные immunopathogenic эффектов в различных инфекционных заболеваний и воспалительных заболеваний по-прежнему отсутствует, отчасти потому, что их короткий период полураспада, трудности с обработкой этих клеток и отсутствием надежных экспериментальных протоколов для получения достаточного количества нейтрофилов ниже по течению функциональных исследований и экспериментов приемных передачи. Таким образом, простой, быстрый, экономичный и надежный методы являются очень желательными для сбора достаточного количества нейтрофилов мыши для оценки функции, такие как фагоцитоз, убийства, продукция цитокинов, дегрануляцию и торговли людьми. С этой целью,Мы представляем воспроизводимый центрифугирования в градиенте плотности на основе протокола, который может быть адаптирован в любой лаборатории изолировать большое количество нейтрофилов из костного мозга мышей с высокой степенью чистоты и жизнеспособности. Кроме того, предложен простой протокол, который использует CellTracker красителей для обозначения изолированных нейтрофилов, которые затем могут быть адаптивно переносили в мышей-реципиентов и отслеживаться в некоторых тканях, по крайней мере, 4 ч после передачи с использованием проточной цитометрии. Используя этот подход, дифференциальные маркировки нейтрофилов из дикого типа и генов-дефицитных мышей с различными красителями CellTracker может быть успешно использован для выполнения конкурентоспособных исследований репопуляцию для оценки непосредственную роль определенных генов в торговле нейтрофилов из крови в ткани-мишени в естественных условиях .
Введение
Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитов у людей. Они являются основным клеточным компонентом врожденной иммунной системы и выступают в качестве первой линии защиты от вторжения микроорганизмов. Пациенты с приобретенными нейтропения и первичных иммунодефицитов, которые влияют нейтрофилов номера и / или функции развиваются угрожающие жизни инвазивных бактериальных и грибковых инфекций, подчеркнув важность этих клеток в иммунной защиты 1. Иммунный признание вторжения патогенных микроорганизмов на инфекцию сайта, их родственными распознавания рецепторами приводит к индукции организованной врожденный иммунный ответ, что приводит к секреции хем....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Выделение клеток костного мозга мыши
- Усыпить мышей с использованием уход за животными учреждения Комитета, утвержденных протоколом и распылить животного поверхность с 70% этанола.
- Сделайте надрез кожи в середине живота и удалить кожу от дистальной части мыши в том числе кожного покрова нижних конечностей.
- Отрежьте от мышц нижних конечностей с помощью ножниц и тщательно вывихнуть вертлужной впадины от тазобедренного сустава, в то время как избежать нарушения бедренной кости головы.
- Удалите оставшиеся мышцы бедра и голени с помощью скальпеля и ножниц и отделите от бедренной кости голени в коленном суставе работы следите, чтоб....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Этот протокол оптимизирован для сбора клеток костного мозга у мышей и последующее разделение нейтрофилов из этих клеток центрифугированием в градиенте плотности с использованием коммерчески доступных Histopaque раздела сред клетки. Нейтрофилы выделяли, используя этот метод может быть использован для различных функциональных вниз по течению естественных бывший исследований и экспериментов для приемных передачи в получатель мышей.
Типичный выход сбора клеток костного мозга из бедренно.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы приводим надежный, простой, быстрый и экономичный протокол для выделения большого количества нейтрофилов из костного мозга мышей с высокой чистотой и выживаемость с помощью центрифугирования в градиенте плотности подхода. Когда этот протокол выполняется правильно, ~ 6-12 × 10 6 нейтрофилов может быть извлечен из неинфицированных мыши и целых ~ 30-40 × 10 6 нейтрофилов может быть выделен из мышей после заражения 6. Выделенную нейтрофилы 80-95% чистого и> 95% жизнеспособность. .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие интересы.
Благодарности
Эта работа была поддержана отделом очной исследований Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID), Национального института здоровья (NIH), США.
Все Мышей содержали в американской ассоциации по аккредитации лабораторий Animal Care аккредитованных вивария при Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) и размещены в соответствии с процедурами, изложенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных под эгидой протоколом, утвержденным уходу и использованию животных комитета NIAID.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <сильно>Реагенты | |||
| RPMI 1640 1X с L-глутамином и 25 мМ HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Фетальная бычья сыворотка (инактивированная при нагревании) | GemCell | 100500 | |
| Пенициллин/стрептомицин (10 000 единиц пенициллина / 10 000 мг/мл стрептококка) | GIBCO | 15140 | |
| 0,5 м ЭДТА | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0,2% и 1,6% натрия хлорид | JT Baker | 3624 | Растворы хлорида натрия приготовленные с использованием дистиллированной воды и стерильно отфильтрованные |
| Стерильные фильтрованные Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 необходимо довести до 18-26 градусов; C перед применением |
| Стерильный фильтрованный Histopaque 1119 Sigma | 11191 | Histopaque 1119 нужно довести до 18-26 градусов; C перед применением | |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) без кальция и магния | Cellgro | 210-40-CV | |
| Этиловый спирт (200 проба) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-хлорметилфлуоресцеин диацетат) | Invitrogen | C-7025 | Делайте стоковые растворы по 10 мМ в ДМСО, аликвоте и храните при -80 °°; C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(и 6)-4-хлорметилбензоил амино тетраметилродамин) | Invitrogen | C-2927 | Сделайте стоковые растворы по 10 мМ в ДМСО, аликвоте и храните при -80 °°; C |
| Антимышиный CD45 (клон 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Антимышиный Ly6G (Клон 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Антимышиный Ly6G (Клон 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Антимышиный CD11b (клон M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Антимышиный CD16/CD32 (мышиный блок BD Fc) | BD Pharmingen | 553141 | Использование при разведении 1:100 |
| LIVE/DEAD Фиксируемый набор для окрашивания синими мертвыми клетками | Молекулярные зонды | L-23105 | Использование при разведении 1:1000 |
| Диметилсульфоксид (ДМСО) | Sigma | 67-68-5 | |
| Раствор параформальдегида, 4% в PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Таблица 1. Реагенты для выделения, мечения и слежения за адоптивно перенесенными нейтрофилами. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 мышей | Taconic | ||
| Центрифужные пробирки 15 мл | Corning | 430053 | |
| Центрифужные пробирки 50 мл | BD Falcon | 352070 | |
| Серологические пипетки 25 мл | Celltreat | 229225B | |
| Серологические пипетки 10 мл | Celltreat | 229210B | |
| Серологические пипетки 5 мл | Celltreat | 229205B | |
| Пастеровские пипетки (3 мл) | BD Falcon | 357575 | |
| Шприцы 12 мл | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 г x 5/8 дюйма Иглы (прецизионные скользящие иглы) | BD | 305122 | |
| Сетчатые фильтры 100 мм | BD Falcon | 352360 | |
| Бактерицидные чашки Петри | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Инструменты для препарирования мышей (ножницы, щипцы, скальпель) | Инструменты для биомедицинских исследований | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Инструменты стерилизованы перед использованием |
| ; | Equipment | ||
| Tissue Culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Охлаждаемая центрифуга | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 ° C встряхивающая водяная баня | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| <сильный>Таблица 2. Список материалов и оборудования, используемых в данном протоколе. |
Ссылки
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M. E., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann. Intern. Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- Rot, A., von Andrian, U. H. Chemokines in innate and adaptive host defense: basic chemokinese grammar for immune cells. Annu. Rev. Immunol. 22
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
